مجله دانشگاه علوم پزشکی قم

مقدمه
سیستیک فیبروزیس (CF) یک اختلال ژنتیکی اتوزومال مغلوب است که موجب تولید مخاط غیر طبیعی در اندام‌های تنفسی، گوارشی و تناسلی می‌شود. اتصال و کلونیزه شدن برخی از باکتری‌ها روی این مخاط غلیظ و چسبنده به ویژه در راه‌های تنفسی با ایجاد عفونت‌های مزمن، بیماری‌های پیشرونده و حتی انسداد مجاری تنفسی و اغلب مرگ و میر بیماران مبتلا به سیستیک فیبروزیس همراه است (1،2). یکی از باکتری‌های مطرح در این عفونت‌ها، سودوموناس آئروژینوزا می‌باشد که با کلونیزه شدن این باکتری در راه‌های هوایی، ریشه‌کن کردن عفونت بسیار دشوار و گاهی غیر ممکن است (3). طی دوره عفونت، جدایه‌های سودوموناس آئروژینوزا تحت تأثیر برخی تغییرات ژنوتیپی و فنوتیپی عمیق قرار می‌گیرند تا از این طریق با محیط ریه CF سازگار شوند و بقای آن‌ها با به حداکثر رسیدن تنوع در جمعیت سلولی ارتقا یابد (2).
در واقع طی عفونت مزمن، عوامل استرسی شامل: سیستم ایمنی ذاتی میزبان، آنتی‌بیوتیک‌ها و رشد در یک محیط میکروآئروفیل/بی‌هوازی به انتخاب چندین فنوتیپ سودوموناس آئروژینوزا با تنوع ژنتیکی کمک می‌کند (4). قابل توجه است که غالباً فراوانی جهش‌ها و متعاقباً انتخاب تعدادی از جهش‌های سازگار در جمعیت‌های بالینی سودوموناس آئروژینوزا که با عنوان فنوتیپ‌های جهش‌یافته قوی (HPM: Hypermutators) شناخته می‌شوند، به دلیل سیستم ترمیم ناکارآمد DNA آن‌ها به سرعت در حال افزایش است (5،6). فنوتیپ‌های HPM بارها و بارها با یک نسبت بالا در مقایسه با آنچه که در عفونت‌های حاد وجود دارد، از جدایه‌های بیماران مبتلا به CF مشاهده شده و پیشنهاد می‌کند که این مکانیسم ممکن است نقش مهمی را در پاتوژنز عفونت مزمن ریه ایفا کند (4). ثابت شده است که وجود سویه‌های جهش‌یافته با نرخ بالای مقاومت آنتی‌بیوتیکی سویه‌های بالینی سودوموناس آئروژینوزای جدا شده از بیماران دارای عفونت مزمن تنفسی در ارتباط است (7،6).
تیپ‌‌بندی سویه‌های میکروبی جزء مهمی از بررسی‌های اپیدمیولوژیک بیماری‌های عفونی می‌باشد. به طور کلی، روش‌هـای تیپ‌بنـدی به دو گـروه عمـده روش‌های فـنـوتیـپـی
 
(که محصولات بیان یک ژن یا ژن‌های خاصی را جهت اهداف اپیدمیولوژیک دنبال می‌کنند و تغییرپذیری بالایی دارند) و ژنوتیپی (که مبتنی بر بررسی ساختار ژنتیکی میکروارگانیسم‌ها بوده و کمتر تحت تأثیر شرایط محیطی قرار می‌گیرند) تقسیم می‌گردند. از مزایای تیپ‌بندی ژنوتیپی می‌توان به قدرت افتراق‌دهی بالاتر، کاربرد گسترده‌تر برای انواع مختلف گونه‌های میکروبی و سرعت بالا اشاره نمود (9،8).
سودوموناس آئروژینوزا از تنوع فنوتیپی و ژنوتیپی بالایی برخوردار می‌باشد. روش‌های تیپ‌بندی ژنتیکی براساس PCR که در آن‌ها سکانس‌های حفظ شده و توالی‌های تکراری در ژنوم باکتری‌ها مورد تکثیر قرار می‌گیرند
(مانند rep-PCR (ERIC-PCR یا Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus و BOX A1R-PCR یا
BOX A1R-Based Repetitive Extragenic Palindromic) از رایج‌ترین این روش‌ها محسوب می‌شوند. در این روش‌‌ها تیپ‌بندی براساس توزیع تصادفی قطعات تکرارشونده داخل ژنوم صورت گرفته و براساس آن‌ها می‌توان ارگانیسم‌ها را از یکدیگر متمایز کرد (10). با توجه به مطالب بیان شده، مطالعه حاضر با هدف بررسی وجود سویه‌های  HPMاز سودوموناس آئروژینوزا در عفونت مزمن سیستیک فیبروزیس و مقایسه الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی و الگوی ژنتیکی این سویه‌ها با سویه‌های معمولی به روش rep-PCR انجام شد.
 
روش بررسی
جمع‌آوری و شناسایی سویه‌های میکروبی
این مطالعه به صورت توصیفی- مقطعی در ارتباط با 100 سویه سودوموناس آئروژینوزای جدا شده از مبتلایان به CF که طی سال‌های 97-1395 به آزمایشگاه پاتوبیولوژی قلهک مراجعه کرده بودند، انجام شد. به منظور شناسایی سویه‌های مورد آزمون در کنار رنگ‌آمیزی گرم و بررسی ظاهر کلنی از نظر موکوئیدی یا صاف بودن، آزمون‌های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی شامل: کشت روی محیط‌های افتراقی
EMB (Eosin Methylene Blue)، SIM (Sulfide Indole Motility)، TSI (Triple Sugar Iron) و سیمون سیترات آگـار و

آزمون‌های اکسیداز و کاتالاز به کار گرفته شد. کلیه محیط‌های کشت و مواد مصرفی در این مطالعه از شرکت Merck          (کشور آلمان) خریداری شده بودند. نمونه‌ها در محیط                 TSB (Tryptic Soy Broth) حاوی 20 درصد گلیسرول در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. شایان ذکر است که پژوهش حاضر مطابق با پروتکل کمیته اخلاق پزشکی دانشگاه ورامین با کد اخلاق IR.IAU.VARAMIN.REC.1397.027 انجام شده است.
آزمون حساسیت آنتی‌بیوتیکی
حساسیت سویه‌های میکروبی مورد بررسی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها با استفاده از روش Kirby-Bauer مطابق با استانداردهای CLSI  ارزیابی شد (11). دیسک‌های آنتی‌بیوتیک مورد استفاده از شرکت Himedia (کشور هند) خریداری شده            و حاوی سیپروفلوکساسین (5 میکروگرم)، آمیکاسین                  (30 میکروگرم)، استرپتومایسین (500 میکروگرم)، ریفامپین              (5 میکروگرم)، پیپراسیلین (10 میکروگرم)، ایمی‌پنم                                                 (10 میکروگرم)، مروپنم (10 میکروگرم)، توبرامایسین                (10 میکروگرم)، جنتامایسین (10 میکروگرم) و نورفلوکساسین (10 میکروگرم) بودند.
غربالگری جهش‌یافته‌ها

برای بررسی میزان جهش‌پذیری سویه‌ها از 15 سویه سودوموناس آئروژینوزا که به طور تصادفی انتخاب شده بودند، استفاده گردید. به طور خلاصه، کشت تازه‌ای از سویه‌ها تهیه شد و از هریک سه کلنی برای تلقیح 4 میلی‌لیتر از محیط مولر هینتون براث به کار گرفته شد. پس از رشد 24 ساعته سویه‌ها در دمای 32 درجه سانتی‌گراد، 100 میکرولیتر از رقت‌های ^6-10، ^7-10 و ^8-10 در محیط مولر هینتون آگار و 100 میکرولیتر از رقت‌های10⁰، ^1-10 و ^2-10 در محیط مولر هینتون آگار حاوی 300 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک ریفامپین (MH-Rif) با سه تکرار از هریک تلقیح شدند و در دمای 32 درجه سانتی‌گراد به ترتیب به مدت 24 و 48 ساعت گرماگذاری گردیدند. نرخ جهش از طریق محاسبه تقسیم تعداد کل جهش‌یافته‌های مقاوم به ریفامپین که از تعداد کلنی‌های ظاهر شده روی محیط MH-Rif به دست آمده بودند، بر تعـداد کـل کـلنـی‌هـای ظاهـر شـده روی محیـط غیـر انتخـابـی
 
به دست آمد. چنانچه پاسخ این تقسیم برای سویه‌ای معادل         ^7-10×2≤ محاسبه می‌شد، آن سویه جهش‌یافته قوی یا HPM، بین ^7-10×2> و ^8-10×2≤ جهش‌یافته ضعیف و ^8-10×2> غیر جهش‌یافته به شمار می رفت (12،‌8).
استخراج DNA
جهت استخراج DNA ژنومی از کیت Bioneer (کشور کره) استفاده شد. برای بررسی کمی DNA استخراج شده از روش اسپکتروفتومتری در طول موج 260 نانومتر و برای بررسی کیفی آن از الکتروفورز روی ژل 8/0 درصد آگارز استفاده گردید.
Rep-PCR (BOX A1R و ERIC)
به منظور بررسی تنوع ژنتیکی سویه‌های مورد مطالعه از دو روش PCR (BOX A1R و ERIC) استفاده گردید. توالی پرایمرهای مورد استفاده در جدول 1 قید شده است. صحت این پرایمرها پیش از PCR با استفاده از نرم‌افزارهای Gene Runner 6.5.50 و ابزار BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) مورد تأیید قرار گرفته است (13).
برای انجام هریک از فرایندهای PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر در هر محلول واکنش، 15 میکرولیتر از مخلوط آماده (Master mix)، 1 میکرولیتر از محلول پرایمر با غلظت 5 پیکومول بر میکرولیتر، 1 میکرولیتر از محلول DNA ژنومی با تراکم 40 نانوگرم بر میکرولیتر و 3 میکرولیتر آب دیونیزه به کار رفت. در این پژوهش برنامه زمانی دمایی دستگاه به صورت 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه، مرحله دوم 90 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و 49 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و مرحله تکثیر دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و در 35 سیکل صورت گرفت. پس از انجام PCR، محصولات روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شدند. پس از رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید از باندهای به دست آمده عکس‌برداری گردید.
آنالیز نتایج
در این مرحله باندهای مربوط به هر سویه با استفاده از نرم‌افزار NTSYSpc 2.0 (شرکت omicX، کشور فرانسه) مورد بررسی قرار گرفت و در نهایت دندروگرام مربوطه با استفاده از روش UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) و ضریب تشابه جاکارد رسم شد.
به منظور آنالیز آماری نتایج از نرم‌افزار IBM SPSS 23 (محصول شرکت IBM، ایالات متحده آمریکا) استفاده گردید و سطح معناداری در کلیه آزمون‌ها (05/0>‌‌P) در نظر گرفته شد.
 
یافته‌ها
در مطالعه حاضر 100 سویه سودوموناس آئروژینوزا از خلط بیماران CF مراجعه‌کننده به آزمایشگاه قلهک جداسازی شد. از 100 سویه تحت بررسی، 55 سویه از جنس مذکر و 45 سویه از جنس مؤنث جداسازی شدند. بازه سنی بیماران 1 تا 36 سال بود. این افراد به گروه‌های سنی مختلف تقسیم شدند و در ادامه، فراوانی سویه‌های جدا شده از هر گروه تعیین گردید (شکل 1). همان طور که در شکل 1 مشاهده می‌شود، فراوانی سویه‌های جدا شده با افزایش سن در بیماران کاهش می‌یابد. بیشترین سویه‌ها از گروه سنی 12-9 سال جداسازی شدند و متوسط سن بیماران 2/11 سال بود.
در این مطالعه حساسیت تمامی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا به آنتی‌بیوتیک‌های رایج به روش دیسک دیفیوژن بررسی شد. نتایج نشان دادند که اغلب سویه‌ها با فراوانی 96 درصد به آنتی‌بیوتیک ریفامپین مقاوم هستند و بیشترین میزان حساسیت مربوط به آنتی‌بیوتیک‌های استرپتومایسین (با فراوانی 96 درصد) و ایمی‌پنم و مروپنم (به ترتیب با 93 و 94 درصد) می‌باشد.          میزان مقاومت به نورفلوکساسین (NX: Norfloxacin) 33 درصد، پیپراسیلین (PIP: Piperacillin) 31 درصد، سیپروفلوکساسین (CIP: Ciprofloxacin) 24 درصد، جنتامایسین
(GEN: Gentamicin) 21 درصد، توبرامایسین
(TOB: Tobramycin) 14 درصد و آمیکاسین
(AK: Amikacin) 10 درصد بود. هیچ‌یک از سویه‌ها به آنتی‌بیوتیک‌های مورد استفاده نیمه‌حساس نبودند. در این مطالعه سویه‌های موکوئیدی و صاف در مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های مختلف با یکدیگر تفاوت معناداری نداشتند (برای کلیه آنتی‌بیوتیک‌ها مقدار 05/0>‌‌P بود).
غربالگری سویه‌های جهش‌یافته از میان 15 سویه مقاوم به آنتی‌بیوتیک که به طور تصادفی انتخاب شده بودند، نشان داد که دو سویه جهش‌یافته قوی یا HPM بودند.
 
این دو سویه که به هفت آنتی‌بیوتیک مورد استفاده مقاوم بودند، ظاهر کلنی آن‌ها صاف بود. 13 سویه باقیمانده همگی از نرخ جهش ضعیف برخوردار بودند و فقط یکی از آن‌ها کلنی موکوئیدی داشت. در این مطالعه میان مقاومت آنتی‌بیوتیکی سویه‌های جهش‌یافته ضعیف و قوی تفاوت معناداری وجود نداشت (برای تمام آنتی‌بیوتیک‌ها ( 05/0>‌‌P).
در این مطالعه جهت بررسی تنوع سویه‌ها از دو روش تیپ‌بندی ژنتیکی براساس PCR استفاده شد. در روش ERIC-PCR در مجموع 26 باند مجزا در محدوده bp 200-1250 ایجاد شد که از میان آن‌ها یک باند در تمام سویه‌ها مشترک و 25 باند متنوع بودند (شکل 2-الف). در روش BOX A1R-PCR نیز در مجموع 24 باند مجزا در محدوده bp 200-1200 ایجاد شد (شکل 2-ب).
جهت آنالیز نتایج فوق، باندهایی که دارای تکرارپذیری بالایی بودند انتخاب شده و محاسبه گردیدند. بررسی شکل‌ها و دندروگرام حاصل از ERIC-PCR نشان دادند که تمامی نمونه‌ها در نه خوشه مجزا قرار گرفتند و در این روش برای تکنیکERIC-PCR ، 49 الگو به دست آمد (شکل 3-الف). آنالیز شکل‌ها و دندروگرام حاصل از BOX A1R–PCR نیز نشان داد که تمامی نمونه‌ها در هشت خوشه مجزا قرار می‌گیرند. در این مرحله 83 الگو به دست آمد (شکل 3-ب). در هر دو دندروگرام، خوشه III بیشترین فراوانی سویه‌ها را در بین خوشه‌ها به خود اختصاص داد (جدول 2). در این مطالعه ارتباط معناداری میان مورفولوژی سویه‌ها با تیپ‌بندی ژنتیکی آن‌ها به روش‌های            BOX A1R-PCR و ERIC-PCR مشاهده نشد (به ترتیب 616/0P= و 875/0P=).
در بررسی مقاومت آنتی‌بیوتیکی خوشه‌های مختلف مشاهده گردید که در هر دو روش BOX A1R-PCR و ERIC-PCR به استثنای خوشه III (در هر دو روش)، VI (در روش ERIC) و VII (در روش BOX A1R)، سایر خوشه‌ها به آنتی‌بیوتیک ریفامپین مقاوم بودند. خوشه II حاصل از BOX A1R-PCR به آنتی‌بیوتیک‌های سیپروفلوکساسین و پیپراسیلین مقاوم بود. در خوشه‌های حاصل از ERIC-PCR، خوشه IV به آنتی‌بیوتیک‌های سیپروفلوکساسین، جنتامایسین و نورفلوکساسین، خوشه V به آنتـی‌بیوتیک‌هـای جنتـامـایسیـن و پیپـراسیلـیـن، خـوشـه VIII بـه نورفلوکساسین و خوشه IX به جنتامایسین مقاوم بودند. در مجموع، خوشه V در هر دو روش از بالاترین درصد سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک (با میانگین 45 درصد) برخوردار بود (جدول 3).
در مطالعه حاضر میان خوشه‌های حاصل از BOX A1R-PCR در مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های استرپتومایسین، ایمی‌پنم و مروپنم تفاوت معناداری وجود داشت (به ترتیب 004/0‌P=، 044/0‌P= و 012/0‌P=). میان خوشه‌های حاصل از ERIC-PCR در مقاومت به آنتی‌بیوتیک جنتامایسین تفاوت معناداری وجود داشت (009/0P=).
بر مبنای نتایج، 35 سویه (35 درصد از سویه‌ها) مقاومت چند دارویی (مقاومت به بیش از دو آنتی‌بیوتیک) داشتند؛ به نحوی که 14 سویه به سه آنتی‌بیوتیک، نه سویه به چهار آنتی‌بیوتیک، چهار سویه به پنج آنتی‌بیوتیک، چهار سویه به شش آنتی‌بیوتیک و دو سویه به هفت آنتی‌بیوتیک مورد بررسی مقاوم بودند. تنها دو سویه به تمامی 10 آنتی‌بیوتیک مورد آزمایش مقاومت داشتند که یکی از این سویه‌ها در خوشه III هر دو روش تایپینگ و دیگری در خوشه I روش BOX A1R-PCR و خوشه III روش ERIC-PCR قرار داشت.
 
بحث
عفونت مزمن تنفسی یا CRI (Chronic Respiratory Infection) با سودوموناس آئروژینوزا عامل اصلی مرگ و میر در بیماران سیستیک فیبروزیس (CF) است. استقرار سودوموناس آئروژینوزا درCRI  به واسطه یک فرایند سازگاری پیچیده است که شامل تغییرات فیزیولوژیکی ایجاد شده توسط فعال شدن مسیرهای تنظیمی خاص از جمله القای حالت بیوفیلم رشد یا بیان افتراقی ژن‌های بیماری‌زا و نیز تغییرات ژنتیکی می‌باشد که منجر به انتخاب تعداد مهمی از جهش‌های سازگار مورد نیاز برای ماندگاری طولانی مدت مانند مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها می‌شود (6). با وجود پیشرفت‌های به دست آمده در زمینه تهیه آنتی‌بیوتیک‌های ضد سودوموناسی، هنوز دوز لازم برای از بین بردن این باکتری در عفونت‌های مزمن ناشی از سودوموناس بسیار بیشتر از میزان معمول آن می‌باشد (14).
شایان ذکر است که مقاومت‌های چند دارویی این باکتری، درمان آنتی‌بیوتیکی را با شکست مواجه می‌کند (15).
نسبت بالای جهش در سویه‌های سودوموناس آئروژینوزای جدا شده از بیماران سیستیک فیبروزیس با عفونت مزمن در مقابل آنچه که در عفونت حاد مشاهده می‌شود، نشان می‌دهد که افزایش نرخ جهش و انتخاب مؤثر سویه‌های جهش‌یافته ممکن است نقش مهمی در پاتوژنز عفونت مزمن ریه داشته باشد؛ همچنین انتظار می‌رود سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا با تنوع ژنتیکی بیشتر نسبت به سویه‌های عفونت حاد ایجاد کند (4).
در این مطالعه شیوع عفونت سودوموناس آئروژینوزا در 100 سویه که طی سال‌های 97-1395 از مراجعه‌کنندگان به آزمایشگاه قلهک جداسازی شده بودند، بررسی گردید. بر مبنای نتایج، شیوع سودوموناس آئروژینوزا در مردان (55 درصد) بالاتر از زنان (45 درصد) بود. در این ارتباط، نتایج مشابهی در دیگر مطالعات نیز گزارش شده است (16،17). در پژوهش حاضر بیشترین سویه‌ها از گروه سنی 12-9 سال جداسازی شدند. متوسط سن بیماران 2/11 سال بود. نکته مهم آن بود که با افزایش سن، شیوع عفونت سودوموناس آئروژینوزا به طور معناداری در هر دو جنس کاهش می‌یافت (003/0P=) که این یافته با نتایج پژوهش Pittman و همکاران مطابقت داشت (18).
در مطالعه حاضر آنتی‌بیوتیک‌های استرپتومایسین (با فراوانی 96 درصد) و ایمی‌پنم و مروپنم (به ترتیب با 93 و 94 درصد) بیشترین اثرات ضد میکروبی را داشتند. آمیکاسین (با فراوانی 90 درصد) و توبرامایسین (با فراوانی 86 درصد) نیز در رتبه چهارم و پنجم فعالیت ضد میکروبی قرار داشتند. مشابه با این یافته‌ها، حساسیت سودوموناس آئروژینوزا به آنتی‌بیوتیک‌های ایمی‌پنم، مروپنم، آمیکاسین و توبرامایسین در بسیاری از گزارشات داخلی و خارجی دیگر قابل مشاهده است (16،20-19). نکته قابل توجه، حساسیت بالای سویه‌های مورد مطالعه به استرپتومایسین بود که تقریباً هیچ‌گاه به عنوان داروی مؤثر در درمان عفونت‌های سودوموناسی مطرح نمی‌باشد؛ زیرا این آنتی‌بیوتیک از گروه آمینوگلیکوزیدها است.
 
سودوموناس آئروژینوزا قادر است با تولید آنزیم‌های تغییردهنده آمینوگلیکوزید‌ها
(AME: Aminoglycosides Modifying Enzyme) و با اضافه کردن گروه‌های استیل، فسفات یا آدنیل به ساختار این آنتی‌بیوتیک‌ها، ساختمان و در نتیجه عملکرد آن‌ها را دستخوش تغییر قرار دهد. در مقایسه با سایر آمینوگلیکوزیدها، آمیکاسین و توبرامایسین معمولاً سوبستراهای ضعیفی برای این آنزیم‌ها هستند؛ از این رو فعالیت آنتی‌بیوتیکی بهتری را در مقابل سودوموناس آئروژینوزا ارائه می‌دهند. از سوی دیگر، تغییر در ساختار ریبوزوم که مکان هدف این آنتی‌بیوتیک‌ها است و نیز کاهش نفوذپذیری باکتری به این عوامل ضد میکروبی از دیگر عوامل مقاومت در سودوموناس آئروژینوزا به شمار می‌روند. بر این اساس و نیز به دلیل نفوذ کم آمینوگلیکوزیدها به بافت ریه، ترکیب آن‌ها با یکی از β-لاکتام‌های مهارکننده سودوموناس آئروژینوزا نظیر پیپراسیلین/تازوباکتام و یا یک کارباپنم توصیه می‌شود (21،‌22).
در این راستا در مطالعه‌ای که توسط طباطبایی و همکاران انجام شد، اثر ضد میکروبی جنتامایسین علیه سودوموناس آئروژینوزا پس از آمینوگلیکوزیدهای توبرامایسین و آمیکاسین قرار داشت که با نتایج مطالعه حاضر همراستا بود (17). نرخ حساسیت سودوموناس آئروژینوزا به سیپروفلوکساسین در بیشتر مراکز درمانی دنیا بین 57 تا 80 درصد گزارش شده است که با یافته‌های مطالعه حاضر (با فراوانی 76 درصد) همخوانی دارد (17).
در این پژوهش بالاترین میزان مقاومت آنتی‌بیوتیکی مربوط به ریفامپین با 96 درصد مقاومت بود. همسو با این یافته، گزارشات دیگر نیز به مقاومت بالا و حتی 100 صد سودوموناس آئروژینوزا به این آنتی‌بیوتیک اشاره کرده‌اند که تنها کاربرد آن در کنار آنتی‌بیوتیک‌هایی نظیر کارباپنم یا کلیستین موجب بهبود عملکرد این آنتی‌بیوتیک‌ها در مهار سویه‌های مقاوم چند دارویی         (MDR: Multiple Drug Resistance) می‌گردد (23). درصد مقاومت چند دارویی در مطالعه حاضر 35 درصد بود که حدود دو برابر میزان گزارش شده در مطالعات مشابه است (24،‌17)؛ اما در اروپا، گزارش اخیر
 ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control) (مرکـز کـنتـرل بیمـاری‌های اروپـا) کـه در سـال 2016
 
منتشـر شـد نشـان داد کـه 9/33 درصـد از سـویـه‌هـای         سودوموناس آئروژینوزا حداقل به یکی از گروه‌های ضد میکروبی تحت کاربرد (پیپراسیلین±تازوباکتام، فلوروکینولون، سفتازیدیم، آمینوگلیکوزیدها و کارباپنم‌ها) مقاوم هستند (21).
در مطالعه حاضر نرخ جهش‌پذیری سویه‌ها در 15 سویه که به طور تصادفی انتخاب شده بودند، مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده شد که دو سویه که نسبت به هفت آنتی‌بیوتیک مورد بررسی مقاومت داشتند، جهش‌یافته قوی (HPM) و 13 سویه دیگر جهش‌یافته ضعیف می‌باشند. همان طور که انتظار می‌رفت، این دو سویه HPM از نرخ بالای مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها برخوردار بودند. مشابه با پژوهش حاضر، Luts و همکاران در سال ٢٠١٣ به بررسی سویه‌های HPM از سودوموناس آئروژینوزا در بیماران CF و ارتباط آن با مقاومت ضد میکروبی پرداختند و به این نتیجه رسیدند که HPM بودن گونه‌های سودوموناس آئروژینوزا می‌تواند مقاومت دارویی را تشدید نموده و درمان را با مشکل مواجه کند (2). به طور مشابه، Montanari و همکاران در سال ٢٠٠٧ به بررسی اثرات بیولوژیکی هایپرموتاسیون در سودوموناس آئروژینوزای جدا شده از بیماران دارای CF پرداختند و به این نتیجه رسیدند که این مکانیسم ممکن است نقش مهمی در عفونت مزمن ریوی داشته باشد؛ زیرا هایپرموتاسیون ممکن است باعث افزایش احتمال تولید انواع سویه‌های سازگار شود و یک مزیت انتخابی برای باکتری در شرایط استرس‌زا مانند حضور آنتی‌بیوتیک‌ها و یا نوسانات محیطی باشد (4). در پژوهش Mandsberg و همکاران نیز در سال ٢٠٠٩ گزارش گردید که نرخ بالای جهش در برخی از سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا با افزایش احتمال مزمن شدن بیماری همراه است (25).
در این مطالعه به منظور تخمین کلی وابستگی ژنتیکی سویه‌ها از روش‌های BOX A1R-PCR و ERIC-PCR استفاده شد. نتایج حاصل از BOX A1R-PCR وجود هشت خوشه و نتایج حاصل از ERIC-PCR وجود نه خوشه را در بین سویه‌ها نشان دادند. استفاده از این دو روش که به rep-PCR معروف هستند، در بررسی تنوع ژنتیکی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا در سایر مطالعات نیز به چشم می‌خورد. Syrmis و همکاران                     در سـال ٢٠٠٤ بـه بـررسـی جـداسـازی و شنـاسـایـی سـویـه‌هـای

سودوموناس آئروژینوزای جدا شده از خلط بیماران مبتلا بهCF به روش rep-PCR پرداختند و بیان نمودند که این روش، سریع و دقیق بوده و تکرارپذیری خوبی دارد که ثابت می‌کند ابزار غربالگری قدرتمندی برای تیپ‌بندی سودوموناس آئروژینوزای جدا شده از بیماران مبتلا به CF می‌باشد (26). در مطالعه فریدی و همکاران در سال 1395 نیز تنوع ژنتیکی 67 سویه بالینی سودوموناس آئروژینوزا با روش rep-PCR مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان‌دهنده وجود هفت خوشه در بین سویه‌ها بودند (16). از سوی دیگر، خسروی و همکاران در سال 1396 تیپ‌بندی ژنتیکی 66 سویه مقاوم به آنتی‌بیوتیک سودوموناس آئروژینوزا را که از نمونه‌های عفونی زخم و سوختگی جداسازی شده بودند، به روش ERIC-PCR انجام دادند. در این مطالعه هشت خوشه به دست آمد (27).
نتایج این مطالعه نشان دادند که الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی در خوشه‌های مختلف، متفاوت است. به نحوی که میان خوشه‌های حاصل از BOX A1R-PCR در مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های استرپتومایسین، ایمی‌پنم و مروپنم (به ترتیب 004/0P=، 44/0P= و 012/0P=) و نیز میان خوشه‌های حاصل از ERIC-PCR در مقاومت به آنتی‌بیوتیک جنتامایسین تفاوت معناداری وجود داشت (009/0P=). با توجه به الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی سویه‌ها، این یافته در تأیید دقت بالای rep-PCR به ویژه BOX A1R-PCR در تیپ‌بندی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا قابل توجیه است.
همسو با این نتایج، Warren و همکاران در سال ٢٠١١ به بررسی 49 سویه سودوموناس آئروژینوزای جدا شده از ریه بیماران مبتلا به CF به روش rep-PCR پرداختند و سویه‌ها را از نظر مقـاومـت
 
 
به آنتی‌بیوتیک و نرخ جهش‌پذیری بررسی کردند و به این نتیجه رسیدند که نرخ جهش و احتمالاً انتقال افقی ژن‌ها در این سویه‌ها با توانایی آن‌ها در سازگاری با ریه بیماران مبتلا به CF ارتباط مستقیم دارد (8).
 
نتیجه‌گیری
نتایج نشان دادند که تنوع سویه‌های مورد بررسی هم در سطح فنوتیپی (الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی و شکل کلونی متفاوت) و هم در سطح ژنوتیپی (تنوع الگوی باندها ERIC-PCR و          BOX A1R-PCR) وجود دارد. با توجه به مطالعات انجام شده و نتایج به دست آمده از این پژوهش می‌توان نتیجه گرفت که سودوموناس آئروژینوزای جدا شده از بیماران CF مزمن در ایران عموماً قدرت موتاسیون دارد و احتمالاً با ایجاد جهش و نوترکیبی قادر به تطابق خود با بدن میزبان (که در این مطالعه ریه بیماران مبتلا به CF است) می‌باشد. بر مبنای نتایج می‌توان گفت که هایپرموتاسیون در سودوموناس آئروژینوزا می‌تواند مقاومت آنتی‌بیوتیکی را تشدید نموده و باعث تغییرات فنوتیپی شود. این تغییرات می‌تواند با ایجاد عفونت مزمن و حتی عفونت ثانویه در ریه بیماران مبتلا به CF همراه باشد.
 
تشکر و قدردانی
پژوهش حاضر در قالب پایان‌نامه دانشجویی کارشناسی ارشد و تحت حمایت معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین-پیشوا انجام شده است.