مجله دانشگاه علوم پزشکی قم

مقدمه
عفونت‌های بیمارستانی، یکی از معضلات بزرگ در حوزه پزشکی محسوب می‌شوند. سازمان بهداشت جهانی میزان ابتلا به عفونت‌های بیمارستانی را 10-5% بیماران بستری‌شده در بیمارستان‌های کشورهای توسعه‌یافته و بیش از 40% در کشورهای در حال توسعه اعلام کرده است (1). عفونت‌های بیمارستانی می‌توانند توسط میکروارگانیسم‌های مختلفی ایجاد شوند، اما باکتری‌ها در این امر نقش بیشتری داشته و مسئول 90% عفونت‌های بیمارستانی هستند (2). گرچه با کشف آنتی‌بیوتیک‌ها، انقلابی در تاریخ پزشکی و درمان عفونت‌های باکتریایی ایجاد شد، اما تقریباً حدود یک قرن بعد از معرفی آنتی‌بیوتیک‌ها، درمان برخی بیماری‌های عفونی مجدداً با مشکلات جدی مواجه گردید. دلیل اصلی این مسئله، مقاومت میکروبی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌هاست که به‌صورت یک اپیدمی جهانی به سرعت در حال افزایش است (3). علاوه بر مقاومت آنتی‌بیوتیکی، بازده پایین انتقال دارو به محل مورد نظر به دلیل مواجه با سدهای زیستی، همچنین ناپایداری و کاهش فعالیت ترکیبات ضد‌میکروبی از دیگر عوامل مسئله‌ساز در درمان بیماری‌های عفونی محسوب می‌شوند (4،5).
اخیراً، استفاده از نانوسیستم‌ها جهت تحویل هدفمند دارو، ازجمله راهکارهای موفقیت‌آمیزی بوده که برای غلبه بر این مشکلات مورد توجه قرار گرفته است (6). نانوذرات‌ داری خواص فیزیکوشیمیایی منحصر به‌فردی همچون اندازه بسیار کوچک، نسبت سطح به حجم زیاد و واکنشگری سطحی بالا هستند (7). این ویژگی‌ها مزایای زیادی را به آن‌ها به‌عنوان سیستم‌های مؤثر انتقال و تحویل دارو اعطا می‌کند که ازجمله آن‌ها می‌توان به انتقال هدفدار دارو به بافت مورد نظر، کنترل حلالیت و رهایش دارو اشاره کرد که در نهایت، به عملکرد بهتر دارو و کاهش اثرات جانبی آن منجر خواهد شد. علاوه بر این، نانوذرات‌ بارگذاری‌شده با مواد ضدمیکروبی، قابلیت نفوذ بهتری از طریق اندوسیتوز به سلول‌ها داشته و می‌توانند دارو را برای درمان عفونت‌های درون‌سلولی به‌طور کنترل‌شده آزاد سازند (8). تحقیقات گسترده‌ای در زمینه‌ انتقال آنتی‌بیوتیک‌ها و داروهای ضدسرطانی توسط سیستم‌های حامل نانویی انجام شده است (12-9).
کیتوزان یکی از جالب‌ترین و شناخته‌شده‌ترین پلیمرهای طبیعی جهت ساخت نانوحامل‌های دارویی می‌باشد. این امر به برخی خواص ایده‌آل آن مانند زیست تخریب‌پذیری، زیست ‌سازگاری، عدم سمّیت و ارزان بودن مربوط می‌شود. کیتوزان پلی‌ساکاریدی کاتیونی است که از استیل‌زدایی کیتین در شرایط قلیایی به دست می‌آید. کیتین را می‌توان به‌سهولت از پوسته سخت‌پوستانی مانند خرچنگ، میگو و یا دیواره سلولی برخی قارچ‌ها به دست آورد (13). علاوه بر خواص ذکرشده، فعالیت ضدمیکروبی کیتوزان برعلیه طیف وسیعی از میکروارگانیسم‌ها (مانند باکتری‌ها، مخمرها و قارچ‌ها) گزارش شده است (14).
از طرف دیگر، آموکسی‌سیلین، آنتی‌بیوتیکی نیمه‌سنتزی از دسته بتالاکتام‌ها بوده که در درمان طیف گسترده‌ای از عفونت‌های باکتریایی کاربرد دارد (15).آموکسی‌سیلین با اتصال به پروتئین متصل‌شونده به پنی‌سیلین باعث مهار فعالیت ترانس‌پپتیداز و جلوگیری از ساخت پپتید و گلیکان‌های دیواره سلولی شده که نتیجه آن مرگ باکتری به دلیل لیز آن خواهد بود (16). اما آموکسی‌سیلین باوجود داشتن طیف ضدباکتریایی وسیع، نیمه‌عمر زیستی کوتاهی در حدود 60 دقیقه دارد. این امر تجویز مکرر آن را برای حفظ غلظت مؤثرش اجتناب‌ناپذیر می‌سازد که علاوه بر اثرات جانبی، خطر ایجاد مقاومت باکتریایی نیز در این شرایط وجود دارد (17). گرچه مطالعات متعددی درخصوص تهیه نانوذرات مختلف جهت بارگذاری انواع مواد ضدمیکروبی انجام شده، ولی تاکنون پژوهشی درخصوص فعالیت ضدمیکروبی آموکسی‌سیلین به شکل آزاد در مقایسه با شکل نانوفرموله‌شده آن توسط پلیمر طبیعی کیتوزان بر روی پاتوژن‌های شایع بیمارستانی انجام نشده است؛ بنابراین، این مطالعه با هدف بررسی اثر ضدباکتریایی نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین برعلیه سوش‌های باکتریایی مختلف و مؤثر در ایجاد عفونت‌های بیمارستانی و پاسخ دادن به این سؤال که آیا نانوفرموله کردن آموکسی‌سیلین می‌تواند باعث افزایش فعالیت ضدباکتریایی و در نتیجه کاهش دوز مصرفی و اثرات جانبی آن شود یا خیر؟ انجام شد.
 
روش بررسی
در این مطالعه نیمه‌تجربی، ایزوله‌های بالینی استافیلوکوکوس اورئوس حساس و مقاوم به متی‌سیلین، اشرشیاکلی و انتروکوکوس فکالیس از بیماران بیمارستان قلب تهران در سال 1395، جداسازی و با روش‌های استاندارد میکروب‌شناسی تعیین هویت شدند. علاوه بر این، از سوش‌های استاندارد نیز برای کنترل کیفی شرایط آزمایش استفاده شد (18).
برای سنتز نانوذرات از روش ژلی‌شدن یونی استفاده گردید. ابتدا 30 میلی‌گرم کیتوزان در 30 میلی‌لیتر استیک اسید 1% حل و pH روی 5 تنظیم شد، سپس محلول 1/0% تری‌پلی‌فسفات سدیم (TPP) با pH مساوی 4، به نسبت 1 به 3 به‌صورت قطره‌قطره به آن اضافه گردید. محلول کلوئیدی حاصل در دمای اتاق (به مدت 45 دقیقه، با دور 800 دور در دقیقه) استیرر شد، سپس عمل سانتریفوژ به‌مدت 20 دقیقه با 15000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شد. پلیت‌ها پس از جمع‌آوری در دمای 60 درجه سانتیگراد خشک شدند. برای بارگذاری آموکسی‌سیلین در نانوذرات، 225 میلی‌گرم آموکسی‌سیلین در 30 میلی‌لیتر محلول 1/0% کیتوزان حل گردید. در ادامه، 10 میلی‌لیتر TPP 1/0% به 30 میلی‌لیتر محلول کیتوزان حاوی آموکسی‌سیلین به‌صورت قطره‌قطره اضافه و بقیه مراحل مانند روش تهیه نانوذرات کیتوزان اجرا شد. غلظت نهایی دارو، 625/5 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر بود (19). اندازه و پتانسیل زتای نانوذرات با روش پراکندگی نور دینامیکیDynamic Light Scattering, DLS) ) به کمک دستگاه Nanozeta Sizer (ساخت شرکت Malvern) در طول موج 633 نانومتر و با ضریب شکست 33/1 تعیین گردید. برای این منظور نانوذرات کیتوزان، همچنین نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین به‌طور جداگانه با آب 2 بار تقطیر و 10 بار رقیق، به مدت 5 دقیقه سونیکه شد. سپس 500 میکرولیتر از نمونه، داخل سل دستگاه قرار گرفت و پتانسیل سطح و اندازه ذره توسط دستگاه تعیین گردید. مورفولوژی نانوذرات با میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM، مدل MIRATESCAN) بررسی شد؛ بدین ترتیب که نانوذرات کیتوزان، همچنین نانوذرات بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین حاصله با نسبت 1:100 با آب 2 بار تقطیر رقیق شده و با استفاده از حمام اولتراسونیک سونیکه شد. ورقه آلومینیومی کاملاً صاف با ابعاد 2 در 2 برش داده شد. ورقه آلومینیومی تهیه‌شده با الکل کاملاً تمیز و در دمای محیط خشک گردید. در نهایت، از محلول رقیق‌شده نانوذرات کیتوزان و نانوذرات حاوی آنتی‌بیوتیک، یک قطره بر روی ورقه آلومینیومی ریخته شد و اجازه داده شد تا قطره در دمای اتاق خشک شود، سپس نمونه با لایه بسیار نازکی از طلا پوشش داده شد و اندازه و مورفولوژی نانوذرات توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی با قدرت بزرگنمایی 50000 برابر مورد ارزیابی قرار گرفت.
طیف‌های FTIR با استفاده از اسپکترومتر (FTIR-8400 مدل Shimadzu) در محدوده 4000-400 برسانتی‌متر بررسی شدند. برای تهیه نمونه، 5 میلی‌گرم از نانوذره کیتوزان، نانوکیتوزان بارگذاری‌شده با دارو و دارو و کیتوزان به‌صورت جداگانه با پودر پتاسیم بروماید مخلوط و سپس به کمک دستگاه پرس به شکل قرص درآمد. قرص حاصله در داخل سل دستگاه قرار گرفت و طیف FTIR آن ثبت گردید.
آزمایش‌های انجام‌شده با میکروسکوپ الکترونی و اسپکترومتری FTIR، در سازمان پژوهش‌های علمی صنعتی ایران و آزمایش‌های تعیین زتا پتانسیل و DLS در مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک دانشگاه تهران انجام شد.
حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) نانوذرات و آموکسی‌سیلین برعلیه باکتری‌های مورد مطالعه با استفاده از روش میکروبراث دایلوشن تعیین شد؛ بدین ترتیب که در 10 چاهک از پلیت‌های 96 خانه‌ای، 100 میکرولیتر محیط مولر هینتون براث ( مرک آلمان) ریخته شد، سپس به چاهک اول 100 میکرولیتر از نانوذرات کیتوزان (8 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر) یا نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین (320 میکرو‌گرم برمیلی‌لیتر) و یا آموکسی‌سیلین (128 میکرو‌گرم برمیلی‌لیتر) افزوده و پس از مخلوط کردن محتویات چاهک، 100 میکرولیتر از چاهک اول برداشته و به چاهک دوم اضافه شد. این کار تا آخرین چاهک ادامه یافت و در نهایت، از چاهک آخر 100 میکرولیتر دور ریخته شد، سپس به همه چاهک‌ها 5 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی افزوده شد؛ به‌طوری‌که غلظت نهایی باکتری در هر چاهک حدود 10⁵ واحد تشکیل‌دهنده کلنی در یک میلی‌لیتر بود. یک چاهک نیز به‌عنوان کنترل منفی (فاقد عامل ضد میکروبی)، در نظر گرفته شد. بعد از گرمخانه‌گذاری پلیت‌ها در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد، اولین چاهکی‌که از رشد باکتری در آن جلوگیری شد، به‌عنوان MIC معرفی گردید. برای تعیین حداقل غلظت کشنده (MBC) نیز 10 میکرولیتر از چاهک‌های شفاف برداشته و به محیط مولر هینتون آگار انتقال یافت و اولین رقتی که پس از 24 ساعت باعث از بین رفتن 9/99% باکتری‌ها شد، به‌عنوان MBC در نظر گرفته شد.
برای تعیین قطر هاله مهار رشد باکتری، از روش انتشار چاهک استفاده گردید؛ به این ترتیب که با استفاده از سواپ استریل از هریک از باکتری‌های مورد مطالعه بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شد، سپس با استفاده از انتهای پیپت پاستور استریل، چاهک‌هایی به قطر 6 میلی‌متر بر روی محیط کشت ایجاد شد. نانوذرات کیتوزان، آموکسی‌سیلین و نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین را به مقدار 50 میکرولیتر داخل هریک از چاهک‌ها ریخته و پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد، گرمخانه‌گذاری شدند. تمامی آزمایش‌ها سه بار تکرار شد.
 
یافته‌ها
براساس نتایج حاصل از آنالیز DLS، نانوذرات کیتوزان بدون دارو و نانوذرات بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین به ترتیب دارای اندازه متوسط 88 و 106 نانومتر بودند و میزان پراکندگی هر دو خیلی کم و در حد صفر بود (نمودار شماره 1 و 2).
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

نمودار شماره 1: توزیع اندازه  نانوذرات کیتوزان
 
 
 
 
 
 

توضیح نمودار شماره 1 و 2 نوشته شود
 
 
 
 
 
نمودار شماره 2: توزیع اندازه نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین
 
نمودار شماره 3، بارسطحی نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین را نشان می‌دهد.
بارسطحی (پتانسیل زتا) مثبت و بزرگتر از 30 میلی‌ولت بوده است. تصویر میکروسکوپ الکترونی نیز ظاهر کروی و اندازه نانومتری ذرات به‌دست‌آمده را تأیید می‌کند (شکل).
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

نمودار شماره 3 : توزیع بارسطحی نانوذرات کیتوزان بارگذاری شده با آموکسی سیلین
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

شکل: تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین.
 
طیف‌های مادون قرمز تبدیل فوریه (FTIR) نانوذرات کیتوزان تنها، آموکسی‌سیلین تنها و نانوذرات بارگذاری‌شده با آموکسی سیلین در نمودار شماره 4 نشان داده شده است. ظاهر شدن دو پیک در 1639 و 1385 برسانتی‌متر در طیف نانوذرات کیتوزان مربوط به گروه خمشی NH₄⁺ و نشان‌دهنده میانکنش بین گروه‌های آمونیوم کیتوزان با گروه‌های فسفاتTPP  و تشکیل نانوذرات کیتوزان می‌باشد (نمودار شماره 4: الف) (20). مشخصه‌های طیف FTIR آموکسی‌سیلین تنها نیز شامل جذب در عدد موجی 3463 و 3039 بر سانتی‌متر که به ترتیب مربوط به ارتعاش‌های کششی پیوندهای گروه‌های آمین،گروه‌های هیدروکسیل و گروه CH حلقه بنزنی آموکسی‌سیلین است. پیک‌های مشاهده‌شده در 1776 برسانتی‌متر نیز مربوط به حلقه بتالاکتام، 1686 برسانتی‌متر مربوط به پیوند CO با NH، 1519 برسانتی‌متر مربوط به پیوند C=C حلقه بنزن و 1452 برسانتی‌متر مربوط به پیوند ارتعاشی CN در مولکول آموکسی‌سیلین می‌باشد (نمودار شماره 4: ب) (21). در طیف نانوذرات بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین، هیچ پیک اضافی مربوط به دارو مشاهده نشد و تنها پیک‌های 3463 و 1639 برسانتی‌متر، اندکی به سمت طول‌موج‌های کوتاه‌تر و پیک‌های 1385، 888 و 524 برسانتی‌متر اندکی به سمت طول موج‌های بلندتر شیفت پیدا کردند که نشان‌دهنده تغییر در قدرت پیوندهای مربوطه در اثر میانکنش بین آموکسی با نانوذرات کیتوزان است (نمودار شماره 4: ج).
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

نمودار شماره 4: طیف‌های FTIR نانوذرات کیتوزان (الف)، آموکسی‌سیلین (ب) و نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین (ج).
 
تعیین MIC و MBC نانوذرات کیتوزان نشان داد این ذرات برعلیه تمام سوش‌های مورد آزمایش در این مطالعه دارای فعالیت ضدباکتریایی
هستند. نتایج نشان داد فعالیت ضدمیکروبی آموکسی‌سیلین بار‌گذاری‌شده در نانوذرات کیتوزان در مقایسه با آموکسی‌سیلین آزاد، قوی‌تر بوده است. همچنین کوچکترین MIC و MBC در مقابل سوش‌های استاندار و بالینی انتروکوکوس فکالیس و بزرگترین آن‌ها برای استافیوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین به دست آمد (جدول شماره 1).
 
جدول شماره 1: میزان حداقل غلظت مهاری (MIC) و حداقل غلظت کشنده (MBC) نانوذرات کیتوزان، آموکسی‌سیلین و نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با
آموکسی‌سیلین برحسب میکروگرم برمیلی لیتر برعلیه باکتری‌های مورد مطالعه

باکتری	نانوذرات کیتوزان		آموکسی‌سیلین		نانوذرات بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین
	MIC	MBC	MIC	MBC	MIC	MBC
استافیوکوکوس اورئوس حساس به متی‌سیلین*: ATCC 25932	50	100	2	4	1	2
استافیوکوکوس اورئوس حساس به متی‌سیلین	50	100	2	4	1	4
استافیوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین*: ATCC 33591	100	200	8	32	6	16
استافیوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین	100	200	8	32	6	24
اشرشیاکلی*:  ATCC 25922	80	160	4	8	2	4
اشرشیاکلی	80	160	4	16	2	6
انتروکوکوس فکالیس*: ATCC 29212	20	40	5/0	4	375/0	1
انتروکوکوس فکالیس	20	40	1	4	375/0	2

 
^*: نوع استاندارد سوش
 
 
 
کمترین قطر هاله‌ عدم رشد برای سوش بالینی استافیوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین مشاهده گردید که به ترتیب 7، صفر و 16 میلی‌متر بود. به‌همین ترتیب در مورد سوش‌های استاندارد و بالینی استافیلوکوکوس اورئوس حساس به متی‌سیلین، اشرشیا کلی و انتروکوکوس فکالیس، بزرگترین قطر هاله عدم رشد درمقابل نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین، سپس درمقابل آموکسی‌سیلین آزاد به دست آمد. کوچکترین قطر هاله مهار رشد نیز مربوط به نانوذرات کیتوزان بدون دارو (15-9نانومتر) بود (جدول شماره 2).
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
جدول شماره 2 : میانگین قطر هاله عدم رشد (برحسب میلی‌متر) نانوذرات کیتوزان و نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین در مقایسه با

باکتری	نانوذرات کیتوزان	آموکسی‌سیلین	نانوذرات بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین
استافیلوکوکوس اورئوس حساس به متی‌سیلین*: ATCC 25932	2/0±12	5/ ±22	2/0±25
استافیلوکوکوس اورئوس حساس به متی‌سیلین	5/0±12	5/ ±21	2/ ±25
استافیوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین*: ATCC 33591	6/ ±7	0	2/ ±17
استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین	6/ ±7	0	7/0±16
اشرشیا کلی*: ATCC 25922	4/ ±9	5/0±17	8/0±21
اشرشیاکلی	2/ ±10	9/ ±17	7/0±20
انتروکوکوس فکالیس: *ATCC 29212	4/0±14	4/ ±23	6/ ±27
انتروکوکوس فکالیس	5/0±15	5/ ±24	8/ ±28

 
^*: نوع استاندارد سوش
 
بحث
آنتی‌بیوتیک‌ها، داروهای ارزشمندی جهت بهبود بسیاری از بیماری‌های عفونی هستند، ولی استفاده نابجا از آن‌ها باعث افزایش مقاومت باکتریایی شده است. بنابراین جایگزینی روش‌های درمانی جدید، ازجمله نانوفرموله کردن آنتی‌بیوتیک‌ها می‌تواند باعث گشایش افق‌های نوینی در این زمینه شود.در مطالعه حاضر، آنتی‌بیوتیک آموکسی‌سیلین در نانوذرات کیتوزان، بارگذاری و کاربرد این نانوفرمولاسیون برعلیه برخی باکتری‌های شایع دخیل در ایجاد عفونت‌های بیمارستانی بررسی گردید.
براساس نتایج مطالعه حاضر، نانوذرات کیتوزان به‌دست‌آمده با اندازه متوسط 88 نانومتر به تنهایی برعلیه همه سوش‌های مورد بررسی دارای اثر ضدباکتریایی بود. همچنین مقادیر MIC این نانوذرات برعلیه سوش‌های بالینی و استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس حساس و مقاوم به متی‌سیلین به ترتیب 50 و 100 میکرو‌گرم برمیلی‌لیتر تعیین شد، درحالی‌کهCosta  و همکاران، MIC نانوذرات کیتوزان با اندازه متوسط 214 نانومتر را برعلیه همه نمونه‌های استافیلوکوکوس اورئوس (نوع حساس و مقاوم)، 1250 میکرو‌گرم برمیلی‌لیتر گزارش کردند (22). اما در مطالعه دیگری، MIC این نانوذرات (115 نانومتر)، برعلیه این باکتری 100 میکرو‌گرم برمیلی‌لیتر تعیین گردید (23).
در این مطالعه MIC به‌دست‌آمده برای سویه‌های استاندارد اشرشیاکلی و انتروکوکوس فکالیس به ترتیب 80 و 20 میکرو‌گرم برمیلی‌لیتر بود؛ درحالی‌که سلیمانی و همکاران مقادیر 70 و 30 میکرو‌گرم برمیلی‌لیتر را برای این دو باکتری گزارش کردند (24). نتایج متفاوت به دست آمده درخصوص فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات کیتوزان می‌تواند به خواص متفاوت این نانوذرت که تحت شرایط آزمایشگاهی متفاوتی تهیه شده مربوط باشد. در تحقیقات دیگری، تأثیر اندازه، میزان بارسطحی و سایر خصوصیات نانوذرات بر فعالیت ضدباکتریایی آن‌ها ثابت شده است (25،26). در آزمایش‌های انجام‌شده در مطالعه حاضر، پتانسیل زتای نانوذرات کیتوزان حاوی آموکسی‌سیلین با نانوذرات کیتوزان بدون دارو تفاوتی نداشت و هر دو مثبت و حدود 40-39 میلی‌ولت بود که نشانگر پایداری نانوذرات و امکان نگهداری طولانی آن است. پتانسیل زتا که همان بار سطحی می‌باشد به‌طور عمده می‌تواند بر پایداری ذره در سوسپانسیون از طریق دافعه الکتروستاتیک بین ذرات تأثیرگذار باشد. مطالعه Honary و همکاران نشان داد نانوذرات با بار سطحی بالای 30 میلی‌ولت پایدارتر بوده که این مسئله از به‌هم چسبیدن ذرات جلوگیری می‌کند و منجر به  افزایش پایداری آن‌ها می شود (27).
در مطالعه حاضر فعالیت نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین آزاد برعلیه باکتری‌های فوق‌الذکر بررسی و مقایسه گردید که نتایج حاکی از فعالیت قوی‌تر این نانوذرات در مقایسه با آنتی‌بیوتیک آزاد بود. با توجه به خاصیت ضدمیکروبی ذاتی کیتوزان، اثر قوی‌تر نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین در مقایسه با داروی آزاد می‌تواند به دلیل تأثیر هم‌افزایی کیتوزان و آموکسی‌سیلین باشد. با توجه به جستجوهای انجام‌شده در منابع علمی، گزارشی مبنی بر ارزیابی عملکرد نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین بر روی اشرشیاکلی، انتروکوکوس فکالیس و استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین یافت نشد؛ البته تعداد محدودی مطالعه در ارتباط با تهیه نانوذرات کیتوزان به‌صورت هوموپلیمر یا در کمپلکس با پلیمرها و ترکیبات دیگر نظیر آلژینات و هپارین تهیه و پس از بارگذاری آنتی‌بیوتیک آموکسی‌سیلین بر روی این ذرات، اثرات ضدمیکروبی قوی‌تر آن‌ها در مقایسه با آموکسی‌سیلین آزاد برعلیه هلیکوباکترپیلوری گزارش گردید (28).
آنتی‌بیوتیک‌های بتالاکتامی مانند آموکسی‌سیلین با اتصال به جایگاه فعال پروتئین متصل‌شونده به پنی‌سیلین، مانع سنتز دیواره سلولی باکتری و در نتیجه لیز آن می‌شوند، اما مکانیسم دقیق فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات کیتوزان هنوز مشخص نشده است؛ البته گمان می‌رود نانوذرات کیتوزان به‌علت اندازه بسیار کوچک خود، خیلی بهتر و راحت‌تر می‌تواند با غشای سلولی میانکنش برقرار کند و این میانکنش‌های الکتروستاتیکی، سرانجام در نفوذپذیری دیواره غشای سلولی اختلال ایجاد کرده که نتیجه آن تراوش بخشی از مواد داخل سلول به بیرون، همچنین جلوگیری از ورود مواد غذایی به داخل سلول است. از طرفی، نانوذرات کیتوزان با ورود به داخل سلول و برقراری پیوند با DNA، از سنتز RNA و در نتیجه تولید پروتئین‌های حیاتی سلول جلوگیری می‌کند (29). بنابراین کیتوزان با داشتن خاصیت ضدباکتریایی خود می‌تواند حداقل غلظت مهاری آموکسی‌سیلین را به‌خصوص درمقابل سویه مقاوم باکتری استافیلوکوکوس اورئوس که امروزه یکی از عمده‌ترین مسائل در درمان بیماری‌های عفونی است، کاهش دهد. در نتیجه دوز مصرفی آنتی‌بیوتیک و متعاقب آن اثرات جانبی نامطلوب دارو می‌تواند کاهش یابد. از دیگر مزایای کاربرد این نانوفرمولاسیون می‌توان به محافظت از دارو و جلوگیری از تجزیه آن، افزایش جذب دارو با تسهیل انتشار از طریق اپی‌تلیوم و افزایش توزیع درون‌سلولی دارو اشاره کرد که البته اثبات آن نیاز به تحقیقات بیشتری دارد (30).
 
نتیجه‌گیری
نتایج این مطالعه تا حد قابل‌ملاحظه‌ای اثر ضدباکتریایی قوی‌تر نانوذرات کیتوزان بارگذاری‌شده با آموکسی‌سیلین را در شرایط برون‌تنی در مقایسه با آموکسی‌سیلین آزاد نشان داد، اما برای اطمینان از اثربخشی و کارآیی مناسب این نانوذرات، نیاز به مطالعه بیشتری در شرایط درون‌تنی می‌باشد.
 
تشکر و قدردانی
این مطالعه در قالب طرح تحقیقاتی مصوب (به شماره 94014310) با حمایت بنیاد ملی علوم ایران (INSF) انجام شده است.