دوره 14، شماره 8 - ( آبان 1399 )
جلد 14 شماره 8 صفحات 70-62 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Hosseini Anvari A, Mohammad Ganji S, Ahdieh Hosseini Komeili Movahhed T. MLH1 Gene Expression and Pathologic Factors in Iranian Patients with Colorectal Cancer. Qom Univ Med Sci J 2020; 14 (8) :62-70
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-2857-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-2857-fa.html
حسینی انواری عهدیه، محمد گنجی شهلا، کمیلی موحد طاهره. بررسی ارتباط بیان ژن MLH1 و فاکتورهای پاتولوژیکی در بیماران ایرانی مبتلا به سرطان کلورکتال. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1399; 14 (8) :62-70
1- گروه ژنتیک، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم
2- گروه پزشکی مولکولی، پژوهشکده بیوتکنولوژی پزشکی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری ،shahla@nigeb.ac.ir
3- مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی قم
2- گروه پزشکی مولکولی، پژوهشکده بیوتکنولوژی پزشکی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری ،
3- مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی قم
واژههای کلیدی: بیان ژن، تعمیر ناسازگاری DNA، سرطان کلورکتال، واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی، MLH1
متن کامل [PDF 1448 kb]
(692 دریافت)
| چکیده (HTML) (2846 مشاهده)
شکل شماره 2: منحنی تکثیر مربوط به ژن MLH1
نمودار شماره 1: مقایسه میزان بیان ژن MLH1 در نمونه خون دو گروه (بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال و افراد سالم)
به سرطان نسبت به افراد نرمال، 55/0 درصد کاهش بیان داشته است (نمودار 1). این یافته با استفاده از آزمون Tمورد بررسی قرار گرفت و نشان داده شد که این کاهش معنادار است (*01/0=P).
میزان بیان ژن MLH1در هریک از مراحل مختلف بیماری سرطان در مقایسه با نمونههای کنترل به صورت جداگانه با استفاده از آزمون T بررسی گردید و نتایج در قالب جدول 2 ارائه گردید.
جدول شماره 2: آنالیز نتایج آزمون T در مراحل مختلف سرطان کلورکتال در نمونههای سرطانی نسبت به نمونههای نرمال
با توجه به نتایج به دست آمده، میزان بیان ژن MLH1 در Stage II (*02/0=P) و Stage III (*04/0=P) معنادار در نظر گرفته شد؛ بنابراین بین Stage II و Stage III سرطان کلورکتال و نمونههای کنترل، کاهش بیان معنادار بود. در این مطالعه ارتباط بین مراحل مختلف سرطان کلورکتال و بیان ژن MLH1 با استفاده از آزمون One Way ANOVA مورد بررسی قرار گرفت؛ اما نتایج معناداری به دست نیامد (05/0<P).
آنالیز آماری میزان بیان ژن MLH1 در مقایسه با شاخص T در افراد نرمال نسبت به افراد مبتلا به سرطان (نمودار 2) در مراحل T2 سطح معناداری (*04/0=P)،T3 سطح معناداری (*05/0=P) و T4 سطح معناداری (*00/0=P) را نشان داد. ارتباط میان کاهش بیان ژن MLH1 در مراحل پیشرفته رشد تومور به لایههای دیواره روده که شامل: T3، T2 و T4 میباشد، به کمک آنالیزهای آماری اثبات گردید.
همچنین آنالیز آماری میزان بیان ژن MLH1 در مقایسه با شاخص
نمودار شماره 2: میزان بیان ژن MLH1 در مراحل رشد تومور به لایههای دیواره روده (T) در افراد مبتلا به سرطان نسبت به افراد نرمال
نمودار شماره 3: میزان بیان ژن MLH1 در مراحل تهاجم به گرههای لنفاوی (N) در افراد مبتلا به سرطان نسبت به افراد نرمال
N در افراد نرمال نسبت به افراد مبتلا به سرطان (نمودار 3) در مراحل N1 سطح معناداری (*01/0=P)، N2 سطح معناداری (*02/0=P) و N3 سطح معناداری (*04/0=P) را نشان داد. ارتباط میان کاهش بیان ژن MLH1 در مراحل تهاجم به گرههای لنفاوی (N) که شامل: N1، N2 و N3 بود نیز با کمک آنالیزهای آماری اثبات گردید.
بحث
سرطان کلورکتال به دلیل شیوع بالا و همچنین نسبت بقا، یک معضل عمده در مدیریت سرطان در جهان میباشد. با توجه به اینکه طول عمر برخی از بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال به پنج سال هم نمیرسد و نیز از آنجایی که نیازهای بیماران مبتلا به سرطان در سالهای مختلف پس از تشخیص با یکدیگر متفاوت است، بررسی کاملتر سرطان کلورکتال یک نیاز حیاتی میباشد. در این میان، راهاندازی آزمونهای تشخیصی مولکولی کاملاً اختصاصی در کنار علائم بالینی میتواند کمک مؤثری برای تشخیص افراد در معرض خطر ابتلا و حتی افراد فاقد علائم بالینی باشد. براساس مطالعات صورتگرفته، نقص در پروتئینهای تعمیر عدم تطابق (dMMR) میتواند از جهشهای ژرم لاین در ژنهای MSH6، MSH2، MLH1 و PMS2 حاصل شود. مهمترین پروتئین تعمیر عدم تطابق DNA که در سرطان روده بزرگ دخیل است، MLH1 میباشد (7).
مطالعات نشان دادهاند که MLH1 به شدت با سرطان کلورکتال، مری، معده و دهانه رحم ارتباط دارد (4). با این وجود، مطالعات کمی در زمینه مکانیسم بیان و تنظیم ژن MLH1 در سرطان کلورکتال صورت گرفته است؛ بنابراین، تفسیر این مکانیسم به تشخیص بیشتر اثرات MLH1 بر وقوع و رشد سرطان کلورکتال کمک میکند که این مهم برای پیشگیری و درمان این سرطان مفید خواهد بود (14).
مطابق با تحقیقات Yu و همکاران که در سال 2016 با هدف ارزیابی بیان mRNA MLH1 در خون محیطی به عنوان بیومارکر تشخیص HNPCC (Hereditary nonpolyposis colorectal cancer) انجام شد، سطح mRNA MLH1 در 19 خانواده با فرد یا افراد مبتلا بهHNPCC با استفاده از qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) تعیین گردید. نتایج نشان دادند که سطح mRNA MLH1 در HNPCC به طور قابل توجهی پایینتر از گروه شاهد است (001/0>P). در این مطالعه سطح mRNA MLH1 دارای حساسیت 3/81 درصد و ویژگی 7/86 درصد برای تمایز HNPCC از گروه کنترل بود. یافتهها حاکی از آن بودند که سطح بیان mRNA MLH1 در خون محیطی ممکن است به عنوان یک بیومارکر برای تشخیص HNPCC مناسب باشد (15) .
Pinto و همکاران نیز در سال 2017، مؤثر بودن متیلاسیون MLH1 برای تشخیص سندروم لینچ در بیماران مبتلا به تومور با کاهش بیان MLH1 را مورد بررسی قرار دادند. در این پژوهش بیان کاهش یافته RNA در موارد متیلاسیون پروموتر MLH1 در مقایسه با گروه کنترل نشان داده شد. نتایج حاکی از آن بودند که متیلاسیون MLH1 اکثراً در بیمارانی رخ میدهد که فقط بیان پروتئین MLH1 را در تومورهایشان داشتند. علاوهبراین، این پژوهشگران شواهدی را ارائه دادند مبنی بر اینکه هایپرمتیلاسیون MLH1، مکانیسم مولکولی حدود 3 درصد از خانوادههای دارای سندروم لینچ بوده و به ویژه در بیماران مبتلا به تومورهای متعدد اولیه بدون سابقه خانوادگی، مهم گزارش شده است (16).
از سوی دیگر، گشایشی و همکاران در سال 2018 شیوع و ویژگیهای بالینی نقص در پروتئینهای MMR در سرطان روده بزرگ را در موارد شروع زودرس در مقایسه با موارد دیررس به عنوان یک مطالعه مقطعی گذشتهنگر در شمال شرق ایران انجام دادند. این پژوهشگران 321 مورد CRC و نمونه آسیبشناسی را طی سالهای 2013 تا 2016 مورد بررسی قرار دادند. آنها تومورها را با رنگآمیزی ایمونوهیستوشیمی (IHC: Immunohistochemistry) از چهار پروتئین تعمیر (MLH1، MSH2، MSH6 و PMS2) مورد آزمایش قرار دادند. نتیجه IHC بین CRC زودرس و دیررس در معرض خطر بالای سندروم لینچ معنادار نبود (17).
در پژوهش حاضر که برای نخستین بار در ایران در مورد بیان ژن MLH1 نمونه خون تازه 33 بیمار (غیر خویشاوند مبتلا به سرطان کلورکتال که با استفاده از آزمایشات بالینی و نتایج پاتولوژی برای این سرطان مثبت تشخیص داده شده بودند) و 33 فرد سالم (غیر خویشاوند با مبتلایان به سرطان کلورکتال) به صورت مورد- شاهدی و با روش Real Time PCR انجام شد، کاهش بیان ژن MLH1 در نمونههای سرطانی نسبت به بیان این ژن در نمونههای سالم معنادار بود (*01/0=P). از آنجایی که ژن MLH1 نقش کلیدی در سیستم ترمیم ناسازگاری (MMR) دارد و با توجه به مطالعات قبلی انجام شده در ارتباط با جهشهای این ژن در ایران و جهان و نیز نتایج حاصل از پژوهش حاضر استنباط میشود که سرطان کلورکتال با کاهش بیان ژن MLH1 ارتباط دارد؛ بنابراین با کاهش بیان ژن MLH1، امکان اصلاح عدم تطابق باز- باز و حلقههای حذف- اضافه ناشی از همانندسازی معیوب DNA کاهش پیدا کرده و بروز جهشها افزایش مییابد. مطابق با نتایج حاصل از آنالیزهای آماری در این مطالعه، بیان ژن MLH1 نسبت به ژن کنترل داخلی در بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال به طور چشمگیری کاهش پیدا کرده است.
نتیجهگیری
با توجه به نتایج به دست آمده، میزان بیان ژن MLH1 در Stage II (*02/0=P) و Stage III (*04/0=P) معنادار در نظر گرفته شد. همچنین آنالیز آماری میزان بیان ژن MLH1 در مقایسه با شاخص T در افراد مبتلا به سرطان نسبت به افراد سالم در مراحل T2 سطح معناداری (*04/0=P)، T3 سطح معناداری (*05/0=P) و T4 سطح معناداری (*00/0=P) را نشان داد؛ بنابراین ارتباط میان کاهش بیان ژن MLH1 در مراحل پیشرفته رشد تومور به لایههای دیواره روده که شامل: مراحل T3، T2 و T4 میشود، با کمک آنالیزهای آماری اثبات گردید.
علاوهبراین، میزان بیان ژن MLH1 در مقایسه با شاخص N در افراد مبتلا به سرطان نسبت به افراد سالم در مراحل N1 سطح معناداری (*01/0=P)، N2 سطح معناداری (*02/0=P) و N3 سطح معناداری (*00/0=P) را نشان داد. ارتباط میان کاهش بیان ژن MLH1 در مراحل تهاجم به گرههای لنفاوی (N) که شامل: مراحل N1، N2 و N3 میباشد، با کمک آنالیزهای آماری به خوبی به اثبات رسید.
با توجه به نتایج به دست آمده میتوان گفت که کاهش بیان ژن MLH1 نقش مؤثری در ایجاد سرطان کلورکتال دارد؛ اما مهمترین نکته در اهمیت این ژن، نقش آن در مراحل سرطان (Stage) و سیستم طبقهبندی TNM میباشد. فرضیه حاصل از این پژوهش بیان میکند که این ژن میتواند در مراحل بعدی مطالعات، بیشتر مورد توجه قرار بگیرد؛ زیرا این احتمال وجود دارد که در آینده نزدیک بتواند در بهبود وضعیت درمانی سرطان کلورکتال نقش مؤثری داشته باشد. همچنین به دلیل معنادار بودن نتایج لازم است پژوهشی مشابه با تعداد نمونه بیشتر انجام شود و پارامترهای کلینیکی و بالینی دیگر مورد بررسی قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم میدانند از همکاری ارزشمند "انستیتو کنسرو بیمارستان امام خمینی(ره)" به دلیل تأمین بخشی از نمونههای بیماران و نیز از کارکنان محترم مرکز تحقیقات سلولی- مولکولی دانشگاه علوم پزشکی قم قدردانی نمایند.
References:
متن کامل: (2658 مشاهده)
مقدمه
سرطان کلورکتال (CRC) یکی از رایجترین انواع سرطان است که 23/1 میلیون نفر (7/9 درصد از کل سرطانها) را در سال درگیر میکند و چهارمین علت مرگ ناشی از سرطان در سراسر جهان میباشد. در مردان و زنان تقریباً 3/4 درصد خطر CRC وجود دارد (1). میزان بروز CRC در بیشتر کشورهای خاورمیانه 50-30 مورد و در شمال آمریکا و اروپا 7-3 مورد (در صد هزار نفر) برآورد شده است. گزارش سالانه مرکز ثبت ملی سرطان ایران (INCR: National Cancer Registry in Iran) نشان میدهد که CRC چهارمین سرطان شایع در مردان پس از معده، مثانه و پروستات بوده و دومین سرطان شایع در زنان پس از سرطان پستان محسوب میشود. مطالعات اپیدمیولوژی، بالاترین میزان بروز CRC در ایران را در استانهای مرکزی، شمالی و غربی گزارش نمودهاند؛ در حالی که استانهای جنوب شرقی ایران کمترین میزان بروز CRC را داشتهاند (2).
عوامل متعددی مانند سن، سابقه خانوادگی و رژیم غذایی در بروز CRC مؤثر هستند (1). بنا بر طبقهبندی WHO (World Health Organization) در مورد تومورهای سیستم گوارش، عوامل زیر نقش اتیولوژیکی در پیشرفت CRC دارند: فاکتورهای تغییرناپذیر همچون سندروم فامیلی، سن بالای 51 سال، داشتن پولیپ و سابقه ابتلا به بیماریهای التهابی روده و سرطانهای دیگر مانند سرطان رحم و پستان و نیز فاکتورهای تغییرپذیر مانند عادات تغذیهای بد، عدم تحرک، چاقی، مصرف سیگار، مصرف الکل، درمانهای جایگزین هورمونی، داروهای ضد التهاب غیر استروئیدی (2).
ناپایداری کروموزومی (CIN: Chromosomal instability)، ناپایداری ریز ماهوارهای (MSI: Microsatellite instability) و فنوتیپ متیلاتور جزایر غنی از CpG (CIMP: CpG Island Methylator Phenotype) نقش مهمی در تومورزایی CRC دارند (3،4). براساس مطالعات، نزدیک به 250 جهش مختلف در بیماران مبتلا به CRC شناسایی شده است که تقریباً معادل 55 درصد از این جهشهای شناخته شده مربوط به ژنهای MMR (Mismatch repair) میباشد (5). نقص در پروتئینهای تعمیر ناسازگاری (dMMR: Deficient mismatch repair) میتواند در پی جهشهای ژرم لاین در ژنهای MLH1، MSH6 (MutS Homolog)، MSH2 و PMS2(Post-meiotic segregation) حاصل شودکه حدود 90 درصد از این جهشها در دو ژن MLH1 و MSH2 یافت میشود (6). مهمترین پروتئین سیستم MMR که معمولاً در سرطان روده بزرگ دخیل است، MLH1 میباشد (7،8). مطالعات اخیر نشان دادهاند که هرگونه تغییر در بیان ژن MLH1 ممکن است خطر CRC را افزایش دهد (9). ژنMLH1 همولوگ انسانی، ژن ترمیم جفت بازهای غیر مکملE.coli (Escherichia coli) به نام MutL میباشد (10). جهشهای ژرم لاین در MLH1 مسئول 50 درصد از یک نوع ارثی از CRC به نام سندرم لینچ است. علاوهبراین، 15-13 درصد از CRCپراکنده ناشی از کمبود MLH1 براساس هایپر متیلیشن پروموتر سوماتیک میباشد (7).
ژن MLH1 روی بازوی کوتاه کروموزوم 3 در موقعیت 2.22 قرار داشته و حاوی 21 اگزون است. پروتئین کدگذاری شده توسط ژن MLH1 میتواند با اندونوکلئاز دخیل در تعمیر میسمچ به نام PMS2 به منظور ایجادMutLα که بخشی از سیستم MMR است، همکاری کند (11).MutLα به طور عمده در ترمیم عدم تطابقات باز- باز و لوپهای حذف و اضافه در نتیجه تکثیرهای ناقص DNA نقش دارد. علاوهبراین، پروتئین کدگذاری شده در سیگنالینگ آسیب DNA دخیل بوده و میتواند با پروتئین MLH3 که در ترمیم عدم تطابق DNA دخالت دارد، به فرم ɣMutL تبدیل شود که در میوز مشاهده میگردد. مطالعات نشان میدهند که MLH1 در سایر فعالیتهای اصلی سلولی از جمله تنظیم نقاط بازرسی چرخه سلولی و آپوپتوز، نوترکیبی متقاطع و ناسازگاری میتوز نقش دارد (7،12). با توجه به نقش مهم ژن MLH1 و بررسی مطالعات انجامشده در دهههای اخیر که با تجزیه تحلیل مولکولی توسط پروفایلینگ بیان mRNA، سرطانها را با دقت بالاتری طبقهبندی کرده است (13)، پژوهش حاضر با هدف بررسی کمی بیان ژن MLH1 به روش غیر تهاجمی از نمونه خون محیطی بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال با استفاده از روش Real time PCR و بررسی ارتباط آن با فاکتورهای پاتولوژیکی مراحل پیشرفت تومور به لایههای دیواره روده (T) و مراحل تهاجم به گرههای لنفاوی (N) در تعدادی از بیماران ایرانی مبتلا بهCRC انجام شد تا از این طریق بتوان تغییرات کمی بیانی ژن هدف را به عنوان بیومارکر جهت غربالگری، پیشآگهی و تشخیصCRC در نمونه خون محیطی مورد استفاده قرار داد.
روش بررسی
جمعآوری نمونه
مطالعه حاضر یک تحقیق بنیادی از نوع مورد_ شاهدی میباشد. بهمنظور انجام این تحقیق کد اخلاق (IR.IAU.QOM.REC.
1397.017) از کمیته اخلاق در پژوهشهای زیست پزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم اخذ گردید. سپس نمونهگیری با حجم نمونه 33 نفر بیمار مبتلا به سرطان کلورکتال و 33 فرد سالم انجام شد. نمونهها پس از تشخیص، اخذ پرسشنامه و کسب رضایت آگاهانه، قبل از استفاده از هر نوع دارو و یا درمان توسط پزشک جراح جمعآوری شدند. بیماران با تومور سکوم، کولون صعودی، عرضی و نزولی و رکتوسیگموئیدی به عنوان تومور کلورکتال در نظر گرفته شدند و مبتلایان به انواع دیگر سرطان از ادامه مطالعه کنار گذاشته شدند.
در این مطالعه 14 زن (5/42 درصد) و 19 مرد (5/57 درصد) با میانگین سنی 55 سال (محدوده سنی 79-28 سال) که از مراجعهکنندگان به بیمارستان "گلپایگانی" قم و "کلینیک تخصصی صدرا" طی سالهای 98-1397 بودند، مورد بررسی قرار گرفتند. در این مطالعه فاکتورهای ریسک بالینی براساس سیستم مرحلهبندی توده سرطان، سایز تومور و تهاجم به اعضای مجاور (TNM) دستهبندی شد. مراحل مختلف سرطان نیز براساس اطلاعات موجود در پرونده پاتولوژی بیماران به گروههای (مرحله 0–IV) تقسیمبندی گردید. همچنین میزان رشد و پیشروی تومور در لایههای دیواره روده (شاخص T) به چهار گروه مجزا (T0–TX، T1–4) و تهاجم به گرههای لنفاوی (شاخص N) به چهار گروه (NX–N0، N1–3)تقسیم شد.
استخراج RNA و سنتز cDNA
5 میلیلیتر خون محیطی تازه به ویال حاوی محلول EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) نیم مولار (10 درصد) اضافه شد و با حفظ شرایط زنجیره سرما به آزمایشگاه منتقل گردید. استخراج RNA از نمونهها طبق پروتکل کیت
(#Cat 17061، Intron Biotechnology Co) صورت گرفت. به منظور تعیین خلوص RNA استخراج شده در دستگاه Nano Drop One نسبت جذب نوری A260/A280 خوانده شد و نمونههایی که بهترین جذب نوری را در بازه 2-8/1 داشتند، انتخاب شدند. به منظور بررسی کیفیت مناسب از الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد استفاده گردید. در انتها RNA استخراج شده در فریزری با دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری گردید تا مراحل بعدی پژوهش روی آن انجام شود.
ساخت cDNA توسط کیت cDNA synthesis (محصول شرکت یکتا تجهیز آزما) روی RNA استخراج شده مطابق با دستورالعمل موجود درکیت به صورت زیر انجام شد: 1 میکرولیتر از پرایمرهای 18 (dT) Oligo و Random Hexamer به 5/0 میکرولیتر RNA استخراج شده اضافه گردید و با افزودن مقدار مناسب آب DEPC (Diethyl pyrocarbonate) به حجم نهایی دست یافته شد. در ادامه، نمونهها به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. سپس به هرکدام از نمونهها
مواد زیر افزوده شد: 4 میکرولیتر first-strand Buffer 5X،
5/0 میکرولیتر RNasein و 1 میکرولیتر (10 میلیمتر) dNTPs. میکروتیوپ به منظور ساخت cDNA، به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس به منظور توقف فعالیت آنزیم RT، به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد. در انتها، cDNA ساخته شده جهت انجام مراحل تحقیقاتی بعدی در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
طراحی پرایمر
با استفاده از نرمافزار Oligo 7و سایتهای آنلاین Ensemble و UCSC، Primer3 به صورتExon-Exon Junction طراحی شد. در ادامه برای تأیید نهایی، پرایمرها در پایگاههای داده BLAST NCBI بررسی گشته و تأیید شدند (جدول 1).
Real time PCR
به منظور انجام واکنش Real Time PCR از دستگاه Step One Plus Applied Biosystems و روش SYBER GREEN استفاده
سرطان کلورکتال (CRC) یکی از رایجترین انواع سرطان است که 23/1 میلیون نفر (7/9 درصد از کل سرطانها) را در سال درگیر میکند و چهارمین علت مرگ ناشی از سرطان در سراسر جهان میباشد. در مردان و زنان تقریباً 3/4 درصد خطر CRC وجود دارد (1). میزان بروز CRC در بیشتر کشورهای خاورمیانه 50-30 مورد و در شمال آمریکا و اروپا 7-3 مورد (در صد هزار نفر) برآورد شده است. گزارش سالانه مرکز ثبت ملی سرطان ایران (INCR: National Cancer Registry in Iran) نشان میدهد که CRC چهارمین سرطان شایع در مردان پس از معده، مثانه و پروستات بوده و دومین سرطان شایع در زنان پس از سرطان پستان محسوب میشود. مطالعات اپیدمیولوژی، بالاترین میزان بروز CRC در ایران را در استانهای مرکزی، شمالی و غربی گزارش نمودهاند؛ در حالی که استانهای جنوب شرقی ایران کمترین میزان بروز CRC را داشتهاند (2).
عوامل متعددی مانند سن، سابقه خانوادگی و رژیم غذایی در بروز CRC مؤثر هستند (1). بنا بر طبقهبندی WHO (World Health Organization) در مورد تومورهای سیستم گوارش، عوامل زیر نقش اتیولوژیکی در پیشرفت CRC دارند: فاکتورهای تغییرناپذیر همچون سندروم فامیلی، سن بالای 51 سال، داشتن پولیپ و سابقه ابتلا به بیماریهای التهابی روده و سرطانهای دیگر مانند سرطان رحم و پستان و نیز فاکتورهای تغییرپذیر مانند عادات تغذیهای بد، عدم تحرک، چاقی، مصرف سیگار، مصرف الکل، درمانهای جایگزین هورمونی، داروهای ضد التهاب غیر استروئیدی (2).
ناپایداری کروموزومی (CIN: Chromosomal instability)، ناپایداری ریز ماهوارهای (MSI: Microsatellite instability) و فنوتیپ متیلاتور جزایر غنی از CpG (CIMP: CpG Island Methylator Phenotype) نقش مهمی در تومورزایی CRC دارند (3،4). براساس مطالعات، نزدیک به 250 جهش مختلف در بیماران مبتلا به CRC شناسایی شده است که تقریباً معادل 55 درصد از این جهشهای شناخته شده مربوط به ژنهای MMR (Mismatch repair) میباشد (5). نقص در پروتئینهای تعمیر ناسازگاری (dMMR: Deficient mismatch repair) میتواند در پی جهشهای ژرم لاین در ژنهای MLH1، MSH6 (MutS Homolog)، MSH2 و PMS2(Post-meiotic segregation) حاصل شودکه حدود 90 درصد از این جهشها در دو ژن MLH1 و MSH2 یافت میشود (6). مهمترین پروتئین سیستم MMR که معمولاً در سرطان روده بزرگ دخیل است، MLH1 میباشد (7،8). مطالعات اخیر نشان دادهاند که هرگونه تغییر در بیان ژن MLH1 ممکن است خطر CRC را افزایش دهد (9). ژنMLH1 همولوگ انسانی، ژن ترمیم جفت بازهای غیر مکملE.coli (Escherichia coli) به نام MutL میباشد (10). جهشهای ژرم لاین در MLH1 مسئول 50 درصد از یک نوع ارثی از CRC به نام سندرم لینچ است. علاوهبراین، 15-13 درصد از CRCپراکنده ناشی از کمبود MLH1 براساس هایپر متیلیشن پروموتر سوماتیک میباشد (7).
ژن MLH1 روی بازوی کوتاه کروموزوم 3 در موقعیت 2.22 قرار داشته و حاوی 21 اگزون است. پروتئین کدگذاری شده توسط ژن MLH1 میتواند با اندونوکلئاز دخیل در تعمیر میسمچ به نام PMS2 به منظور ایجادMutLα که بخشی از سیستم MMR است، همکاری کند (11).MutLα به طور عمده در ترمیم عدم تطابقات باز- باز و لوپهای حذف و اضافه در نتیجه تکثیرهای ناقص DNA نقش دارد. علاوهبراین، پروتئین کدگذاری شده در سیگنالینگ آسیب DNA دخیل بوده و میتواند با پروتئین MLH3 که در ترمیم عدم تطابق DNA دخالت دارد، به فرم ɣMutL تبدیل شود که در میوز مشاهده میگردد. مطالعات نشان میدهند که MLH1 در سایر فعالیتهای اصلی سلولی از جمله تنظیم نقاط بازرسی چرخه سلولی و آپوپتوز، نوترکیبی متقاطع و ناسازگاری میتوز نقش دارد (7،12). با توجه به نقش مهم ژن MLH1 و بررسی مطالعات انجامشده در دهههای اخیر که با تجزیه تحلیل مولکولی توسط پروفایلینگ بیان mRNA، سرطانها را با دقت بالاتری طبقهبندی کرده است (13)، پژوهش حاضر با هدف بررسی کمی بیان ژن MLH1 به روش غیر تهاجمی از نمونه خون محیطی بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال با استفاده از روش Real time PCR و بررسی ارتباط آن با فاکتورهای پاتولوژیکی مراحل پیشرفت تومور به لایههای دیواره روده (T) و مراحل تهاجم به گرههای لنفاوی (N) در تعدادی از بیماران ایرانی مبتلا بهCRC انجام شد تا از این طریق بتوان تغییرات کمی بیانی ژن هدف را به عنوان بیومارکر جهت غربالگری، پیشآگهی و تشخیصCRC در نمونه خون محیطی مورد استفاده قرار داد.
روش بررسی
جمعآوری نمونه
مطالعه حاضر یک تحقیق بنیادی از نوع مورد_ شاهدی میباشد. بهمنظور انجام این تحقیق کد اخلاق (IR.IAU.QOM.REC.
1397.017) از کمیته اخلاق در پژوهشهای زیست پزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم اخذ گردید. سپس نمونهگیری با حجم نمونه 33 نفر بیمار مبتلا به سرطان کلورکتال و 33 فرد سالم انجام شد. نمونهها پس از تشخیص، اخذ پرسشنامه و کسب رضایت آگاهانه، قبل از استفاده از هر نوع دارو و یا درمان توسط پزشک جراح جمعآوری شدند. بیماران با تومور سکوم، کولون صعودی، عرضی و نزولی و رکتوسیگموئیدی به عنوان تومور کلورکتال در نظر گرفته شدند و مبتلایان به انواع دیگر سرطان از ادامه مطالعه کنار گذاشته شدند.
در این مطالعه 14 زن (5/42 درصد) و 19 مرد (5/57 درصد) با میانگین سنی 55 سال (محدوده سنی 79-28 سال) که از مراجعهکنندگان به بیمارستان "گلپایگانی" قم و "کلینیک تخصصی صدرا" طی سالهای 98-1397 بودند، مورد بررسی قرار گرفتند. در این مطالعه فاکتورهای ریسک بالینی براساس سیستم مرحلهبندی توده سرطان، سایز تومور و تهاجم به اعضای مجاور (TNM) دستهبندی شد. مراحل مختلف سرطان نیز براساس اطلاعات موجود در پرونده پاتولوژی بیماران به گروههای (مرحله 0–IV) تقسیمبندی گردید. همچنین میزان رشد و پیشروی تومور در لایههای دیواره روده (شاخص T) به چهار گروه مجزا (T0–TX، T1–4) و تهاجم به گرههای لنفاوی (شاخص N) به چهار گروه (NX–N0، N1–3)تقسیم شد.
استخراج RNA و سنتز cDNA
5 میلیلیتر خون محیطی تازه به ویال حاوی محلول EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) نیم مولار (10 درصد) اضافه شد و با حفظ شرایط زنجیره سرما به آزمایشگاه منتقل گردید. استخراج RNA از نمونهها طبق پروتکل کیت
(#Cat 17061، Intron Biotechnology Co) صورت گرفت. به منظور تعیین خلوص RNA استخراج شده در دستگاه Nano Drop One نسبت جذب نوری A260/A280 خوانده شد و نمونههایی که بهترین جذب نوری را در بازه 2-8/1 داشتند، انتخاب شدند. به منظور بررسی کیفیت مناسب از الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد استفاده گردید. در انتها RNA استخراج شده در فریزری با دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری گردید تا مراحل بعدی پژوهش روی آن انجام شود.
ساخت cDNA توسط کیت cDNA synthesis (محصول شرکت یکتا تجهیز آزما) روی RNA استخراج شده مطابق با دستورالعمل موجود درکیت به صورت زیر انجام شد: 1 میکرولیتر از پرایمرهای 18 (dT) Oligo و Random Hexamer به 5/0 میکرولیتر RNA استخراج شده اضافه گردید و با افزودن مقدار مناسب آب DEPC (Diethyl pyrocarbonate) به حجم نهایی دست یافته شد. در ادامه، نمونهها به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. سپس به هرکدام از نمونهها
مواد زیر افزوده شد: 4 میکرولیتر first-strand Buffer 5X،
5/0 میکرولیتر RNasein و 1 میکرولیتر (10 میلیمتر) dNTPs. میکروتیوپ به منظور ساخت cDNA، به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس به منظور توقف فعالیت آنزیم RT، به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد. در انتها، cDNA ساخته شده جهت انجام مراحل تحقیقاتی بعدی در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
طراحی پرایمر
با استفاده از نرمافزار Oligo 7و سایتهای آنلاین Ensemble و UCSC، Primer3 به صورتExon-Exon Junction طراحی شد. در ادامه برای تأیید نهایی، پرایمرها در پایگاههای داده BLAST NCBI بررسی گشته و تأیید شدند (جدول 1).
Real time PCR
به منظور انجام واکنش Real Time PCR از دستگاه Step One Plus Applied Biosystems و روش SYBER GREEN استفاده
جدول شماره 1: توالی پرایمرهای طراحی شده و طول محصول حاصل از واکنش PCR برای ژن هدف (MLH1) و ژن کنترل داخلی (B-actin)
| طول محصول PCR | Sequence 5----3 | پرایمر |
| 214 bp | AAG GAA ATG ACT GCA GCT TGT AC | MLH1 Forward Primer |
| GTT CTT CAC TAA GCT TGG TGG TG | MLH1 Revers Primer | |
| 161 bp | GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC | B actin Forward Primer |
| AGA CGC AGG ATG GCA TGG G | B actin Revers Primer |
گردید. در این مطالعه بهینهسازی واکنش Real Time PCR طی 45 سیکل و در سه مرحله به صورت زیر انجام شد: ابتدا مرحله واسرشتهسازی (Denaturation) در دمای 95 درجه به مدت 20 ثانیه انجام شد. سپس مرحله اتصال (Annealing) در دمای 54 درجه به مدت 30 ثانیه و مرحله بسط رشته (Extension) در دمای 72 درجه به مدت 30 ثانیه صورت گرفت. از ژن β-actin به عنوان ژن کنترل داخلی برای تمام نمونههای سالم و بیمار استفاده شد. طی انجام واکنش Real Time PCR برای ژنهای موجود در پژوهش، در هر دو گروه بیمار و سالم یک کنترل منفی (میکروتیوب حاوی master mix و پرایمرها؛ اما فاقد cDNA) منظور شد تا از صحت واکنش و عدم آلودگی با هرگونه DNA خارجی اطمینان حاصل گردد. در پژوهش حاضر روش Real Time PCR همرا با نرمالیزاسیون انجام شد. باید خاطرنشان ساخت که برای اطمینان از صحت دادههای ارائه شده توسط دستگاه، تمام واکنشهای
Real Time PCR موجود در پروژه سه بار تکرار گردیدند.
آنالیز دادهها
آنالیز نهایی به کمک نرمافزار Rest 2009 صورت گرفت. همچنین از نرمافزار SPSS 22و آزمون آماری Kolmogorov–Smirnov برای بررسی نرمال بودن دادهها و از آزمون T برای بررسی بیان ژن MLH1و ارتباط آن با فاکتورهای T وN استفاده گردید. علاوهبراین، بررسی میزان تغییرات بیان ژنهای مورد مطالعه در این پژوهش نسبت به گروه کنترل با استفاده از روش Fold change یا (2- ΔΔCt) صورت گرفت. آنالیزها به صورت relative بین ژن مورد نظر و ژن مرجع انجام شدند و (05/0P<) به عنوان سطح معناداری در نظر گرفته شد.
شکل شماره 1: منحنی ذوب مربوط به ژن MLH1
(5/42 درصد) و 19 مرد (5/57 درصد) با میانگین سنی 55 سال (محدوده سنی 79-28 سال) بررسی شدند.
به منظور بررسی اختصاصیت پرایمرها، کیفیت رنگ فلورسنت سایبرگرین، اطمینان از تکثیر قطعات اختصاصی و بررسی عدم وجود قطعات غیر اختصاصی و پرایمر دایمر، نمودار منحنی ذوب (شکل 1) برای محصول به صورت جداگانه توسط دستگاه برای ژنهای MLH1و B-actin رسم شد و تک قلهای بودن منحنیها بررسی گردید.
بررسی منحنیهای تکثیر (شکل 2) و ذوب نشاندهنده تکثیرنمایی قطعه مورد نظر با منحنی ذوب واحد میباشند.
پس از انجام واکنش تکثیر، ct نمونهها با استفاده از دستگاه محاسبه شد و اندازهگیری میزان بیان ژن با روش -ΔΔCt 2 محاسبه گردید. مطابق با نتایج به دست آمده، بیان ژن هدف نسبت به ژن کنترل داخلی در بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال کاهش پیدا کرده است. به عبارت دیگر، میزان بیان ژن MLH1 در افراد مبتلا
Real Time PCR موجود در پروژه سه بار تکرار گردیدند.
آنالیز دادهها
آنالیز نهایی به کمک نرمافزار Rest 2009 صورت گرفت. همچنین از نرمافزار SPSS 22و آزمون آماری Kolmogorov–Smirnov برای بررسی نرمال بودن دادهها و از آزمون T برای بررسی بیان ژن MLH1و ارتباط آن با فاکتورهای T وN استفاده گردید. علاوهبراین، بررسی میزان تغییرات بیان ژنهای مورد مطالعه در این پژوهش نسبت به گروه کنترل با استفاده از روش Fold change یا (2- ΔΔCt) صورت گرفت. آنالیزها به صورت relative بین ژن مورد نظر و ژن مرجع انجام شدند و (05/0P<) به عنوان سطح معناداری در نظر گرفته شد.
شکل شماره 1: منحنی ذوب مربوط به ژن MLH1
(5/42 درصد) و 19 مرد (5/57 درصد) با میانگین سنی 55 سال (محدوده سنی 79-28 سال) بررسی شدند.
به منظور بررسی اختصاصیت پرایمرها، کیفیت رنگ فلورسنت سایبرگرین، اطمینان از تکثیر قطعات اختصاصی و بررسی عدم وجود قطعات غیر اختصاصی و پرایمر دایمر، نمودار منحنی ذوب (شکل 1) برای محصول به صورت جداگانه توسط دستگاه برای ژنهای MLH1و B-actin رسم شد و تک قلهای بودن منحنیها بررسی گردید.
بررسی منحنیهای تکثیر (شکل 2) و ذوب نشاندهنده تکثیرنمایی قطعه مورد نظر با منحنی ذوب واحد میباشند.
پس از انجام واکنش تکثیر، ct نمونهها با استفاده از دستگاه محاسبه شد و اندازهگیری میزان بیان ژن با روش -ΔΔCt 2 محاسبه گردید. مطابق با نتایج به دست آمده، بیان ژن هدف نسبت به ژن کنترل داخلی در بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال کاهش پیدا کرده است. به عبارت دیگر، میزان بیان ژن MLH1 در افراد مبتلا
شکل شماره 2: منحنی تکثیر مربوط به ژن MLH1
نمودار شماره 1: مقایسه میزان بیان ژن MLH1 در نمونه خون دو گروه (بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال و افراد سالم)
به سرطان نسبت به افراد نرمال، 55/0 درصد کاهش بیان داشته است (نمودار 1). این یافته با استفاده از آزمون Tمورد بررسی قرار گرفت و نشان داده شد که این کاهش معنادار است (*01/0=P).
میزان بیان ژن MLH1در هریک از مراحل مختلف بیماری سرطان در مقایسه با نمونههای کنترل به صورت جداگانه با استفاده از آزمون T بررسی گردید و نتایج در قالب جدول 2 ارائه گردید.
جدول شماره 2: آنالیز نتایج آزمون T در مراحل مختلف سرطان کلورکتال در نمونههای سرطانی نسبت به نمونههای نرمال
| سطح معناداری | Foldchange | تفکیک مراحل سرطان | |
| افزایشیافته | کاهشیافته | ||
| 22/0 | - | 9/1 | Stage 0 |
| 19/0 | - | 8/1 | Stage I |
| *02/0 | - | 5/2 | Stage II |
| *04/0 | - | 1/9 | Stage III |
| 23/0 | - | 6/1 | Stage IV |
آنالیز آماری میزان بیان ژن MLH1 در مقایسه با شاخص T در افراد نرمال نسبت به افراد مبتلا به سرطان (نمودار 2) در مراحل T2 سطح معناداری (*04/0=P)،T3 سطح معناداری (*05/0=P) و T4 سطح معناداری (*00/0=P) را نشان داد. ارتباط میان کاهش بیان ژن MLH1 در مراحل پیشرفته رشد تومور به لایههای دیواره روده که شامل: T3، T2 و T4 میباشد، به کمک آنالیزهای آماری اثبات گردید.
همچنین آنالیز آماری میزان بیان ژن MLH1 در مقایسه با شاخص
نمودار شماره 2: میزان بیان ژن MLH1 در مراحل رشد تومور به لایههای دیواره روده (T) در افراد مبتلا به سرطان نسبت به افراد نرمال
نمودار شماره 3: میزان بیان ژن MLH1 در مراحل تهاجم به گرههای لنفاوی (N) در افراد مبتلا به سرطان نسبت به افراد نرمال
N در افراد نرمال نسبت به افراد مبتلا به سرطان (نمودار 3) در مراحل N1 سطح معناداری (*01/0=P)، N2 سطح معناداری (*02/0=P) و N3 سطح معناداری (*04/0=P) را نشان داد. ارتباط میان کاهش بیان ژن MLH1 در مراحل تهاجم به گرههای لنفاوی (N) که شامل: N1، N2 و N3 بود نیز با کمک آنالیزهای آماری اثبات گردید.
بحث
سرطان کلورکتال به دلیل شیوع بالا و همچنین نسبت بقا، یک معضل عمده در مدیریت سرطان در جهان میباشد. با توجه به اینکه طول عمر برخی از بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال به پنج سال هم نمیرسد و نیز از آنجایی که نیازهای بیماران مبتلا به سرطان در سالهای مختلف پس از تشخیص با یکدیگر متفاوت است، بررسی کاملتر سرطان کلورکتال یک نیاز حیاتی میباشد. در این میان، راهاندازی آزمونهای تشخیصی مولکولی کاملاً اختصاصی در کنار علائم بالینی میتواند کمک مؤثری برای تشخیص افراد در معرض خطر ابتلا و حتی افراد فاقد علائم بالینی باشد. براساس مطالعات صورتگرفته، نقص در پروتئینهای تعمیر عدم تطابق (dMMR) میتواند از جهشهای ژرم لاین در ژنهای MSH6، MSH2، MLH1 و PMS2 حاصل شود. مهمترین پروتئین تعمیر عدم تطابق DNA که در سرطان روده بزرگ دخیل است، MLH1 میباشد (7).
مطالعات نشان دادهاند که MLH1 به شدت با سرطان کلورکتال، مری، معده و دهانه رحم ارتباط دارد (4). با این وجود، مطالعات کمی در زمینه مکانیسم بیان و تنظیم ژن MLH1 در سرطان کلورکتال صورت گرفته است؛ بنابراین، تفسیر این مکانیسم به تشخیص بیشتر اثرات MLH1 بر وقوع و رشد سرطان کلورکتال کمک میکند که این مهم برای پیشگیری و درمان این سرطان مفید خواهد بود (14).
مطابق با تحقیقات Yu و همکاران که در سال 2016 با هدف ارزیابی بیان mRNA MLH1 در خون محیطی به عنوان بیومارکر تشخیص HNPCC (Hereditary nonpolyposis colorectal cancer) انجام شد، سطح mRNA MLH1 در 19 خانواده با فرد یا افراد مبتلا بهHNPCC با استفاده از qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) تعیین گردید. نتایج نشان دادند که سطح mRNA MLH1 در HNPCC به طور قابل توجهی پایینتر از گروه شاهد است (001/0>P). در این مطالعه سطح mRNA MLH1 دارای حساسیت 3/81 درصد و ویژگی 7/86 درصد برای تمایز HNPCC از گروه کنترل بود. یافتهها حاکی از آن بودند که سطح بیان mRNA MLH1 در خون محیطی ممکن است به عنوان یک بیومارکر برای تشخیص HNPCC مناسب باشد (15) .
Pinto و همکاران نیز در سال 2017، مؤثر بودن متیلاسیون MLH1 برای تشخیص سندروم لینچ در بیماران مبتلا به تومور با کاهش بیان MLH1 را مورد بررسی قرار دادند. در این پژوهش بیان کاهش یافته RNA در موارد متیلاسیون پروموتر MLH1 در مقایسه با گروه کنترل نشان داده شد. نتایج حاکی از آن بودند که متیلاسیون MLH1 اکثراً در بیمارانی رخ میدهد که فقط بیان پروتئین MLH1 را در تومورهایشان داشتند. علاوهبراین، این پژوهشگران شواهدی را ارائه دادند مبنی بر اینکه هایپرمتیلاسیون MLH1، مکانیسم مولکولی حدود 3 درصد از خانوادههای دارای سندروم لینچ بوده و به ویژه در بیماران مبتلا به تومورهای متعدد اولیه بدون سابقه خانوادگی، مهم گزارش شده است (16).
از سوی دیگر، گشایشی و همکاران در سال 2018 شیوع و ویژگیهای بالینی نقص در پروتئینهای MMR در سرطان روده بزرگ را در موارد شروع زودرس در مقایسه با موارد دیررس به عنوان یک مطالعه مقطعی گذشتهنگر در شمال شرق ایران انجام دادند. این پژوهشگران 321 مورد CRC و نمونه آسیبشناسی را طی سالهای 2013 تا 2016 مورد بررسی قرار دادند. آنها تومورها را با رنگآمیزی ایمونوهیستوشیمی (IHC: Immunohistochemistry) از چهار پروتئین تعمیر (MLH1، MSH2، MSH6 و PMS2) مورد آزمایش قرار دادند. نتیجه IHC بین CRC زودرس و دیررس در معرض خطر بالای سندروم لینچ معنادار نبود (17).
در پژوهش حاضر که برای نخستین بار در ایران در مورد بیان ژن MLH1 نمونه خون تازه 33 بیمار (غیر خویشاوند مبتلا به سرطان کلورکتال که با استفاده از آزمایشات بالینی و نتایج پاتولوژی برای این سرطان مثبت تشخیص داده شده بودند) و 33 فرد سالم (غیر خویشاوند با مبتلایان به سرطان کلورکتال) به صورت مورد- شاهدی و با روش Real Time PCR انجام شد، کاهش بیان ژن MLH1 در نمونههای سرطانی نسبت به بیان این ژن در نمونههای سالم معنادار بود (*01/0=P). از آنجایی که ژن MLH1 نقش کلیدی در سیستم ترمیم ناسازگاری (MMR) دارد و با توجه به مطالعات قبلی انجام شده در ارتباط با جهشهای این ژن در ایران و جهان و نیز نتایج حاصل از پژوهش حاضر استنباط میشود که سرطان کلورکتال با کاهش بیان ژن MLH1 ارتباط دارد؛ بنابراین با کاهش بیان ژن MLH1، امکان اصلاح عدم تطابق باز- باز و حلقههای حذف- اضافه ناشی از همانندسازی معیوب DNA کاهش پیدا کرده و بروز جهشها افزایش مییابد. مطابق با نتایج حاصل از آنالیزهای آماری در این مطالعه، بیان ژن MLH1 نسبت به ژن کنترل داخلی در بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال به طور چشمگیری کاهش پیدا کرده است.
نتیجهگیری
با توجه به نتایج به دست آمده، میزان بیان ژن MLH1 در Stage II (*02/0=P) و Stage III (*04/0=P) معنادار در نظر گرفته شد. همچنین آنالیز آماری میزان بیان ژن MLH1 در مقایسه با شاخص T در افراد مبتلا به سرطان نسبت به افراد سالم در مراحل T2 سطح معناداری (*04/0=P)، T3 سطح معناداری (*05/0=P) و T4 سطح معناداری (*00/0=P) را نشان داد؛ بنابراین ارتباط میان کاهش بیان ژن MLH1 در مراحل پیشرفته رشد تومور به لایههای دیواره روده که شامل: مراحل T3، T2 و T4 میشود، با کمک آنالیزهای آماری اثبات گردید.
علاوهبراین، میزان بیان ژن MLH1 در مقایسه با شاخص N در افراد مبتلا به سرطان نسبت به افراد سالم در مراحل N1 سطح معناداری (*01/0=P)، N2 سطح معناداری (*02/0=P) و N3 سطح معناداری (*00/0=P) را نشان داد. ارتباط میان کاهش بیان ژن MLH1 در مراحل تهاجم به گرههای لنفاوی (N) که شامل: مراحل N1، N2 و N3 میباشد، با کمک آنالیزهای آماری به خوبی به اثبات رسید.
با توجه به نتایج به دست آمده میتوان گفت که کاهش بیان ژن MLH1 نقش مؤثری در ایجاد سرطان کلورکتال دارد؛ اما مهمترین نکته در اهمیت این ژن، نقش آن در مراحل سرطان (Stage) و سیستم طبقهبندی TNM میباشد. فرضیه حاصل از این پژوهش بیان میکند که این ژن میتواند در مراحل بعدی مطالعات، بیشتر مورد توجه قرار بگیرد؛ زیرا این احتمال وجود دارد که در آینده نزدیک بتواند در بهبود وضعیت درمانی سرطان کلورکتال نقش مؤثری داشته باشد. همچنین به دلیل معنادار بودن نتایج لازم است پژوهشی مشابه با تعداد نمونه بیشتر انجام شود و پارامترهای کلینیکی و بالینی دیگر مورد بررسی قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم میدانند از همکاری ارزشمند "انستیتو کنسرو بیمارستان امام خمینی(ره)" به دلیل تأمین بخشی از نمونههای بیماران و نیز از کارکنان محترم مرکز تحقیقات سلولی- مولکولی دانشگاه علوم پزشکی قم قدردانی نمایند.
References:
- Ma H, Brosens LA, Offerhaus GJ, Giardiello FM, de Leng WWJ, Montgomery EA. Pathology and genetics of hereditary colorectal cancer. Pathology 2018;50(1):49-59. PMID: 29169633
- Dolatkhah R, Somi MH, Bonyadi MJ, Asvadi Kermani I, Farassati F, Dastgiri S. Colorectal cancer in Iran: molecular epidemiology and screening strategies. J Cancer Epidemiol 2015;2015:643020. PMID: 25685149
- Fu T, Liu Y, Li K, Wan W, Pappou EP, Iacobuzio-Donahue CA, et al. Tumors with unmethylated MLH1 and the CpG island methylator phenotype are associated with a poor prognosis in stage II colorectal cancer patients. Oncotarget 2016;7(52):86480-9. PMID: 27880934
- Jensen LH, Rasmussen AA, Byriel L, Kuramochi H, Crüger DG, Lindebjerg J, et al. Regulation of MLH1 mRNA and protein expression by promoter methylation in primary colorectal cancer: a descriptive and prognostic cancer marker study. Cell Oncol 2013;36(5):411-9. PMID: 24027018
- Rupnarain C, Dlamini Z, Bhoola K. Colon cancer : genomics and apoptotic events. Biol Chem 2004;385(6):449–64. PMID: 15255176
- Haghighi MM, Radpour R, Aghajani K, Zali N, Molaei M, Zali MR. Four novel germline mutations in the MLH1 and PMS2 mismatch repair genes in patients with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Int J Colorectal Dis 2009;24(8):885-93. PMID: 19479271
- Hinrichsen I, Ernst BP, Nuber F, Passmann S, Schäfer D, Steinke V, et al. Reduced migration of MLH1 deficient colon cancer cells depends on SPTAN1. Mol Cancer 2014;13(1):11. PMID: 24456667
- De Rosa M, Pace U, Rega D, Costabile V, Duraturo F, Izzo P DP. Genetics, diagnosis and management of colorectal cancer. Oncol Rep 2015;34(3):1087-96. PMID: 26151224
- Zarandi A, Irani S, Savabkar S, Chaleshi V, Ghavideldarestani M, Mirfakhraie R, et al. Evaluation of promoter methylation status of MLH1 gene in Iranian patients with colorectal tumors and adenoma polyps. Gastroenterol Hepatol Bed Bench 2017;10(Suppl 1):S117-21. PMID: 29511481
- Sharp A, Pichert G, Lucassen A, Eccles D. RNA analysis reveals splicing mutations and loss of expression defects in MLH1 and BRCA1. Hum Mutat 2004;24(3):272. PMID: 15300854
- Takeda T, Banno K, Yanokura M, Adachi M, Iijima M, Kunitomi H, et al. Methylation analysis of DNA mismatch repair genes using DNA derived from the peripheral blood of patients with endometrial cancer: epimutation in endometrial carcinogenesis. Genes (Basel) 2016;7(10):86. PMID: 27754426
- Wu Q, Vasquez KM. Human MLH1 protein participates in genomic damage checkpoint signaling in response to DNA interstrand crosslinks, while MSH2 functions in DNA repair. PLoS Genet 2008;4(9):e1000189. PMID: 18787700
- Kang MJ, Jung SA, Jung JM, Kim SE, Jung HK, Kim TH, et al. Associations between single nucleotide genes and the risk of developing colorectal cancer. Anticancer Res 2011;31(2):575-84. PMID: 21378341
- Chen T, Lv H, Xu Y, Du W, Zhang R. A study on the aberrant methylation of colorectal cancer MLH1 gene. Am J Clin Exp Med 2019;7(1):1-6. Link
- Yu H, Li H, Cui Y, Xiao W, Dai G, Huang J, et al. The mRNA level of MLH1 in peripheral blood is a biomarker for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Am J Cancer Res 2016;6(5):1135-40. PMID: 27294005
- Pinto D, Pinto C, Guerra J, Pinheiro M, Santos R, Vedeld HM, et al. Contribution of MLH 1 constitutional methylation for Lynch syndrome diagnosis in patients with tumor MLH 1 downregulation. Cancer Med 2018;7(2):433-44. PMID: 29341452
- Goshayeshi L, Ghaffarzadegan K, Khooei A, Esmaeilzadeh A, Khorram MR, Mozaffari HM, et al. Prevalence and clinicopathological characteristics of mismatch repair-deficient colorectal carcinoma in early onset cases as compared with late-onset cases: a retrospective cross-sectional study in Northeastern Iran. BMJ Open 2018;8(8):e023102. PMID: 30166308
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
ژنتیک
دریافت: 1399/4/14 | پذیرش: 1399/8/20 | انتشار: 1399/9/10
دریافت: 1399/4/14 | پذیرش: 1399/8/20 | انتشار: 1399/9/10
فهرست منابع
1. Ma H, Brosens LA, Offerhaus GJ, Giardiello FM, de Leng WWJ, Montgomery EA. Pathology and genetics of hereditary colorectal cancer. Pathology 2018;50(1):49-59. PMID: 29169633 [DOI:10.1016/j.pathol.2017.09.004]
2. Dolatkhah R, Somi MH, Bonyadi MJ, Asvadi Kermani I, Farassati F, Dastgiri S. Colorectal cancer in Iran: molecular epidemiology and screening strategies. J Cancer Epidemiol 2015;2015:643020. PMID: 25685149 [DOI:10.1155/2015/643020]
3. Fu T, Liu Y, Li K, Wan W, Pappou EP, Iacobuzio-Donahue CA, et al. Tumors with unmethylated MLH1 and the CpG island methylator phenotype are associated with a poor prognosis in stage II colorectal cancer patients. Oncotarget 2016;7(52):86480-9. PMID: 27880934 [DOI:10.18632/oncotarget.13441]
4. Jensen LH, Rasmussen AA, Byriel L, Kuramochi H, Crüger DG, Lindebjerg J, et al. Regulation of MLH1 mRNA and protein expression by promoter methylation in primary colorectal cancer: a descriptive and prognostic cancer marker study. Cell Oncol 2013;36(5):411-9. PMID: 24027018 [DOI:10.1007/s13402-013-0148-2]
5. Rupnarain C, Dlamini Z, Bhoola K. Colon cancer : genomics and apoptotic events. Biol Chem 2004;385(6):449-64. PMID: 15255176 [DOI:10.1515/BC.2004.053]
6. Haghighi MM, Radpour R, Aghajani K, Zali N, Molaei M, Zali MR. Four novel germline mutations in the MLH1 and PMS2 mismatch repair genes in patients with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Int J Colorectal Dis 2009;24(8):885-93. PMID: 19479271 [DOI:10.1007/s00384-009-0731-1]
7. Hinrichsen I, Ernst BP, Nuber F, Passmann S, Schäfer D, Steinke V, et al. Reduced migration of MLH1 deficient colon cancer cells depends on SPTAN1. Mol Cancer 2014;13(1):11. PMID: 24456667 [DOI:10.1186/1476-4598-13-11]
8. De Rosa M, Pace U, Rega D, Costabile V, Duraturo F, Izzo P DP. Genetics, diagnosis and management of colorectal cancer. Oncol Rep 2015;34(3):1087-96. PMID: 26151224 [DOI:10.3892/or.2015.4108]
9. Zarandi A, Irani S, Savabkar S, Chaleshi V, Ghavideldarestani M, Mirfakhraie R, et al. Evaluation of promoter methylation status of MLH1 gene in Iranian patients with colorectal tumors and adenoma polyps. Gastroenterol Hepatol Bed Bench 2017;10(Suppl 1):S117-21. PMID: 29511481
10. Sharp A, Pichert G, Lucassen A, Eccles D. RNA analysis reveals splicing mutations and loss of expression defects in MLH1 and BRCA1. Hum Mutat 2004;24(3):272. PMID: 15300854 [DOI:10.1002/humu.9267]
11. Takeda T, Banno K, Yanokura M, Adachi M, Iijima M, Kunitomi H, et al. Methylation analysis of DNA mismatch repair genes using DNA derived from the peripheral blood of patients with endometrial cancer: epimutation in endometrial carcinogenesis. Genes (Basel) 2016;7(10):86. PMID: 27754426 [DOI:10.3390/genes7100086]
12. Wu Q, Vasquez KM. Human MLH1 protein participates in genomic damage checkpoint signaling in response to DNA interstrand crosslinks, while MSH2 functions in DNA repair. PLoS Genet 2008;4(9):e1000189. PMID: 18787700 [DOI:10.1371/journal.pgen.1000189]
13. Kang MJ, Jung SA, Jung JM, Kim SE, Jung HK, Kim TH, et al. Associations between single nucleotide genes and the risk of developing colorectal cancer. Anticancer Res 2011;31(2):575-84. PMID: 21378341
14. Chen T, Lv H, Xu Y, Du W, Zhang R. A study on the aberrant methylation of colorectal cancer MLH1 gene. Am J Clin Exp Med 2019;7(1):1-6. Link [DOI:10.11648/j.ajcem.20190701.11]
15. Yu H, Li H, Cui Y, Xiao W, Dai G, Huang J, et al. The mRNA level of MLH1 in peripheral blood is a biomarker for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Am J Cancer Res 2016;6(5):1135-40. PMID: 27294005
16. Pinto D, Pinto C, Guerra J, Pinheiro M, Santos R, Vedeld HM, et al. Contribution of MLH 1 constitutional methylation for Lynch syndrome diagnosis in patients with tumor MLH 1 downregulation. Cancer Med 2018;7(2):433-44. PMID: 29341452 [DOI:10.1002/cam4.1285]
17. Goshayeshi L, Ghaffarzadegan K, Khooei A, Esmaeilzadeh A, Khorram MR, Mozaffari HM, et al. Prevalence and clinicopathological characteristics of mismatch repair-deficient colorectal carcinoma in early onset cases as compared with late-onset cases: a retrospective cross-sectional study in Northeastern Iran. BMJ Open 2018;8(8):e023102. PMID: 30166308 [DOI:10.1136/bmjopen-2018-023102]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
