مجله دانشگاه علوم پزشکی قم

مقدمه
آکانتاموبا (Acanthamoeba)، در محیط‌های مختلف (آب، خاک، هوا) و در سرتاسرکره زمین یافت می‌شود. کیست‌های این آمیب در مقابل خشکی مقاوم بوده و شانس تلقیح این کیست‌ها در سطوح مخاطی زیاد است. آکانتاموبا می‌تواند عامل عفونت مزمن سیستم اعصاب مرکزی به‌نام انسفالیت آمیبی گرانولوماتوز (Granulomatous amoebic encephalitis) و عفونت خطرناک چشمی به‌نام کراتیت آکانتاموبایی (Acanthamoeba keratitis) باشد. از دیگر عفونت‌های ایجاد‌شده به‌وسیله آکانتاموبا می‌توان به عفونت گرانولومای مزمن پوست و سایر بافت‌ها، تهاجم به استخوان و متعاقباً استئومیلیت اشاره کرد.
آمیب‌ها به‌وسیله جریان خون و عمدتاً از طریق دستگاه تنفسی تحتانی یا زخم‌های پوستی یا مخاطی به مغز می‌رسند. این بیماری غالباً مزمن و دارای یک سیر طولانی بوده که عمدتاً در افراد ناتوان یا دچار ضعف ایمنی دیده می‌شود و درمقابل، کراتیت افراد سالم را نیز درگیر می‌کند. افزایش شدید موارد بیماری از سال 1985، با استفاده از لنزهای تماسی، به‌ویژه لنزهای نرم، مرتبط دانسته شده است (1،2). آکانتاموبا می‌تواند طیف گسترده‌ای از اسمولاریته، دما، شوری و PH را تحمل کند؛ بنابراین قادر است در آب مقطر، کشت بافت و مایعات بدن پستانداران زنده بماند (3).
تاکنون هیچ عامل شیمیایی به‌عنوان تنها درمان مؤثر علیه کراتیت آکانتاموبایی شرح داده نشده است. فاکتورهای زیادی، ازجمله طیف وسیعی از ویرولانس در ایزوله‌های مختلف باعث می‌گردد تا ایجاد رابطه بین فعالیت in vitro و in vivo غیرممکن شود (4). در حال حاضر، بیگوانیدهایی نظیر پلی‌هگزامتیلین بیگوانید، از منابع موضعی مؤثر علیه تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتاموبا شناخته شده‌اند (5،6)، که در غلظت‌های پایین نیز مؤثرند (02/0%)، اما برای سلول‌های قرنیه انسان سمّی هستند (7). داروی کلروهگزیدین علیه هر دو شکل آمیب مؤثر بوده و در حداقل غلظت برای سلول‌های اپی‌تلیال قرنیه سمّی نیست (5،8،9). اثرهای جانبی داروهای شیمیایی، الزامات زیست‌محیطی و گرایش به‌سوی فرآورده‌های طبیعی سبب شده است تا به‌ویژه در دهه اخیر، استفاده از گیاهان دارویی درکشورهای پیشرفته افزایش یابد (10،11). از گیاه اسپند در طب سنتی به‌عنوان ماده‌ای خواب‌آور، تعریق‌آور، ضدانگل، قائده‌آور، سقط‌کننده جنین، ضدسرطان، ضدباکتری، محرک سیستم عصبی و بازدارنده آنزیم مونوآمینواکسیداز استفاده می‌شود (12،13). ترکیبات آلکالوئیدی دانه اسپند، روند تولید نوروترانسیمترهای دوپامین و سروتونین را به‌صورت وابسته به دوز تحریک می‌کنند (14،15).
Levchenko از اولین کسانی بود که اثر درمانی اسپند را بر تیلریوز گاوی ارزیابی کرد (16). اثرات ضدانگلی عصاره اسپند بر روی سایر انگل‌ها نیز بررسی شده است. متولی‌حقی و همکاران، اثر عصاره الکلی اسپند بر روی پلاسمودیوم برگئی در موش سفید کوچک آزمایشگاهی و خوش‌زبان و همکاران، تأثیر پگانوم هارمالا را بر توکسوپلاسموزیس حاد، مورد بررسی قرار دادند (17،18).
دیبا و همکاران در مطالعه خود به بررسی میزان مهارکنندگی عصاره الکلی دانه گیاه اسپند بر روی گونه‌های کاندیدا و آسپرژیلوس در شرایط آزمایشگاهی پرداختند (19). در مطالعه‌ای دیگر فروزنده و همکاران، با بررسی اثر ضد‌سرطانی عصاره هیدروالکلی دانه گیاه اسپند بر روی سلول‌های کارسینومای اپی‌تلیال گردن رحم انسان نشان دادند عصاره اسپند با اثر وابسته به دوز و زمانبر سلول‌های سرطانی HeLa می‌تواند باعث مهار رشد این سلول‌ها شود (20). در این پژوهش با توجه به ویژگی‌هایی که عنوان شد، اثر غلظت‌های مختلف عصاره آبی دانه اسپند بر روی تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتاموبا در شرایط آزمایشگاهی در سه زمان 24، 48 و 72 ساعت بررسی گردید.
 
روش بررسی
در این مطالعه تجربی، نمونه مورد استفاده از یک بیمار مبتلا به کراتیت آکانتاموبایی جدا و در محیط کشت NNA همراه با باکتری اشرشیاکلی، (به‌عنوان منبع تغذیه) کشت داده شد و در دمای 26 درجه سانتیگراد به مدت 72 ساعت انکوبه گردید. پس از استخراج DNA، تکثیر ژن 18S rRNA با استفاده از روش PCR انجام گرفت که نمونه مثبت بود و نتایج تعیین توالی و BLAST search نشان داد ژنوتایپ نمونه، T4 می‌باشد (BankIt1899920 seq5 KU877552)، این ژنوتایپ مسئول ایجاد بیش از 90% از موارد کراتیت آکانتاموبایی است (4).
همانند مطالعات پیشین (21)، آکانتاموبا روی پلیت‌های کشت NNA همراه با باکتری اشرشیاکلی در 26 درجه سانتیگراد کشت داده شد. پلیت‌ها‌ی حاوی تروفوزوئیت‌ها، 96-72 ساعت بعد، با محلول سالین استریل دوبار شست‌وشو داده شدند، سپس (در سرعت 1500 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه) 2 بار سانتریفوژ شدند. همچنین پلیت‌های حاوی کیست‌ها نیز 3 هفته بعد، با محلول سالین استریل شست‌وشو داده شدند، سپس (در سرعت 2000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه) 2 بار سانتریفوژ شدند. تعداد تروفوزوئیت‌ها و کیست‌ها با تریپان بلو (Trypan blue) و شمارش مستقیم تروفوزوئیت بر روی لام نئوبار تعیین گردید. غلطت نهایی، 10⁴×15 تروفوزوئیت یا کیست برمیلی‌لیتر بود و تروفوزوئیت‌ها و کیست‌ها بلافاصله در آزمایش مورد استفاده قرار گرفتند (22).
تحت نظارت کارشناس دانشکده داروسازی دانشگاه شهید بهشتی، اسپند خریداری شد و کد هرباریومی آن 1179 بود. مقدار 50 گرم از دانه اسپند آسیاب و در یک بشر ریخته شد، بعد از افزودن 200 میلی‌لیتر آب روی آن، 60-30 دقیقه روی حرارت بسیار ملایم قرار گرفت و پس از جوشیدن (بعد از 5 دقیقه) به‌وسیله کاغذ صافی، صاف گردید، سپس مایع صاف‌شده در بن ماری 70-60 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا حالت عسلی پیدا کند (23). در ادامه، عصاره به‌دست‌آمده درون ظرف‌های مسطح بزرگ (جهت خشک‌شدن) ریخته شد و در انکوباتور قرار گرفت. در نهایت، عصاره خشک حاصل تا زمان استفاده در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. در مرحله بعد، 20 میلی‌گرم عصاره خشک در 10 میکرولیتر DMSO حل و با آب مقطر به حجم 1 میلی‌لیتر رسید و غلظت‌های 25/1، 5/2، 5 و 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از عصاره تهیه گردید.
تحت شرایط استریل و زیر هود، به هر میکروتیوپ 5/1 میلی‌لیتری، مقدار 100 میکرولیتر سوسپانسیون تروفوزوئیت یا کیست حاوی تعداد 10⁴×15 انگل آکانتاموبا که از محیط NNA به دست آمده بود، اضافه گردید، سپس مقدار 100 میکرولیتر از عصاره آبی اسپند در غلظت‌های 20، 10، 5 و 5/2 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر، به میکروتیوپ‌های حاوی انگل اضافه شد. درادامه، میکروتیوپ‌ها به انکوباتور 30 درجه سانتیگراد منتقل شدند. آزمایش‌ها به‌صورت 3 بار تکرار صورت گرفت. تأثیر عصاره‌ها بر تروفوزوئیت یا کیست انگل آکانتاموبا در سه زمان 24، 48 و 72 ساعت ارزیابی گردید. تمامی آزمایش‌ها شامل یک کنترل مثبت (انگل و قطره پلی‌هگزاناید 02/0%) و یک کنترل منفی (سوسپانسیون تروفوزوئیت یا کیست و آب مقطر استریل حاوی DMSO 1%) بود. دلیل استفاده از قطره پلی‌هگزاناید 02/0% به‌عنوان کنترل مثبت فقط جهت مقایسه تأثیر داروی شیمیایی پلی‌هگزاناید 02/0% با عصاره آبی اسپند بود.
انگل و غلظت‌های مختلف عصاره در 30 درجه سانتیگراد در مجاورت هم قرار داده شدند و پس از طی دوره زمانی 24، 48 و 72 ساعت، 20 میکرولیتر از محلول آزمایش با همان حجم از محلول تریپان بلو مخلوط و در دمای اتاق به مدت 3 دقیقه انکوبه گردید و شمارش با لام نئوبار صورت گرفت (پس از رنگ‌آمیزی، انگل‌های زنده فاقد رنگ بوده، ولی غیرزنده‌ها رنگ می‌گیرند).
داده‌های حاصل از تأثیر عصاره‌ها بر انگل، با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 18، آزمون مقایسه سه یا چند گروه وابسته (اندازه‌گیری‌های تکراری یا Repeated Measures)، همچنین آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه (جهت تعیین درصد معنی‌داری)، آزمون کولموگروف- اسمیرنوف یک‌نمونه‌ای (برای بررسی فرض نرمال بودن متغیرهای مورد مطالعه) تجزیه و تحلیل شدند. سطح معنی‌داری، 05/0 در نظر گرفته شد.
 
یافته‌ها
برای بررسی اثربخشی عصاره آبی اسپند بر تروفوزوئیت‌های آکانتاموبا، غلظت‌های 25/1، 5/2، 5 و 10 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر از عصاره تهیه و بعد از 24، 48 و 72 ساعت از تأثیر عصاره آبی اسپند بر تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتاموبا، با استفاده از رنگ حیاتی تریپان‌بلو، تعداد تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های زنده در مقایسه با گروه کنترل شمارش شدند. تعداد تروفوزوئیت‌های زنده آکانتاموبا در غلظت 10 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر و زمان 72 ساعت به 47/32% رسید، اما در غلظت 10 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر در زمان 24 و 48 ساعت، تعداد تروفوزوئیت‌های زنده آکانتاموبا به ترتیب 78/43 و 21/36% بود. اثر افزایش زمان و غلظت عصاره آبی اسپند بر کاهش تروفوزوئیت‌های زنده آکانتاموبا، معنی‌دار (05/0≤ p) بود. درصد کیست‌های زنده بعد از 24 ساعت در بالاترین غلظت عصاره (غلظت 10 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر) به 45/67% و بعد از 48 ساعت به 34/64% و بعد از 72 ساعت به 15/50% رسید. کاهش کیست‌های زنده آکانتاموبا با افزایش زمان و غلظت عصاره آبی اسپند، معنی‌دار (05/0p≤) بود. درصد تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های زنده آکانتاموبا،72 ساعت بعد از تأثیر قطره پلی‌هگزاناید 01/0% به ترتیب به صفر و 71/23% رسید. از MTT جهت تأیید نتایج استفاده گردید که نتایج حاصل از MTT نیز داده‌های فوق را تأیید کرد (جدول).
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
جدول: درصد زنده ماندن تروفوزوتیت‌ها وکیست‌های آکانتاموبا پس از تأثیر قطره پلی‌هگزاناید و غلظت‌های مختلف عصاره آبی اسپند

زمان آزمایش 24 ساعت 48 ساعت 72 ساعت			تأثیر روی	دوز
47/32±83/6 15/50±99/8	21/36±42/9 35/64±09/0	78/43±80/8 45/67±63/3	تروفوزوئیت کیست	10 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر
04/49±60/8 93/63±17/0	89/55±55/3 87/70±33/6	98/56±32/6 56/78±96/6	تروفوزوئیت کیست	5 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر
10/71±70/7 83/69±65/7	04/79±29/7 18/86±43/6	21/82±69/7 52/86±96/6	تروفوزوئیت کیست	2.5 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر
88/78±62/7 52/74±07/2	85/92±14/7 77/97±85/3	77/97±85/3 100±0	تروفوزوئیت کیست	1.25 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر
00/00 71/23±67/2	67/35±20/6 37/52±30/5	04/69±12/4 52/79±82/0	تروفوزوئیت کیست	کنترل مثبت (قطره پلی‌هگزاناید)
100±0 100±0	100±0 100±0	100±0 100±0	تروفوزوئیت کیست	کنترل منفی

داده‌ها حاصل میانگین حداقل سه تکرار مستقل می‌باشند.
 
مقدار LD₅₀، بعد از 24، 48 و 72 ساعت با استفاده از نرم‌افزار پریسم نسخه 5 (Graphpad prism 5) محاسبه گردید. براساس نتایج حاصله، مقدار LD₅₀ عصاره آبی اسپند، 24، 48 و 72 ساعت بعد از تأثیر بر تروفوزوئیت‌های آکانتاموبا به ترتیب 635/8، 978/7 و 187/6 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر بود؛ درحالی‌که مقدار LD₅₀ عصاره آبی اسپند، 24، 48 و 72 ساعت بعد از تأثیر بر کیست‌های آکانتاموبا به ترتیب 96/20، 19/13 و 75/7 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر به دست آمد.
نتایج فلوسایتومتری
 
 اسپند آبی کنترل منفی

قطره پلی‌هگزاناید
شکل: آنالیز فلوسایتومتری کیست‌های آکانتاموبا.
نمونه‌ها: کنترل منفی (بدون حضور دارو)، عصاره آبی اسپند و کنترل مثبت (قطره پلی هگزاناید 01/0%).
 
برای افتراق انگل دچار نکروز و آپوپتوز آکانتاموبای مواجه با دوزهای مختلف عصاره آبی اسپند، از روش رنگ‌آمیزی آنکسین V (Annexin-V) استفاده گردید. در گروه کنترل منفی پس از 72 ساعت، درصد سلول‌های دچار مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی، 58/7% بود و در نمونه تحت درمان با اسپند آبی ( 72 ساعت پس از درمان)، میزان مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی، 10/14% نشان داده شد. در نمونه‌های تحت درمان با قطره پلی‌هگزاناید، بیشترین میزان آپوپتوز اولیه و تأخیری، 74/76% (72 ساعت پس از درمان) نشان داده شد.
 
بحث
کراتیت آکانتامبایی، بیماری تخریب‌کننده بافت استرومای قرنیه بوده که متعاقب استفاده از لنزهای تماسی نرم رخ می‌دهد. در سال‌های اخیر روش‌های درمانی مختلفی مورد ارزیابی قرار گرفته است، اما هیچ‌کدام در معالجه بالینی و پارازیتولوژیکی تأثیر پایداری نداشته است. یک فاکتور مهم در درمان بیماری، کشت و تشخیص سریع سویه‌های آکانتامبا، همچنین بررسی و سنجش عوامل ضدانگلی می‌باشد. این روش پزشک را برای برنامه‌ریزی، به‌منظور دست‌یابی به بهترین نتایج یاری می‌کند (24). محققین اتفاق‌نظر دارند که عامل ضدآمیبی علیه گونه‌های آکانتاموبا زمانی دارای ارزش بالینی است که باعث تخریب هر دو مرحله تروفوزئیتی و کیستی آمیب شود. نتایج تمام آزمایش‌های داروشناسی بر روی انگل نشان داده است فرم تروفوزئیتی انگل بسیار حساس‌تر از فرم کیستی آن می‌باشد (25،26).
در مطالعه حاضر تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره آبی اسپند بر روی تروفوزوئیت‌ها وکیست‌های آکانتاموبا در محیط آزمایشگاهی مورد ارزیابی قرار گرفت که براساس نتایج حاصل، درصد کشندگی تروفوزوئیت‌ها و کیست‌ها با افزایش غلظت و افزایش زمان مجاورت عصاره در زمان معین افزایش یافت.
درصد زنده‌ماندن تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتاموبا پس از تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره آبی اسپند در بالاترین غلظت عصاره (10 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر) بعد از 72 ساعت به ترتیب به 47/32 و 15/50% رسید؛ طبق نتایج حاصل از این مطالعه می‌توان گفت عصاره آبی اسپند دارای یک فعالیت ضدآمیبی وابسته به دوز و زمان بر تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتاموبا بوده که داده‌های حاصل از مطالعات دیگر نیز این نتایج را تأیید می‌کنند.
در مطالعه‌ای توسط My Chu و همکاران، فعالیت ضدآمیبی 100 عصاره گیاهی قطبی و 100 عصاره گیاهی غیرقطبی به‌دست‌آمده از جنوب آسیا در شرایط آزمایشگاهی در مقابل سه گونه از آکانتاموبا (کاستلانی، کولبرتسونی و پلی‌فاگا) ارزیابی شد که از این میان، 4 عصاره نیلوفر پیچ (Ipomoea sp)، زنجبیل معطر (Kaempferia)، galanga Canaga odorata و Gastrochilus panduratum برای هر سه گونه آکانتاموبا ضدآمیب بودند. عصاره‌ها برای آکانتاموبا پلی‌فاگا‌لیتیک، آکانتاموبا کاستلانی و کولبرتسونی دارای خاصیت مهارکنندگی رشد بودند (27). در مطالعه‌ای توسط Polat و همکاران، فعالیت ضدآمیبی عصاره متانولی آویشن (Thymus sipyleus subsp) درمقابل آکانتاموبا کاستلانی مورد ارزیابی قرار گرفت که اثر عصاره قطبی در غلظت‌های 32-1 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر روی تکثیر تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتاموبا کاستلانی در شرایط آزمایشگاهی سنجش شد و مشخص گردید از بخش قطبی عصاره متانولی می‌توان به‌عنوان یک عامل طبیعی برای درمان عفونت‌های آکانتاموبایی استفاده کرد (28).
در مطالعه‌ای دیگر، Polat و همکاران با بررسی فعالیت ضدآمیبی عصاره چهار گونه سیر (Allium sp) با غلظت‌های 32-1 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر روی آکانتاموبا کاستلانی نشان دادند  A.scrodoprosum اثر ضدآمیبی قابل‌توجهی روی آکانتاموبا کاستلانی دارد، درحالی‌که بقیه غیرفعال هستند (29). Malatiali و همکاران نیز در مطالعه خود با ارزیابی فعالیت ضدآمیبی عصاره‌های متانولی چهار گونه شوید (Peucedanum caucasicum، P.palimbioides، P.chryseum، P.longibracteolatum) در شرایط آزمایشگاهی بر روی کیست‌ها و تروفوزوئیت‌های آکانتاموبا کاستلانی نشان دادند در میان عصاره‌های آزمایش‌شده، P. longibracteolatum قوی‌ترین اثر را دارد و در غلظت 32 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر، تروفوزوئیت‌ها و کیست‌ها بین 24 و 72 ساعت از بین می‌روند که عصاره در غلظت 16 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر درمقابل تروفوزوئیت‌ها، نتایج مشابهی داشت (22). در همه این مطالعات، عصاره‌ها یک فعالیت ضدآمیبی وابسته به دوز و زمان را بر روی تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتاموبا داشته‌اند.
در یک مطالعه با بررسی تأثیر عصاره الکلی و آبی گیاه گندواش بر روی تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتاموبا در شرایط برون‌تنی، مشخص گردید عصاره‌های آبی و الکلی گیاه گندواش یک فعالیت ضدآمیبی وابسته به دوز و زمان را بر آکانتاموبا دارند (21).
شربت‌خوری و همکاران در مطالعه‌ای با بررسی اثر عصاره الکلی دانه اسپند بر پلاسمودیوم فالسی‌پاروم و مقایسه آن با کلروکین در شرایط in vitro عصاره اسپند در 4 غلظت (50/12، 25، 50، 100 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر) بر روی انگل‌های جداشده از نمونه خون 23 بیمار مبتلا با پلاسمودیوم فالسی‌پاروم، نشان دادند عصاره الکلی دانه اسپند می‌تواند تا حدود زیادی مانند داروی کلروکین مانع رشد انگل پلاسمودیوم فالسی‌پاروم شود (30).
 

نتیجه‌گیری

نتایج این مطالعه نشان داد عصاره آبی اسپند در غلظت‌های مختلف بر تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتاموبا مؤثر است؛ لذا پیشنهاد می‌‌گردد مدل حیوانی و انسانی جهت تعیین اثر این گیاه بر روی رشد و تکثیر تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های آکانتاموبا بررسی شود. همچنین تحقیقات و بررسی‌های بیشتری در زمینه ماده مؤثره گیاه اسپند صورت گیرد.
 

تشکر و قدردانی

این مقاله به‌عنوان بخشی از پایان‌نامه کارشناسی ارشد انگل‌شناسی پزشکی در جلسه کمیته اخلاق پزشکی (به شماره 8635/د 52 دانشگاه تربیت مدرس مورخ 2/12/1393) به تصویب رسیده است. بدین وسیله، از تمامی همکاران محترم گروه و معاونت پژوهشی دانشگاه و دانشکده، تشکر و قدردانی به عمل می‌آید.