دوره 12، شماره 9 - ( آذر 1397 )
جلد 12 شماره 9 صفحات 25-12 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Nasajpour V, Noori A, Naieri H. Histopathological Effects of Multiwall Carbon Nanotubes on Rat Liver. Qom Univ Med Sci J 2018; 12 (9) :12-25
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-2073-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-2073-fa.html
نساج پور وجیهه، نوری علی، نیری هاشم. اثرات هیستوپاتولوژیک نانولوله‌های‌کربن چند دیواره بر کبد موش صحرایی. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1397; 12 (9) :12-25
وجیهه نساج پور* 
1، علی نوری2 ، هاشم نیری3
1، علی نوری2 ، هاشم نیری3
1- واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی
2- دانشگاه ازاد فلاورجان
3- گروه زیست‌شناسی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی
2- دانشگاه ازاد فلاورجان
3- گروه زیست‌شناسی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی
متن کامل [PDF 1775 kb]
(1115 دریافت)
| چکیده (HTML) (4573 مشاهده)
متن کامل: (808 مشاهده)
مقدمه
ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی مواد می‌تواند با کاهش اندازه آنها در محدوده نانو به‌طور ناگهانی تغییر کند. کوچک شدن اندازه به‌معنای جای‌گیری و استقرار متفاوت اتم‌های سطحی بوده که این امر فیزیک و شیمی اشیا را تغییر می‌دهد (1). یک نانولوله تک‌دیواره‌ای (Single Wall Carbon Nanotube, Swcnt) با پیچیدن یک ورقه گرافن به دور خود و ایجاد یک استوانه به‌وجود می‌آید و بسته به اینکه این ورقه گرافنی در چه جهتی به‌دور خود پیچیده شود اشکال نانولوله‌های به‌وجودآمده متفاوت خواهد بود و درصورتی‌که تعداد ورقه‌های گرافن بیشتر باشد، نانولوله چنددیواره (Multi Wall Carbon Nanotube, Mwcnt) به‌وجود می‌آید (2). همچنین می‌توان فضای درون لوله‌ها را با مواد گوناگونی نظیر فلزات و برخی پروتئین‌ها پر کرد (3)، و مواد فلورسنت، آنزیم‌ها، ژن‌ها یا داروهای مختلف را در آنها جاسازی و به بافت‌ها و سلول‌های هدف هدایت کرد یا در تکنیک‌های تصویربرداری زیستی از آنها استفاده نمود (4،5). در این میان، برخی عوامل ممکن است سبب سمّیت نانولوله‌های کربن شوند؛ به‌عنوان مثال خلوص شیمیایی ماده، عامل مهمی در ایمنی زیستی نانوذرات است. نانولوله‌های کربن معمولاً دارای ناخالصی‌های فلزی ازجمله آهن، نیکل و کبالت هستند که می‌تواند بر چگونگی واکنش و پاسخ بیولوژیکی اثر بگذارد (6،7). از طرفی، شکل ذره بر رفتار جذب و جایگزینی ذره در محیط‌های بیولوژیکی از طریق اثرگذاری بر رفتار کانال‌های یونی در غشای سلول‌ها مؤثر است (8). همچنین افزایش نسبت سطح به حجم، کیفیت شیمی سطح و بارالکتریکی سطحی باعث افزایش بسیار شدید تعداد گروه‌های فعال در واحد جرم و در نتیجه، افزایش واکنش‌پذیری کلی نانولوله‌های کربن و افزایش توانایی آنها در تعاملات بیولوژیکی شده که معمولاً در سیستم گیرنده‌دهنده الکترونی اختلال ایجاد می‌کند و سبب تولید رادیکال‌های آزاد و درنتیجه ایجاد فشارهای اکسیداتیو می‌گردد (9،10). سلول‌های در معرض CNTها به دلیل القای اکسیدان‌ها دستخوش استرس اکسیداتیو می‌شوند که در پی آن با فعال کردن مسیرهای سیگنالینگ، پروتئین کیناز و سیتوکین‌های پیش‌التهابی سبب آپوپتوز و سمّیت سلولی می‌شوند (11). کاهش در بقای سلولی و سطوح افزایش‌یافته سیتوکین‌های پیش‌التهابی و اینترلوکین‌ها نشان می‌دهد MWCNTها می‌توانند سبب پاسخ التهابی در کراتینوسیت‌های انسانی در دوز 4/0 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر شوند (12). همچنین فشارهای اکسیداتیو سبب اختلال در عملکرد میتوکندری و زنجیره انتقال الکترون شده و آپوپتوز سلولی را نیز به همراه دارند (13). از مکانیسم‌های دیگر، اثر نانولوله‌های کربن بر سلول‌ها، فعل و انفعال مستقیم آنها با مواد ژنتیکی و در نتیجه آسیب در سطح DNA یا کروموزوم است (14). از تکنیک‌هایی که تاحدی سمّیت نانولوله‌های کربن و ایمنی زیستی آنها را کاهش می‌دهد، ایجاد تغییرات سطحی با افزودن گروه‌های عاملی نظیر آمونیوم، پلی‌اتیلن گلایکول، هیدروکسیل، کربوکسیل و ...، می‌باشد که سطوحی را برای اتصال انواع مختلف ماکرومولکول‌های زیستی و غیرزیستی جهت کاربرد این نانوساختارها فراهم می‌کند (15). با این وجود، در گزارش‌های متعددی به سمّیت نانولوله‌های کربن اشاره شده که معمولاً همراه با ایجاد واکنش‌های التهابی است. در این میان، سلول‌های فاگوسیتوزکننده، به‌ویژه نوتروفیل‌ها و ماکروفاژها با حضور در اکثر بافت‌های بدن قادرند نانوذرات را جذب کنند، اما اندام‌های خاصی ازجمله کبد، طحال و گره‌های لنفاوی دارای تعداد فراوانی از این سلول‌ها بوده که در نتیجه معمولاً این اندام‌ها محل تجمع انواع مختلف نانوذرات در بدن هستند (16).
در مطالعه حاضر اختلالات بافتی کبد در اثر تزریق مکرر نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار در ارتباط با ایجاد استرس اکسیداتیو در رت‌ها مورد بررسی قرار گرفت.
روش بررسی
این تحقیق به‌صورت تجربی بر روی 48 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با میانگین متوسط وزن 200 گرم (خریداری‌شده از مرکز انستیتو پاستور تهران) انجام گرفت. حیوانات در شرایط آزمایشگاهی استاندارد (دمای 25-20 درجه سانتیگراد و 12 ساعت روشنایی، 12 ساعت تاریکی) در لانه حیوانات دانشگاه آزاد فلاورجان نگهداری شدند. آزمایش‌ها با تأیید شورای پژوهشی دانشگاه و طبق دستورالعمل‌‌های اخلاقی انجمن بین‌المللی مطالعه درد در مورد حیوانات آزمایشگاهی
(International Association for Study of Pain) انجام شد (17).
ابتدا نانولوله‌های کربن چنددیواره عامل‌دارشده با گروه کربوکسیل (با قطر خارجی 20-10 نانومتر، قطر داخلی 10-5 نانومتر، طول 2-5/0 میکرومتر، درجه خلوص بالای 95% با محتوای 2% COOH وزنی و سطح ویژه 200 مترمربع برگرم) از شرکت نوترینو در تهران خریداری شد. غلظت‌های 10 و 20 میلی‌گرم برکیلوگرم وزن بدن در تویین 80% و سرم فیزیولوژیک ( نسبت 1 به 100) به‌عنوان حلال تهیه گردید ( 10). استفاده از تویین و قرار دادن مخلوط حاصل در دستگاه اولتراسونیک با دمای 4درجه سانتیگراد و دامنه 40% برای مدت 30 دقیقه، به تهیه محلول نسبتاً یکنواخت و هموژن از نانولوله‌های کربن کمک می‌کند (14).
حیوانات به‌صورت تصادفی به 6 گروه 8 تایی تقسیم شدند. گروه‌های تیمار نانولوله‌های کربن را (با دوزهای 10 و 20 میلی‌گرم برکیلوگرم) به‌صورت درون‌صفاقی و یک‌روز در میان، طی 21 مرحله دریافت کردند (دو گروه تیمار با دوز 10 میلی‌گرم برکیلوگرم و دو گروه تیمار با دوز 20 میلی‌گرم برکیلوگرم با زمان خونگیری متفاوت) و به دو گروه شاهد سرم فیزیولوژی به همراه توئین تزریق شد (13). با استناد به گزارش‌های قبلی مبنی بر عدم اثرگذاری شوک حاصل از تزریق سرم فیزیولوژیک بر حیوانات آزمایشگاهی (18)، گروه کنترل در نظر گرفته نشد و گروه شاهد با گروه‌های تجربی (گروه‌هایی که نانولوله‌های کربن دریافت کردند) مقایسه گردید. خونگیری در دو مرحله زمانی (24ساعت پس از آخرین تزریق و 144 ساعت پس از آخرین تزریق) (19) مستقیماً از قلب گروه‌های تیمار به‌طور مجزا به‌عمل آمد. حیوانات قبل از اولین تزریق و قبل از خونگیری، وزن شدند.
به‌منظور بررسی میزان فشار اکسیداتیو، غلظت گروه‌های تیول و مالون‌دی‌آلدئید در سرم خون اندازه‌گیری شد. اساس اندازه‌گیری گروه‌های تیول، واکنش گروه‌های سولفیدریل با معرف Elman DTNB) 2nitrobenzoic acid, dithiobis َ5،5) بود. ماحصل واکنش بین گروه‌های دی‌سولفیدی معرف و گروه‌های تیولی، تولید یک مول5thiobenzoate - nitro-2 به‌ازای هر مول سولفیدریل است. آنیون، نتیرو تیو بنزوات زردرنگ بوده و در طول موج 412 نانومتر دارای ماکزیمم جذب است (19).
یکی از روش‌های اندازه‌گیری پراکسیداسیون لیپیدها در سرم، اندازه‌گیری محصولات ناشی از شکسته شدن هیدروپراکسیدها، به‌ویژه آلدئیدها بوده که شامل مالون‌دی‌آلدئید نیز می‌باشد. آلدئیدهای گوناگونی ازجمله MDA (مالون‌دی‌آلدئید) با تیوباربیتوریک اسید (TBA) در PH اسیدی و دمای بالا واکنش می‌دهد. در واکنش تست TBA، یک مولکول از MDA با 2 مولکول از TBA (TBA2-MDA) با تولید رنگدانه‌های صورتی (با جذب ماکزیمم در 535-532 نانومتر)، واکنش نشان می‌دهند (20). جهت بررسی ساختار بافت کبد، از هر گروه، سه رت پس از خونگیری تشریح شد و بخشی از کبد در فرمالین 10% قرار گرفت، سپس از هر نمونه کبد، سه لام تهیه گردید (9 عدد لام از هرگروه و در مجموع 54 لام از 6 گروه مورد مطالعه) و با روش هماتوکسیلین-ائوزین رنگ‌آمیزی شدند. لام‌ها به‌وسیله میکروسکوپ نوری Olympus CX22LED مجهز به دوربین Canon Eos 760D 18 (ساخت کشور ژاپن) با بزرگنمایی 100 و 400، بررسی و از نقاط مختلف آنها عکس‌برداری شد. جهت مطالعه کیفی لام‌ها و اطمینان از نتایج حاصل از مطالعه آنها، لازم بود تعداد زیادی از مقاطع بافتی تهیه و مورد بررسی بافت‌شناسی قرار گیرد (14،18). مقاطع بافتی از نظر هیستولوژیک (وضعیت طناب‌های هپاتوسیتی، سینوزوئیدها و تجمع سلول‌های التهابی) در گروه‌های تیمار در مقایسه با گروه شاهد، بررسی شدند.
میانگین مقدار مالون‌دی‌آلدئید و گروه‌های تیول در گروه‌های تیمار و شاهد به کمک آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه و تست دانکن با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 22 مقایسه گردید. سطح معنی‌داری، 05/0p< در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
در این مطالعه، غلظت مالون‌دی‌آلدئید 24 ساعت پس از تیمار (پس از آخرین تزریق)، اختلاف معنی‌داری را در گروه‌های تیمار نسبت به گروه شاهد نشان نداد، اما پس از گذشت 144ساعت (19) در هر دو غلظت 10 و 20 میلی‌گرم برکیلوگرم، میانگین مقدار مالون‌دی‌آلدئید، افزایش معنی‌داری نشان داد (05/0p<) (جدول شماره 1).
مقدار گروه‌های تیول پلاسما با استفاده از منحنی استاندارد GSH و در طول‌موج 412 نانومتر تعیین گردید که پس از گذشت 24 ساعت از تیمار، مقدار آن تنها در دوز 10 میلی‌گرم برکیلوگرم نسبت به سایر گروه‌ها، به‌طور معنی‌داری افزایش نشان داد (05/0p<)، اما با گذشت 144ساعت (6 روز) از تیمار، مقدار گروه‌های تیول پلاسما، اختلاف معنی‌داری را بین گروه‌های مختلف نشان نداد؛ به عبارت دیگر، در دوز 10 میلی‌گرم برکیلوگرم نیز به حالت نرمال بازگشت (جدول شماره 2).
جدول شماره 1: تغییرات مقدار مالون‌دی‌آلدئید 24 و 144 ساعت پس از آخرین تزریق نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار، با استفاده از آزمون واریانس یک‌طرفه
*:افزایش مقدار مالون‌دی‌آلدئید نسبت به گروه شاهد (05/0p<)
جدول شماره 2: غلظت گروه‌های تیول 24 و 144 ساعت پس از آخرین تزریق نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار، با استفاده از آزمون واریانس یک‌طرفه
*: افزایش مقدار گروه‌های تیول نسبت به گروه شاهد(05/0p<)
مطالعات بافت‌شناسی به‌صورت کیفی بر روی نمونه‌ها و تعداد زیادی از لام‌های تهیه‌شده از کبد گروه تیمار در مقایسه با شاهد انجام گرفت تا اطمینان از ایجاد اختلالات بافتی به دست آید (14،18). در گروه شاهد، وضعیت مورفولوژیک بافت کبد، نرمال بود. همچنین طناب‌های هپاتوسیتی و سینوزوئیدها منظم، هسته هپاتوسیت‌ها بزرگ و مشخص، سیاهرگ‌های مرکز لوبولی با دیواره‌ای سالم و فضای پورت (شامل: سرخرگ، سیاهرگ کبدی و مجرای صفراوی)، حالتی نرمال داشتند و هیچ‌گونه تراکمی از سلول‌های التهابی مشاهده نشد (شکل 3-1).
شکل شماره 1: گروه شاهد: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی100. CV سیاهرگ مرکز لوبولی،
H-S هپاتوسیت‌ها و سینوزوئیدها
شکل شماره 2: گروه شاهد: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی100.
فضای پورت را نشان می‌دهد: A سرخرگ کبدی، B مجرای صفراوی.
شکل شماره 3: گروه شاهد: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
وضعیت نرمال سینوزوئیدها و هپاتوسیت‌ها، سیاهرگ مرکز لوبولی با دیواره‌ای نازک (cv).
در مقاطع بافتی مربوط به غلظت 10 میلی‌گرم برکیلوگرم پس از 24 ساعت، در برخی سیاهرگ‌های مرکز لوبولی و سینوزوئیدها، احتقان یا تجمع خون دیده شد. همچنین نسبت به گروه شاهد تجمع سلول‌های التهابی (نوتروفیل‌ها و بازوفیل‌ها) و لیز شدن هپاتوسیت‌ها در برخی نقاط به‌خوبی مشهود بود (شکل شماره 5-4)
شکل شماره 4: غلظت 10 میلی‌گرم برکیلوگرم 24 ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی 100.
فلش‌ها تجمع خون در سیاهرگ مرکز لوبولی و سینوزوئیدها را نشان می‌دهد.
شکل شماره 5: غلظت 10 میلی‌گرم برکیلوگرم، 24ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
تجمع سلول‌های التهابی در فضای پورت (فلش نازک) و هپاتوسیت‌های لیزشده (فلش ضخیم).
اختلالات بافتی (شامل: تجمع شدید سلول‌های التهابی، اتساع و بی‌نظمی شدید سینوزوئیدها، لیز شدن تعداد بیشتری از هپاتوسیت‌ها) در غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم نسبت به 10 میلی‌گرم برکیلوگرم به‌طور قابل‌توجهی بیشتر بود.
همچنین تغییرات جدیدی در مقاطع بافتی این گروه به‌صورت تورم و واکوئله شدن هپاتوسیت‌ها مشاهده گردید؛ به‌طوری‌که فضاهای سینوزوئیدی ناپدید شده بود. این تغییرات معمولاً با آتروفی شدید هسته هپاتوسیت‌ها در برخی نقاط همراه بود
(شکل 8-6).
شکل شماره 6: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم، 24 ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
تجمع شدید سلول‌های التهابی در فضای پورت به‌خوبی مشهود است.
شکل شماره 7: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم، 24 ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
هپاتوسیت های لیزشده و فاقد هسته (فلش نازک) اتساع سینوزوئیدها (فلش ضخیم).
شکل شماره 8: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم، 24 ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
تورم و واکوئله شدن سیتوپلاسم هپاتوسیت‌ها (فلش ضخیم)، آتروفی هسته هپاتوسیت‌ها (فلش نازک).
سینوزوئیدها نامشخص هستند.
در اثر تزریق نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار با غلظت 10میلی‌گرم برکیلوگرم پس از گذشت 144 ساعت از آخرین تزریق، تغییرات شدیدتری در بافت کبد نسبت به گذشت زمان 24 ساعت ایجاد شد. این اختلالات علاوه بر تجمع سلول‌های التهابی، به‌صورت تخریب و لیز شدن شدیدتر هپاتوسیت‌ها بود که منجر به اتساع قابل‌توجه سینوزوئیدها گردید (شکل شماره 9). همچنین در برخی مقاطع، تورم و تشکیل واکوئل در سیتوپلاسم هپاتوسیت‌ها دیده شد که ناپدید شدن سینوزوئیدها را به همراه داشت (شکل شماره 10)، که این حالت در زمان 24ساعت پس از تیمار دیده نشد.
شکل شماره 9: غلظت 10 میلی‌گرم برکیلوگرم 144ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی 400.
هپاتوسیت‌های لیزشده (فلش نازک)، اتساع سینوزوئیدها (فلش ضخیم) و هسته‌های آتروفی‌شده (فلش سمت چپ).
شکل شماره 10: غلظت 10 میلی‌گرم برکیلوگرم 144ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
در اکثر نقاط هپاتوسیت‌های واکوئله و متورم دیده میشود (فلش) و سینوزوئیدها قابل‌مشاهده نیستند.
شدیدترین اختلالات بافتی در اثر تزریق نانولوله‌های کربن چنددیواره عامل‌دارشده با گروه کربوکسیل (با غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم) پس از گذشت 144 ساعت از آخرین تزریق مشاهده گردید. تورم و تشکیل حفره (واکوئل) در سیتوپلاسم هپاتوسیت‌ها نسبت به گروه‌های قبلی با شدت و وضوح بالاتری در تعداد بیشتری از لام‌های مورد بررسی دیده شد (شکل شماره 11).
شکل شماره 11: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم 144ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
هپاتوسیت‌های تغییریافته به‌وضوح قابل‌مشاهده است (فلش).
همچنین دژنره‌شدن و بی‌نظمی شدید طناب‌های هپاتوسیتی تنها در این گروه قابل‌تشخیص بود که منجر به تغییر مورفولوژیک معنی‌داری در بافت کبد شد (شکل شماره 12).
شکل شماره 12: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم 144ساعت پس از تزریق:
مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
بی‌نظمی و دژنره شدن شدید طناب‌های هپاتوسیتی. به تغییرات شدید مورفولوژیک توجه کنید.
در برخی مقاطع بافتی نیز تخریب و ناهنجاری در جداره سیاهرگ مرکز لوبولی علاوه بر تغییرات قبلی مشاهده گردید (شکل شماره 13).
شکل شماره 13: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم ، 144ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
فلش تخریب دیواره سیاهرگ مرکز لوبولی را نشان می‌دهد.
بحث
مالون‌دی‌آلدئید، از محصولات نهایی پراکسیداسیون لیپیدی است که از آن به‌طور وسیع به‌عنوان شاخص استرس اکسیداتیو استفاده میشود (21). در مطالعه حاضر تزریق نانولوله‌های کربنی 24 ساعت پس از تیمار، بر میزان این فاکتور بی‌تأثیر بود، اما در مرحله دوم خونگیری (144 ساعت پس از آخرین تزریق)، افزایش معنی‌دار فاکتور مالون‌دی‌آلدئید در هر دو دوز 10 و 20 میلی‌گرم برکیلوگرم نسبت به گروه شاهد به دست آمد. نتایج نسبتاً مشابهی در اثر کاربرد نانولوله‌های کربن تک‌دیواره DNAدار توسط Muresan و همکاران در سال 2010 (19) و نانولوله‌های کربن چند دیواره DNAدار توسط Clichici و همکاران در سال 2012 (22)، در غلظت‌های مختلف به‌صورت افزایش مقدار MDA در ساعات مختلف پس از تیمار به دست آمد که الگوی ناپایدار و متغیر افزایش فشارهای اکسیداتیو را نشان می‌داد. همچنین در مطالعات Patlolla و همکاران در سال 2011، افزایش هیدروپراکسیدازها همراه با اثرات هپاتوتوکسیک نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار مشاهده گردید (14)، که با نتایج مطالعه حاضر همخوانی داشت. برخی مطالعات invitro نیز بر روی رده‌های مختلف سلولی، اثرات سمی وابسته به قطر و طول نانولوله‌های کربن چنددیواره را به‌صورت افزایش MDA همراه با آپوپتوز سلولی، مهار چرخه سلولی و افزایش سطح تنش‌های اکسیداتیو نشان داده‌اند (23،24). گروه‌های تیول پلاسما نیز یکی دیگر از نشانگرهای آسیب رادیکال‌های آزاد است که این عوامل به آسیب اکسیداتیو حساس بوده و در نتیجه این آسیب‌ها کاهش می‌یابند، درحالی‌که در تحقیق حاضر 24 ساعت پس از تیمار، در مقدار تیول (دوز 10) افزایش معنی‌دار و پس از 144ساعت تغییری ایجاد نشد که با نتایج مطالعه Muresan و همکاران در سال 2010 پس از گذشت 48ساعت از تیمار موش‌ها همخوانی داشت (19). در تحقیق حاضر، عدم کاهش گروه‌های تیول ممکن است به دلیل غلبه آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی بدن بر ROSتولیدشده در اثر نانولوله‌های کربن باشد.
در همین رابطه تحقیق دیگری نشان داد تجمع نانولوله‌های کربن تک‌دیواره در ریه‌ها پس از تزریق درون رگی، استرس اکسیداتیو (افزایش ROS)، اکسیداسیون لیپیدها و تشکیل MDA را همزمان با افزایش میزان GSH (یک آنتی‌اکسیدان قوی است که می‌تواند به محافظت سلول‌ها و بافت‌ها در مقابل ROS کمک کند) به همراه دارد که تأییدکننده اثرات بازدارنده آنتی‌اکسیدان‌ها هنگام افزایش فشارهای اکسیداتیو در بدن است و هنگامی‌که در اثر افزایش بیش از حد رادیکال‌های آزاد، تعادل بین سطوح MDA و GSH از بین برود، اختلالات بافتی و عملکردی در ریه‌ها آغاز میشود (25،26)؛ بنابراین در تحقیق حاضر، افزایش موقت میزان گروه‌های تیول پلاسما پس از گذشت 24 ساعت، ممکن است نشان‌دهنده تقویت سیستم آنتی‌اکسیدانی جهت محافظت سلول‌ها و بافت‌ها از اثرات ROS باشد.
در مطالعه حاضر نتایج بافت‌شناسی، تغییرات و ناهنجاری‌های قابل‌توجهی (شامل: پرخونی، تراکم سلول‌های التهابی، بی‌نظمی سینوزوئیدها، تخریب و واکوئله شدن هپاتوسیت‌ها) را در ساختار بافت کبد در گروه‌های دریافت‌کننده نانولوله‌های کربن به‌صورت وابسته به دوز و زمان نشان داد. در گزارش‌های متعدد توسط محققین مختلف نیز اختلالات نسبتاً مشابهی در اثر کاربرد نانولوله‌های کربن در ساختار بافت کبد مشاهده شده که برخی از آنها شامل: اختلالات سلول‌های کبدی، واکوئله شدن، کاریومگالی و تخریب نسبی ورید مرکزی همراه با تجمع نانولوله‌های کربن در کبد می‌باشد (14،27). همچنین Lacerda و همکاران در سال 2008، اختلالات مشابهی را در کبد حتی در دوز پایین (5 میلی‌گرم برکیلوگرم) گزارش کردند که با افزایش دوز (20 و 40 میلی‌گرم برکیلوگرم) به‌طور معنی‌دار شدت یافته بود (28).
در مطالعات متعدد علت تغییرات و ناهنجاری‌های بافتی در اثر تزریق نانولوله‌های کربن، نفوذ و تجمع آنها در اندام‌های مختلف نظیر کبد و ایجاد فشارهای اکسیداتیو نشان داده شده است؛ به‌طوری‌که، اثرات مضر ROS بر روی سلول‌ها اغلب به‌صورت آسیب DNA، اکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع در لیپیدها (پراکسیداسیون لیپیدی، اکسیداسیون اسیدهای آمینه در پروتئین‌ها و غیرفعال‌سازی آنزیم‌های خاص در اثر اکسیداسیون کوفاکتورها) گزارش شده است (14). مطالعات مختلف نشان داده‌اند نانولوله‌های کربن می‌توانند به درون سلول نفوذ کرده و موجب ایجاد اختلالات درون‌سلولی، تغییرات در اتصالات غشایی، چند بخش شدن هسته و حتی ایجاد اجسام آپوپتوزی و در نهایت، مرگ سلول شوند (29). در تحقیقات اخیر نیز مشخص شده است این نانومواد هنگام ورود به سلول‌های زنده با به کار انداختن مکانیسم‌های التهابی، همچنین ایجاد رادیکال‌های آزاد اکسیژن، به هسته و DNA سلول آسیب رسانده و موجب ایجاد سمّیت، تغییر کارکرد و در نهایت، مرگ سلولی می‌شوند (30). نوتروفیل‌ها سیستم ایمنی اندام‌ها در برابر مواد خارجی هستند که قادر به تجمع در رگ‌های بسیار ریز کبد بوده و همزمان واسطه‌های التهابی نظیر MIP-2، IL1، -TNF و PAF را افزایش می‌دهند (31،32) و مشخص شده است عادی‌ترین واسطه‌گری نوتروفیل‌ها در ایجاد پاسخ ایمنی در کبد، از طریق اتصال به هپاتوسیت‌ها بوده که باعث تشکیل ROS توسط NADPH شده و ممکن است تخریب و لیز شدن هپاتوسیت‌ها را نیز به همراه داشته باشد (31،33). در تحقیق حاضر یکی از مهم‌ترین و شایع‌ترین اختلالات بافتی کبد، به‌صورت لیز شدن هپاتوسیت‌ها مشاهده گردید. در مطالعات متعدد دیگری نیز اثرات ROS ناشی از کُنش نانوذرات با سلول‌ها به‌صورت فعال شدن سلول‌های ایمنی، اختلال در تنفس میتوکندریایی و سیستم اکسیدازی NADPH، القای تخریب و آسیب اکسیداتیو در ماکرومولکول‌های سلولی؛ از قبیل پروتئین‌ها، آنزیم‌ها، لیپیدها و DNA گزارش شده است (34)، که با توجه به تعداد و فعالیت گسترده میتوکندری‌ها و فعالیت زنجیره‌های انتقال الکترونی در هپاتوسیت‌ها، به‌نظر می‌رسد در مطالعه حاضر بخشی از آسیب‌های مشاهده‌شده در بافت و سلول‌های کبدی به دلیل اثرات سوءرادیکال‌های آزاد تولیدشده و ایجاد استرس اکسیداتیو بر این اندام باشد. همچنین نتایج پاتوفیزیولوژیک، آسیب‌های حاصل از استرس اکسیداتیو را به‌صورت تخریب غشای سلولی، پروکسیداسیون لیپیدها، دناتوره شدن پروتئین‌ها و اختلال در هموستازی کلسیم نشان داده‌اند (35)، و در برخی گزارش‌ها نیز ROS حاصل از نانولوله‌های کربن، سبب فعال شدن مسیرهای سیگنالینگ سلولی، فاکتورهای رونویسی، آزادسازی واسطه‌های سیتوکینی و آپوپتوز شده است (36)؛ حتی سمّیت ریوی نانولوله‌های کربن که در بسیاری از مطالعات به اثبات رسیده، ناشی از القا استرس اکسیداتیو به‌وسیله این نانوذرات می‌باشد (37). بنابراین به‌نظر می‌رسد مهم‌ترین عامل ایجاد اثرات سمّی و مخرب به‌وسیله نانولوله‌های کربن بر اندام‌ها، بافت‌ها و جانداران، ناشی از ایجاد استرس اکسیداتیو است که با ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی القاکننده واکنش‌های سطحی، اندازه نانوذرات، بار سطحی، ترکیب شیمیایی و حضور فلزات حدواسط در ترکیب نانولوله‌های کربن به‌عنوان ناخالصی، رابطه‌ای بسیار معنی‌دار دارد و منجر به طیف گسترده‌ای از اثرات ژنوتوکسیک، التهاب، فیبروزیس و کارسینوژنیک میشود (38)؛ لذا دلیل اطلاع از این ویژگی‌های گسترده و مؤثر بر فعالیت نانوذرات، برای طراحی و ساخت نانولوله‌های کربن دارای ایمنی زیستی، بسیار اهمیت دارد.
در مطالعات آینده لازم است فاکتورهای متعدد مربوط به استرس اکسیداتیو علاوه بر گروه‌های تیول و مالون‌دی‌آلدئید، همچنین بررسی نفوذ و تجمع نانولوله‌های کربن در بافت کبد همراه با مطالعات بافت‌شناسی در مدت زمان‌های طولانی از 144ساعت نیز بررسی گردد تا اطمینان بیشتری از اثرات سمی یا سمّیت ناچیز این نانوذرات به دست آید. همچنین ضروری است برای پایداری و ایمنی زیستی بالاتر، بر گروه‌های عاملی مورد استفاده و ویژگی‌های سطحی نانولوله‌های کربن، تمرکز بیشتری صورت گیرد.
نتیجه‌گیری
نتایج تحقیق حاضر با کاربرد دوزهای نسبتاً پایین نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار نشان داد اختلالات بافت کبد به احتمال قوی در ارتباط با افزایش معنی‌دار مالون‌دی‌آلدئید و ایجاد استرس اکسیداتیو است که حاصل تجمع احتمالی این نانوذرات در بافت کبد بوده و این اثرات تا 6 روز پس از تیمار ادامه دارد؛ با این حال با توجه به عدم مرگ‌و‌میر حیوانات در طی مدت مذکور، ممکن است با گذشت زمان بیشتر، بسیاری از اختلالات رخ داده برطرف گردد که اثبات آن نیاز به انجام مطالعات بیشتری دارد.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله نویسندگان مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، کمال تشکر را دارند.
ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی مواد می‌تواند با کاهش اندازه آنها در محدوده نانو به‌طور ناگهانی تغییر کند. کوچک شدن اندازه به‌معنای جای‌گیری و استقرار متفاوت اتم‌های سطحی بوده که این امر فیزیک و شیمی اشیا را تغییر می‌دهد (1). یک نانولوله تک‌دیواره‌ای (Single Wall Carbon Nanotube, Swcnt) با پیچیدن یک ورقه گرافن به دور خود و ایجاد یک استوانه به‌وجود می‌آید و بسته به اینکه این ورقه گرافنی در چه جهتی به‌دور خود پیچیده شود اشکال نانولوله‌های به‌وجودآمده متفاوت خواهد بود و درصورتی‌که تعداد ورقه‌های گرافن بیشتر باشد، نانولوله چنددیواره (Multi Wall Carbon Nanotube, Mwcnt) به‌وجود می‌آید (2). همچنین می‌توان فضای درون لوله‌ها را با مواد گوناگونی نظیر فلزات و برخی پروتئین‌ها پر کرد (3)، و مواد فلورسنت، آنزیم‌ها، ژن‌ها یا داروهای مختلف را در آنها جاسازی و به بافت‌ها و سلول‌های هدف هدایت کرد یا در تکنیک‌های تصویربرداری زیستی از آنها استفاده نمود (4،5). در این میان، برخی عوامل ممکن است سبب سمّیت نانولوله‌های کربن شوند؛ به‌عنوان مثال خلوص شیمیایی ماده، عامل مهمی در ایمنی زیستی نانوذرات است. نانولوله‌های کربن معمولاً دارای ناخالصی‌های فلزی ازجمله آهن، نیکل و کبالت هستند که می‌تواند بر چگونگی واکنش و پاسخ بیولوژیکی اثر بگذارد (6،7). از طرفی، شکل ذره بر رفتار جذب و جایگزینی ذره در محیط‌های بیولوژیکی از طریق اثرگذاری بر رفتار کانال‌های یونی در غشای سلول‌ها مؤثر است (8). همچنین افزایش نسبت سطح به حجم، کیفیت شیمی سطح و بارالکتریکی سطحی باعث افزایش بسیار شدید تعداد گروه‌های فعال در واحد جرم و در نتیجه، افزایش واکنش‌پذیری کلی نانولوله‌های کربن و افزایش توانایی آنها در تعاملات بیولوژیکی شده که معمولاً در سیستم گیرنده‌دهنده الکترونی اختلال ایجاد می‌کند و سبب تولید رادیکال‌های آزاد و درنتیجه ایجاد فشارهای اکسیداتیو می‌گردد (9،10). سلول‌های در معرض CNTها به دلیل القای اکسیدان‌ها دستخوش استرس اکسیداتیو می‌شوند که در پی آن با فعال کردن مسیرهای سیگنالینگ، پروتئین کیناز و سیتوکین‌های پیش‌التهابی سبب آپوپتوز و سمّیت سلولی می‌شوند (11). کاهش در بقای سلولی و سطوح افزایش‌یافته سیتوکین‌های پیش‌التهابی و اینترلوکین‌ها نشان می‌دهد MWCNTها می‌توانند سبب پاسخ التهابی در کراتینوسیت‌های انسانی در دوز 4/0 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر شوند (12). همچنین فشارهای اکسیداتیو سبب اختلال در عملکرد میتوکندری و زنجیره انتقال الکترون شده و آپوپتوز سلولی را نیز به همراه دارند (13). از مکانیسم‌های دیگر، اثر نانولوله‌های کربن بر سلول‌ها، فعل و انفعال مستقیم آنها با مواد ژنتیکی و در نتیجه آسیب در سطح DNA یا کروموزوم است (14). از تکنیک‌هایی که تاحدی سمّیت نانولوله‌های کربن و ایمنی زیستی آنها را کاهش می‌دهد، ایجاد تغییرات سطحی با افزودن گروه‌های عاملی نظیر آمونیوم، پلی‌اتیلن گلایکول، هیدروکسیل، کربوکسیل و ...، می‌باشد که سطوحی را برای اتصال انواع مختلف ماکرومولکول‌های زیستی و غیرزیستی جهت کاربرد این نانوساختارها فراهم می‌کند (15). با این وجود، در گزارش‌های متعددی به سمّیت نانولوله‌های کربن اشاره شده که معمولاً همراه با ایجاد واکنش‌های التهابی است. در این میان، سلول‌های فاگوسیتوزکننده، به‌ویژه نوتروفیل‌ها و ماکروفاژها با حضور در اکثر بافت‌های بدن قادرند نانوذرات را جذب کنند، اما اندام‌های خاصی ازجمله کبد، طحال و گره‌های لنفاوی دارای تعداد فراوانی از این سلول‌ها بوده که در نتیجه معمولاً این اندام‌ها محل تجمع انواع مختلف نانوذرات در بدن هستند (16).
در مطالعه حاضر اختلالات بافتی کبد در اثر تزریق مکرر نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار در ارتباط با ایجاد استرس اکسیداتیو در رت‌ها مورد بررسی قرار گرفت.
روش بررسی
این تحقیق به‌صورت تجربی بر روی 48 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با میانگین متوسط وزن 200 گرم (خریداری‌شده از مرکز انستیتو پاستور تهران) انجام گرفت. حیوانات در شرایط آزمایشگاهی استاندارد (دمای 25-20 درجه سانتیگراد و 12 ساعت روشنایی، 12 ساعت تاریکی) در لانه حیوانات دانشگاه آزاد فلاورجان نگهداری شدند. آزمایش‌ها با تأیید شورای پژوهشی دانشگاه و طبق دستورالعمل‌‌های اخلاقی انجمن بین‌المللی مطالعه درد در مورد حیوانات آزمایشگاهی
(International Association for Study of Pain) انجام شد (17).
ابتدا نانولوله‌های کربن چنددیواره عامل‌دارشده با گروه کربوکسیل (با قطر خارجی 20-10 نانومتر، قطر داخلی 10-5 نانومتر، طول 2-5/0 میکرومتر، درجه خلوص بالای 95% با محتوای 2% COOH وزنی و سطح ویژه 200 مترمربع برگرم) از شرکت نوترینو در تهران خریداری شد. غلظت‌های 10 و 20 میلی‌گرم برکیلوگرم وزن بدن در تویین 80% و سرم فیزیولوژیک ( نسبت 1 به 100) به‌عنوان حلال تهیه گردید ( 10). استفاده از تویین و قرار دادن مخلوط حاصل در دستگاه اولتراسونیک با دمای 4درجه سانتیگراد و دامنه 40% برای مدت 30 دقیقه، به تهیه محلول نسبتاً یکنواخت و هموژن از نانولوله‌های کربن کمک می‌کند (14).
حیوانات به‌صورت تصادفی به 6 گروه 8 تایی تقسیم شدند. گروه‌های تیمار نانولوله‌های کربن را (با دوزهای 10 و 20 میلی‌گرم برکیلوگرم) به‌صورت درون‌صفاقی و یک‌روز در میان، طی 21 مرحله دریافت کردند (دو گروه تیمار با دوز 10 میلی‌گرم برکیلوگرم و دو گروه تیمار با دوز 20 میلی‌گرم برکیلوگرم با زمان خونگیری متفاوت) و به دو گروه شاهد سرم فیزیولوژی به همراه توئین تزریق شد (13). با استناد به گزارش‌های قبلی مبنی بر عدم اثرگذاری شوک حاصل از تزریق سرم فیزیولوژیک بر حیوانات آزمایشگاهی (18)، گروه کنترل در نظر گرفته نشد و گروه شاهد با گروه‌های تجربی (گروه‌هایی که نانولوله‌های کربن دریافت کردند) مقایسه گردید. خونگیری در دو مرحله زمانی (24ساعت پس از آخرین تزریق و 144 ساعت پس از آخرین تزریق) (19) مستقیماً از قلب گروه‌های تیمار به‌طور مجزا به‌عمل آمد. حیوانات قبل از اولین تزریق و قبل از خونگیری، وزن شدند.
به‌منظور بررسی میزان فشار اکسیداتیو، غلظت گروه‌های تیول و مالون‌دی‌آلدئید در سرم خون اندازه‌گیری شد. اساس اندازه‌گیری گروه‌های تیول، واکنش گروه‌های سولفیدریل با معرف Elman DTNB) 2nitrobenzoic acid, dithiobis َ5،5) بود. ماحصل واکنش بین گروه‌های دی‌سولفیدی معرف و گروه‌های تیولی، تولید یک مول5thiobenzoate - nitro-2 به‌ازای هر مول سولفیدریل است. آنیون، نتیرو تیو بنزوات زردرنگ بوده و در طول موج 412 نانومتر دارای ماکزیمم جذب است (19).
یکی از روش‌های اندازه‌گیری پراکسیداسیون لیپیدها در سرم، اندازه‌گیری محصولات ناشی از شکسته شدن هیدروپراکسیدها، به‌ویژه آلدئیدها بوده که شامل مالون‌دی‌آلدئید نیز می‌باشد. آلدئیدهای گوناگونی ازجمله MDA (مالون‌دی‌آلدئید) با تیوباربیتوریک اسید (TBA) در PH اسیدی و دمای بالا واکنش می‌دهد. در واکنش تست TBA، یک مولکول از MDA با 2 مولکول از TBA (TBA2-MDA) با تولید رنگدانه‌های صورتی (با جذب ماکزیمم در 535-532 نانومتر)، واکنش نشان می‌دهند (20). جهت بررسی ساختار بافت کبد، از هر گروه، سه رت پس از خونگیری تشریح شد و بخشی از کبد در فرمالین 10% قرار گرفت، سپس از هر نمونه کبد، سه لام تهیه گردید (9 عدد لام از هرگروه و در مجموع 54 لام از 6 گروه مورد مطالعه) و با روش هماتوکسیلین-ائوزین رنگ‌آمیزی شدند. لام‌ها به‌وسیله میکروسکوپ نوری Olympus CX22LED مجهز به دوربین Canon Eos 760D 18 (ساخت کشور ژاپن) با بزرگنمایی 100 و 400، بررسی و از نقاط مختلف آنها عکس‌برداری شد. جهت مطالعه کیفی لام‌ها و اطمینان از نتایج حاصل از مطالعه آنها، لازم بود تعداد زیادی از مقاطع بافتی تهیه و مورد بررسی بافت‌شناسی قرار گیرد (14،18). مقاطع بافتی از نظر هیستولوژیک (وضعیت طناب‌های هپاتوسیتی، سینوزوئیدها و تجمع سلول‌های التهابی) در گروه‌های تیمار در مقایسه با گروه شاهد، بررسی شدند.
میانگین مقدار مالون‌دی‌آلدئید و گروه‌های تیول در گروه‌های تیمار و شاهد به کمک آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه و تست دانکن با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 22 مقایسه گردید. سطح معنی‌داری، 05/0p< در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
در این مطالعه، غلظت مالون‌دی‌آلدئید 24 ساعت پس از تیمار (پس از آخرین تزریق)، اختلاف معنی‌داری را در گروه‌های تیمار نسبت به گروه شاهد نشان نداد، اما پس از گذشت 144ساعت (19) در هر دو غلظت 10 و 20 میلی‌گرم برکیلوگرم، میانگین مقدار مالون‌دی‌آلدئید، افزایش معنی‌داری نشان داد (05/0p<) (جدول شماره 1).
مقدار گروه‌های تیول پلاسما با استفاده از منحنی استاندارد GSH و در طول‌موج 412 نانومتر تعیین گردید که پس از گذشت 24 ساعت از تیمار، مقدار آن تنها در دوز 10 میلی‌گرم برکیلوگرم نسبت به سایر گروه‌ها، به‌طور معنی‌داری افزایش نشان داد (05/0p<)، اما با گذشت 144ساعت (6 روز) از تیمار، مقدار گروه‌های تیول پلاسما، اختلاف معنی‌داری را بین گروه‌های مختلف نشان نداد؛ به عبارت دیگر، در دوز 10 میلی‌گرم برکیلوگرم نیز به حالت نرمال بازگشت (جدول شماره 2).
جدول شماره 1: تغییرات مقدار مالون‌دی‌آلدئید 24 و 144 ساعت پس از آخرین تزریق نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار، با استفاده از آزمون واریانس یک‌طرفه
| گروه‌ها | گروه‌های تیمار 24 ساعته | گروه‌های تیمار 144 ساعته |
| غلظت نانولوله‌های کربن (میلی‌گرم برکیلوگرم) | MDA (میکرومولار) | MDA (میکرومولار) |
| کنترل (شاهد) | 27/0±59/2 | 21/0±45/2 |
| 10 | 16/0±69/2 | *32/0±88/2 |
| 20 | 37/0±76/2 | *33/0±79/2 |
| f | 760/0 | 537/4 |
| p | 480/0 | 023/0 |
جدول شماره 2: غلظت گروه‌های تیول 24 و 144 ساعت پس از آخرین تزریق نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار، با استفاده از آزمون واریانس یک‌طرفه
| گروه‌ها | گروه‌های تیمار 24 ساعته | گروه‌های تیمار 144 ساعته |
| غلظت نانولوله‌های کربن (میلی‌گرم برکیلوگرم) | گروه‌های تیول پلاسما (میلی‌مولار) | گروه‌های تیول پلاسما (میلی‌مولار) |
| کنترل (شاهد) | 05/0±34/0 | 02/0±32/0 |
| 10 | *04/0±41/0 | 02/0±31/0 |
| 20 | 02/0±38/0 | 03/0±30/0 |
| f | 574/5 | 917/0 |
| p | 011/0 | 415/0 |
مطالعات بافت‌شناسی به‌صورت کیفی بر روی نمونه‌ها و تعداد زیادی از لام‌های تهیه‌شده از کبد گروه تیمار در مقایسه با شاهد انجام گرفت تا اطمینان از ایجاد اختلالات بافتی به دست آید (14،18). در گروه شاهد، وضعیت مورفولوژیک بافت کبد، نرمال بود. همچنین طناب‌های هپاتوسیتی و سینوزوئیدها منظم، هسته هپاتوسیت‌ها بزرگ و مشخص، سیاهرگ‌های مرکز لوبولی با دیواره‌ای سالم و فضای پورت (شامل: سرخرگ، سیاهرگ کبدی و مجرای صفراوی)، حالتی نرمال داشتند و هیچ‌گونه تراکمی از سلول‌های التهابی مشاهده نشد (شکل 3-1).
|
H-S
|
|
CV
|
شکل شماره 1: گروه شاهد: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی100. CV سیاهرگ مرکز لوبولی،
H-S هپاتوسیت‌ها و سینوزوئیدها
|
B
|
|
A
|
شکل شماره 2: گروه شاهد: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی100.
فضای پورت را نشان می‌دهد: A سرخرگ کبدی، B مجرای صفراوی.
|
CV
|
شکل شماره 3: گروه شاهد: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
وضعیت نرمال سینوزوئیدها و هپاتوسیت‌ها، سیاهرگ مرکز لوبولی با دیواره‌ای نازک (cv).
در مقاطع بافتی مربوط به غلظت 10 میلی‌گرم برکیلوگرم پس از 24 ساعت، در برخی سیاهرگ‌های مرکز لوبولی و سینوزوئیدها، احتقان یا تجمع خون دیده شد. همچنین نسبت به گروه شاهد تجمع سلول‌های التهابی (نوتروفیل‌ها و بازوفیل‌ها) و لیز شدن هپاتوسیت‌ها در برخی نقاط به‌خوبی مشهود بود (شکل شماره 5-4)
شکل شماره 4: غلظت 10 میلی‌گرم برکیلوگرم 24 ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی 100.
فلش‌ها تجمع خون در سیاهرگ مرکز لوبولی و سینوزوئیدها را نشان می‌دهد.
شکل شماره 5: غلظت 10 میلی‌گرم برکیلوگرم، 24ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
تجمع سلول‌های التهابی در فضای پورت (فلش نازک) و هپاتوسیت‌های لیزشده (فلش ضخیم).
اختلالات بافتی (شامل: تجمع شدید سلول‌های التهابی، اتساع و بی‌نظمی شدید سینوزوئیدها، لیز شدن تعداد بیشتری از هپاتوسیت‌ها) در غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم نسبت به 10 میلی‌گرم برکیلوگرم به‌طور قابل‌توجهی بیشتر بود.
همچنین تغییرات جدیدی در مقاطع بافتی این گروه به‌صورت تورم و واکوئله شدن هپاتوسیت‌ها مشاهده گردید؛ به‌طوری‌که فضاهای سینوزوئیدی ناپدید شده بود. این تغییرات معمولاً با آتروفی شدید هسته هپاتوسیت‌ها در برخی نقاط همراه بود
(شکل 8-6).
شکل شماره 6: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم، 24 ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
تجمع شدید سلول‌های التهابی در فضای پورت به‌خوبی مشهود است.
شکل شماره 7: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم، 24 ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
هپاتوسیت های لیزشده و فاقد هسته (فلش نازک) اتساع سینوزوئیدها (فلش ضخیم).
شکل شماره 8: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم، 24 ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
تورم و واکوئله شدن سیتوپلاسم هپاتوسیت‌ها (فلش ضخیم)، آتروفی هسته هپاتوسیت‌ها (فلش نازک).
سینوزوئیدها نامشخص هستند.
در اثر تزریق نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار با غلظت 10میلی‌گرم برکیلوگرم پس از گذشت 144 ساعت از آخرین تزریق، تغییرات شدیدتری در بافت کبد نسبت به گذشت زمان 24 ساعت ایجاد شد. این اختلالات علاوه بر تجمع سلول‌های التهابی، به‌صورت تخریب و لیز شدن شدیدتر هپاتوسیت‌ها بود که منجر به اتساع قابل‌توجه سینوزوئیدها گردید (شکل شماره 9). همچنین در برخی مقاطع، تورم و تشکیل واکوئل در سیتوپلاسم هپاتوسیت‌ها دیده شد که ناپدید شدن سینوزوئیدها را به همراه داشت (شکل شماره 10)، که این حالت در زمان 24ساعت پس از تیمار دیده نشد.
شکل شماره 9: غلظت 10 میلی‌گرم برکیلوگرم 144ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی 400.
هپاتوسیت‌های لیزشده (فلش نازک)، اتساع سینوزوئیدها (فلش ضخیم) و هسته‌های آتروفی‌شده (فلش سمت چپ).
شکل شماره 10: غلظت 10 میلی‌گرم برکیلوگرم 144ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
در اکثر نقاط هپاتوسیت‌های واکوئله و متورم دیده میشود (فلش) و سینوزوئیدها قابل‌مشاهده نیستند.
شدیدترین اختلالات بافتی در اثر تزریق نانولوله‌های کربن چنددیواره عامل‌دارشده با گروه کربوکسیل (با غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم) پس از گذشت 144 ساعت از آخرین تزریق مشاهده گردید. تورم و تشکیل حفره (واکوئل) در سیتوپلاسم هپاتوسیت‌ها نسبت به گروه‌های قبلی با شدت و وضوح بالاتری در تعداد بیشتری از لام‌های مورد بررسی دیده شد (شکل شماره 11).
شکل شماره 11: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم 144ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
هپاتوسیت‌های تغییریافته به‌وضوح قابل‌مشاهده است (فلش).
همچنین دژنره‌شدن و بی‌نظمی شدید طناب‌های هپاتوسیتی تنها در این گروه قابل‌تشخیص بود که منجر به تغییر مورفولوژیک معنی‌داری در بافت کبد شد (شکل شماره 12).
شکل شماره 12: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم 144ساعت پس از تزریق:
مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
بی‌نظمی و دژنره شدن شدید طناب‌های هپاتوسیتی. به تغییرات شدید مورفولوژیک توجه کنید.
در برخی مقاطع بافتی نیز تخریب و ناهنجاری در جداره سیاهرگ مرکز لوبولی علاوه بر تغییرات قبلی مشاهده گردید (شکل شماره 13).
شکل شماره 13: غلظت 20 میلی‌گرم برکیلوگرم ، 144ساعت پس از تزریق: مقطع بافت کبد با رنگ‌آمیزی H&E و بزرگنمایی400.
فلش تخریب دیواره سیاهرگ مرکز لوبولی را نشان می‌دهد.
بحث
مالون‌دی‌آلدئید، از محصولات نهایی پراکسیداسیون لیپیدی است که از آن به‌طور وسیع به‌عنوان شاخص استرس اکسیداتیو استفاده میشود (21). در مطالعه حاضر تزریق نانولوله‌های کربنی 24 ساعت پس از تیمار، بر میزان این فاکتور بی‌تأثیر بود، اما در مرحله دوم خونگیری (144 ساعت پس از آخرین تزریق)، افزایش معنی‌دار فاکتور مالون‌دی‌آلدئید در هر دو دوز 10 و 20 میلی‌گرم برکیلوگرم نسبت به گروه شاهد به دست آمد. نتایج نسبتاً مشابهی در اثر کاربرد نانولوله‌های کربن تک‌دیواره DNAدار توسط Muresan و همکاران در سال 2010 (19) و نانولوله‌های کربن چند دیواره DNAدار توسط Clichici و همکاران در سال 2012 (22)، در غلظت‌های مختلف به‌صورت افزایش مقدار MDA در ساعات مختلف پس از تیمار به دست آمد که الگوی ناپایدار و متغیر افزایش فشارهای اکسیداتیو را نشان می‌داد. همچنین در مطالعات Patlolla و همکاران در سال 2011، افزایش هیدروپراکسیدازها همراه با اثرات هپاتوتوکسیک نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار مشاهده گردید (14)، که با نتایج مطالعه حاضر همخوانی داشت. برخی مطالعات invitro نیز بر روی رده‌های مختلف سلولی، اثرات سمی وابسته به قطر و طول نانولوله‌های کربن چنددیواره را به‌صورت افزایش MDA همراه با آپوپتوز سلولی، مهار چرخه سلولی و افزایش سطح تنش‌های اکسیداتیو نشان داده‌اند (23،24). گروه‌های تیول پلاسما نیز یکی دیگر از نشانگرهای آسیب رادیکال‌های آزاد است که این عوامل به آسیب اکسیداتیو حساس بوده و در نتیجه این آسیب‌ها کاهش می‌یابند، درحالی‌که در تحقیق حاضر 24 ساعت پس از تیمار، در مقدار تیول (دوز 10) افزایش معنی‌دار و پس از 144ساعت تغییری ایجاد نشد که با نتایج مطالعه Muresan و همکاران در سال 2010 پس از گذشت 48ساعت از تیمار موش‌ها همخوانی داشت (19). در تحقیق حاضر، عدم کاهش گروه‌های تیول ممکن است به دلیل غلبه آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی بدن بر ROSتولیدشده در اثر نانولوله‌های کربن باشد.
در همین رابطه تحقیق دیگری نشان داد تجمع نانولوله‌های کربن تک‌دیواره در ریه‌ها پس از تزریق درون رگی، استرس اکسیداتیو (افزایش ROS)، اکسیداسیون لیپیدها و تشکیل MDA را همزمان با افزایش میزان GSH (یک آنتی‌اکسیدان قوی است که می‌تواند به محافظت سلول‌ها و بافت‌ها در مقابل ROS کمک کند) به همراه دارد که تأییدکننده اثرات بازدارنده آنتی‌اکسیدان‌ها هنگام افزایش فشارهای اکسیداتیو در بدن است و هنگامی‌که در اثر افزایش بیش از حد رادیکال‌های آزاد، تعادل بین سطوح MDA و GSH از بین برود، اختلالات بافتی و عملکردی در ریه‌ها آغاز میشود (25،26)؛ بنابراین در تحقیق حاضر، افزایش موقت میزان گروه‌های تیول پلاسما پس از گذشت 24 ساعت، ممکن است نشان‌دهنده تقویت سیستم آنتی‌اکسیدانی جهت محافظت سلول‌ها و بافت‌ها از اثرات ROS باشد.
در مطالعه حاضر نتایج بافت‌شناسی، تغییرات و ناهنجاری‌های قابل‌توجهی (شامل: پرخونی، تراکم سلول‌های التهابی، بی‌نظمی سینوزوئیدها، تخریب و واکوئله شدن هپاتوسیت‌ها) را در ساختار بافت کبد در گروه‌های دریافت‌کننده نانولوله‌های کربن به‌صورت وابسته به دوز و زمان نشان داد. در گزارش‌های متعدد توسط محققین مختلف نیز اختلالات نسبتاً مشابهی در اثر کاربرد نانولوله‌های کربن در ساختار بافت کبد مشاهده شده که برخی از آنها شامل: اختلالات سلول‌های کبدی، واکوئله شدن، کاریومگالی و تخریب نسبی ورید مرکزی همراه با تجمع نانولوله‌های کربن در کبد می‌باشد (14،27). همچنین Lacerda و همکاران در سال 2008، اختلالات مشابهی را در کبد حتی در دوز پایین (5 میلی‌گرم برکیلوگرم) گزارش کردند که با افزایش دوز (20 و 40 میلی‌گرم برکیلوگرم) به‌طور معنی‌دار شدت یافته بود (28).
در مطالعات متعدد علت تغییرات و ناهنجاری‌های بافتی در اثر تزریق نانولوله‌های کربن، نفوذ و تجمع آنها در اندام‌های مختلف نظیر کبد و ایجاد فشارهای اکسیداتیو نشان داده شده است؛ به‌طوری‌که، اثرات مضر ROS بر روی سلول‌ها اغلب به‌صورت آسیب DNA، اکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع در لیپیدها (پراکسیداسیون لیپیدی، اکسیداسیون اسیدهای آمینه در پروتئین‌ها و غیرفعال‌سازی آنزیم‌های خاص در اثر اکسیداسیون کوفاکتورها) گزارش شده است (14). مطالعات مختلف نشان داده‌اند نانولوله‌های کربن می‌توانند به درون سلول نفوذ کرده و موجب ایجاد اختلالات درون‌سلولی، تغییرات در اتصالات غشایی، چند بخش شدن هسته و حتی ایجاد اجسام آپوپتوزی و در نهایت، مرگ سلول شوند (29). در تحقیقات اخیر نیز مشخص شده است این نانومواد هنگام ورود به سلول‌های زنده با به کار انداختن مکانیسم‌های التهابی، همچنین ایجاد رادیکال‌های آزاد اکسیژن، به هسته و DNA سلول آسیب رسانده و موجب ایجاد سمّیت، تغییر کارکرد و در نهایت، مرگ سلولی می‌شوند (30). نوتروفیل‌ها سیستم ایمنی اندام‌ها در برابر مواد خارجی هستند که قادر به تجمع در رگ‌های بسیار ریز کبد بوده و همزمان واسطه‌های التهابی نظیر MIP-2، IL1، -TNF و PAF را افزایش می‌دهند (31،32) و مشخص شده است عادی‌ترین واسطه‌گری نوتروفیل‌ها در ایجاد پاسخ ایمنی در کبد، از طریق اتصال به هپاتوسیت‌ها بوده که باعث تشکیل ROS توسط NADPH شده و ممکن است تخریب و لیز شدن هپاتوسیت‌ها را نیز به همراه داشته باشد (31،33). در تحقیق حاضر یکی از مهم‌ترین و شایع‌ترین اختلالات بافتی کبد، به‌صورت لیز شدن هپاتوسیت‌ها مشاهده گردید. در مطالعات متعدد دیگری نیز اثرات ROS ناشی از کُنش نانوذرات با سلول‌ها به‌صورت فعال شدن سلول‌های ایمنی، اختلال در تنفس میتوکندریایی و سیستم اکسیدازی NADPH، القای تخریب و آسیب اکسیداتیو در ماکرومولکول‌های سلولی؛ از قبیل پروتئین‌ها، آنزیم‌ها، لیپیدها و DNA گزارش شده است (34)، که با توجه به تعداد و فعالیت گسترده میتوکندری‌ها و فعالیت زنجیره‌های انتقال الکترونی در هپاتوسیت‌ها، به‌نظر می‌رسد در مطالعه حاضر بخشی از آسیب‌های مشاهده‌شده در بافت و سلول‌های کبدی به دلیل اثرات سوءرادیکال‌های آزاد تولیدشده و ایجاد استرس اکسیداتیو بر این اندام باشد. همچنین نتایج پاتوفیزیولوژیک، آسیب‌های حاصل از استرس اکسیداتیو را به‌صورت تخریب غشای سلولی، پروکسیداسیون لیپیدها، دناتوره شدن پروتئین‌ها و اختلال در هموستازی کلسیم نشان داده‌اند (35)، و در برخی گزارش‌ها نیز ROS حاصل از نانولوله‌های کربن، سبب فعال شدن مسیرهای سیگنالینگ سلولی، فاکتورهای رونویسی، آزادسازی واسطه‌های سیتوکینی و آپوپتوز شده است (36)؛ حتی سمّیت ریوی نانولوله‌های کربن که در بسیاری از مطالعات به اثبات رسیده، ناشی از القا استرس اکسیداتیو به‌وسیله این نانوذرات می‌باشد (37). بنابراین به‌نظر می‌رسد مهم‌ترین عامل ایجاد اثرات سمّی و مخرب به‌وسیله نانولوله‌های کربن بر اندام‌ها، بافت‌ها و جانداران، ناشی از ایجاد استرس اکسیداتیو است که با ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی القاکننده واکنش‌های سطحی، اندازه نانوذرات، بار سطحی، ترکیب شیمیایی و حضور فلزات حدواسط در ترکیب نانولوله‌های کربن به‌عنوان ناخالصی، رابطه‌ای بسیار معنی‌دار دارد و منجر به طیف گسترده‌ای از اثرات ژنوتوکسیک، التهاب، فیبروزیس و کارسینوژنیک میشود (38)؛ لذا دلیل اطلاع از این ویژگی‌های گسترده و مؤثر بر فعالیت نانوذرات، برای طراحی و ساخت نانولوله‌های کربن دارای ایمنی زیستی، بسیار اهمیت دارد.
در مطالعات آینده لازم است فاکتورهای متعدد مربوط به استرس اکسیداتیو علاوه بر گروه‌های تیول و مالون‌دی‌آلدئید، همچنین بررسی نفوذ و تجمع نانولوله‌های کربن در بافت کبد همراه با مطالعات بافت‌شناسی در مدت زمان‌های طولانی از 144ساعت نیز بررسی گردد تا اطمینان بیشتری از اثرات سمی یا سمّیت ناچیز این نانوذرات به دست آید. همچنین ضروری است برای پایداری و ایمنی زیستی بالاتر، بر گروه‌های عاملی مورد استفاده و ویژگی‌های سطحی نانولوله‌های کربن، تمرکز بیشتری صورت گیرد.
نتیجه‌گیری
نتایج تحقیق حاضر با کاربرد دوزهای نسبتاً پایین نانولوله‌های کربن چنددیواره کربوکسیل‌دار نشان داد اختلالات بافت کبد به احتمال قوی در ارتباط با افزایش معنی‌دار مالون‌دی‌آلدئید و ایجاد استرس اکسیداتیو است که حاصل تجمع احتمالی این نانوذرات در بافت کبد بوده و این اثرات تا 6 روز پس از تیمار ادامه دارد؛ با این حال با توجه به عدم مرگ‌و‌میر حیوانات در طی مدت مذکور، ممکن است با گذشت زمان بیشتر، بسیاری از اختلالات رخ داده برطرف گردد که اثبات آن نیاز به انجام مطالعات بیشتری دارد.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله نویسندگان مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، کمال تشکر را دارند.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
علوم پایه
دریافت: 1396/12/17 | پذیرش: 1396/12/24 | انتشار: 1397/9/24
دریافت: 1396/12/17 | پذیرش: 1396/12/24 | انتشار: 1397/9/24
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
