مجله دانشگاه علوم پزشکی قم

مقدمه

یادگیری روندی است که به‌وسیله آن درباره دنیای اطراف خود اطلاعات کسب می‌کنیم (تجربه)؛ درحالی که حافظه فرآیندی است که توسط آن، این اطلاعات، رمزبندی و ذخیره شده و سپس به خاطر آورده می‌‌شوند. یکی از مهم‌ترین سطوح عملکردی سیستم عصبی مرکزی، یادگیری و حافظه می‌باشد. هیپوکامپ یکی از اولین مناطق مغز است که در بیماری‌های مغزی مانند آلزایمر، هانتیگتون و صرع دخالت دارد. بسیاری از اختلالات حافظه‌ای ناشی از آسیب به هیپوکامپ، ماهیت فضایی دارند (1).  

یافته‌های مطالعات گذشته نشان‌دهنده تراکم بالای گیرنده‌های گابا در هیپوکامپ بوده و بیانگر این هستند که فعال‌سازی گیرنده‌های گابا، فرایند حافظه و یادگیری را کنترل می‌کند (2). ﮔﺎﻣﺎ آﻣﻴﻨﻮ ﺑﻮﺗﻴﺮﻳﻚ اﺳﻴﺪ (GABA) یک ﻧﻮروﺗﺮاﻧسمیتر ﻣﻬﺎری اصلی مغز اﺳﺖ. اتصال گابا بر گیرنده‌های GABAA باعث باز شدن کانال کلری در وسط گیرنده شده و موجب هیپرپلاریزاسیون می‌شود (3). تقریباً 80 درصد از کل گیرنده‌های GABAA حاوی یک جایگاه اتصال بنزودیازپین واقع در بین زیرواحد γ2 و زیرواحد α مربوطه (α2، α5) می‌باشند (4).

ثابت شده است که حذف بیضه‏ها که منبع اصلی تولیدکننده هورمون جنسی تستوسترون می‏باشند، باعث ایجاد اختلالات حافظه و یادگیری می‌شود (5). برخی از استروئیدها مانند آلفا هیدروکسی استروئیدها با اتـصال به گیرنده غشایی گابا A می‎توانند این گیرنده را به طور مستقیم فعال نمایند (6،7). برخی از مواد فنلی در گیاهان مانند کومارین ﺑﺎ اﺗﺼﺎل به ﮔﻴﺮﻧﺪه‌های GABAA دارای اﺛﺮات ﺿﺪ اﺿﻄﺮاب، ﺧﻮاب‌آور، آرام‌ﺑﺨﺶ و ﺿﺪ ﺻﺮع می‌باشند (8).

کومارین ترکیبی از خانواده مواد فنلی رایج در گیاهان است که خواص فیزیولوژیک متعددی از قبیل ضد انعقاد‌ خون، ضد میکروب و آنتی‌اکسیدان دارد و کمپلکس‌های آن‌ها با خاصیت دارویی ضد سرطان مورد توجه بسیاری از شیمی‌دانان و داروسازان قرار گرفته است. باید خاطرنشان ساخت که کومارین در کاهش تشنج از طریق اتصال به جایگاه بنزودیازپین گیرنده‌های گاباA  مؤثر می‌باشد (8).

Muke و همکاران در سال 2018 در مطالعه‌ای نشان دادند که کومارین دارای اثرات آرام‌بخش و ضد استرس می‌باشد که احتمالاً از طریق اثر بر گیرنده GABAA باعث افزایش رها شدن گاما- آمینوبوتریک اسید در مغز می‌شود (9).

محمدی و همکاران نیز در سال 2019 طی پژوهشی نشان دادند که تزریق کومارین به رت‌ها، اثرات آرام‌بخشی و ضد تشنج را به همراه داشت و باعث افزایش رها شدن GABA و مهار نورون‌های مغزی گردید. شایان ذکر است که کومارین از سه محل به جایگاه بنزودیازپین رسپتور GABA متصل شده و به عنوان یک داروی ضد تشنج، فعالیت این گیرنده را افزایش می‌دهد (10).

پژوهش‌های انجام شده در ارتباط با کومارین به عنوان ماده مؤثر بسیاری از گیاهان اغلب در زمینه بررسی اثرات ضد درد، ضد تشنج و ضد اضطراب با استفاده از روش‌های رفتاری انجام شده‌اند و تاکنون مطالعه‌ای در زمینه یادگیری و حافظه در مورد این ماده با استفاده از روش‌های مولکولی به ثبت نرسیده است؛ از این رو با توجه به اهمیت روش‌های مولکولی و بافتی در خصوص به یادآوری حافظه، مطالعه حاضر با بهره‌گیری از روشی نوین، تأثیرات کومارین بر حافظه و یادگیری را به صورت مولکولی در هیپوکامپ بیان می‌کند.

با توجه به مطالب بیان شده، مطالعه حاضر با هدف بررسی اثر کومارین بر به یادآوری حافظه، بیان ژن گیرنده GABAA و تعداد نورون‌های هرمی سالم هیپوکامپ موش‌های صحرایی نر گنادکتومی انجام شد.

روش بررسی

در این پژوهش 40 سر موش صحرایی نر ویستار با وزن 220 تا ۲۳۰ گرم از مؤسسه پاستور ایران تهیه شد. موش‌ها در شرایط استاندارد دمایی 2±23 درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی 45-40 درصد با دسترسی آزاد به پلت و آب شیرین قرار گرفتند (11). موش‌ها ﺑﻪ ﻃﻮر ﺗـﺼﺎدﻓﻲ ﺑـﻪ پنج ﮔـﺮوه هشت نفره ﺗﻘـﺴﻴﻢ ﺷﺪﻧﺪ که شامل: گروه‌های سالم بدون تیمار (intact)‌، گنادکتومی بدون تیمار (control-)، گنادکتومی دریافت‌کننده حلال به میزان 5/0 سی‌سی (control-)‌ و گنادکتومی‌ دریافت‌کننده 5/3 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین بود. تیمار به صورت داخل صفاقی، یک بار در روز به مدت 15 روز انجام شد (12). ماده کومارین و کریستال ویوله از شرکت سیگما آلدریچ خریداری شدند. پارافرمالدهید، ژلاتین، کلروفرم، گزیلازین، الکل 96 درصد، الکل مطلق، گزیلل، فرمامید، آب مقطر و DMSO از شرکت Merck آلمان تهیه شدند. Accuprep Genomic DNA xtraction kit  (Cat No:K-3032) نیز از شرکت Abcam و AccuPower® 2X Greenstar qPCR Master Mix از شرکت BIONEER خریداری گردید. شایان ذکر است که پروتکل این پژوهش براساس قوانین بین‌المللی درباره حیوانات آزمایشگاهی تنظیم گشته و در کمیته اخلاق دانشگاه با شمارهIR.IAU.SRB.REC.1397.127  به تصویب رسیده است.

حیوانات با استفاده از تزریق داخل صفاقی مخلوطی از کتامین (100 میکروگرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میکروگرم بر کیلوگرم) بیهوش شدند. سپس با ﺛﺎﺑﺖ ﻧﻤﻮدن ﺣﯿﻮان روی ﺗخته ﺗﺸﺮیح، ﭘﻮﺳﺖ ﻧﺎﺣﯿﻪ اﺳﮑﺮوﺗﻮم ﺑﺮش داده شد و با کمی فشار، ﺑﯿﻀﻪ‌ﻫﺎ ﻧﻤﺎیﺎن گشته و بیرون کشیده شدند. در انتها، ﻃﻨﺎب‌های اﺳﭙﺮﻣﯽ ﺑﺎ نخ بخیه ﺑﺴﺘﻪ و ﻗﻄع شدند و ﺳﭙس ﻣﺤل ﺟﺮاﺣﯽ ﺑﺎ ﻧﺮﻣﺎل ﺳﺎﻟﯿﻦ اﺳﺘﺮیل ﺷﺴﺘشو گردید و ﭘﻮﺳﺖ بخیه زده شد. پس از ﺟﺮاﺣﯽ، حیوان برای بهبودی به مدت دو هفته در قفس انفرادی نگهداری شد. پس از طی دوران نقاهت، آزمایشات لازم روی حیوان صورت گرفت (13).

به منظور سنجش یادآوری حافظه از دستگاه یا جعبه شاتل که دارای دو محفظه روشن و تاریک (30 × 20 × 30 سانتی‌متر) و یک درب گیوتینی (7 × 9 سانتی‌متر) می‌باشد، استفاده گردید. کف هر دو محفظه از فولاد ضد زنگ (قطر 5/2 میلی‌متر) ساخته شده و به یک استیمولاتور متصل شده است. به منظور آموزش ابتدایی، حیوان در بخش روشن دستگاه قرار گرفت و پس از 5 ثانیه در گیوتینی باز شد. مدت زمانی که طول کشید حیوان وارد اتاق تاریک شود، ثبت گردید و سپس حیوان از آن خارج شد. 30 دﻗﻴﻘﻪ ﺑﻌﺪ، اﻳﻦ ﻋﻤﻞ ﺗﻜﺮار گردید؛ با این تفاوت که ﭘﺲ از ورود ﺣﻴﻮان ﺑﻪ ﺑﺨﺶ ﺗﺎرﻳﻚ، ﺑﻼﻓﺎﺻﻠﻪ ﺷﻮﻛﻲ ﺑﺎ ﻓﺮﻛﺎﻧﺲ 50 هرتز و وﻟﺘﺎژ 6/0-5/0 میلی‌آمپر به مدت 9 ﺛﺎﻧﻴﻪ از ﻧﺎحیه پا به حیوان وارد گشته و در نهایت پس از 5 ثانیه حیوان از دستگاه خارج می‌شد. 24 ﺳﺎﻋﺖ ﭘﺲ از آﻣﻮزش ﺟﻬﺖ اﻧﺠﺎم آزﻣﻮن به یادآوری، ﺣﻴﻮان در ﺑﺨﺶ روﺷﻦ دﺳﺘﮕﺎه ﻗﺮار ﮔﺮﻓﺖ. ﭘﺲ از 30 ﺛﺎﻧﻴﻪ در گیوتینی ﺑﺎز شد و مدت زﻣﺎن برای ورود ﺑﻪ ﺑﺨﺶ ﺗﺎرﻳﻚ به عنوان زﻣﺎن ﺑﻪ ﻳﺎدآوری ﺛﺒﺖ گردید. شایان ذکر است که کل زمان آزمون 600 ثانیه بود (14).

به منظور انجام آزمایش هیستولوژی، بلافاصله پس از آزمون سنجش یادآوری حافظه با دستگاه شاتل باکس، حیوانات با کلروفرم بیهوش گردیدند. سپس سر آن‌ها بریده شد و مغز آن‌ها به سرعت خارج گردید. در هر گروه، چهار عدد از مغزها برای مطالعه بافت‌شناسی و چهار عدد دیگر برای مطالعه مولکولی مورد استفاده قرار گرفت. به منظور مطالعه بافت‌شناسی، مغزها در محلول فرمالین 10 درصد ثابت شدند و پس از اینکه ۳/1 میانی مغزها جدا شدند و فیکساتیو 24 ساعت بعد تعویض شد و تحت پروسس بافتی قرار گرفتند، آبگیری و قالب‌گیری صورت گرفت. 10 لام با برش‌های سریالی 7-5 میکرومتری تهیه شد و به وسیله رنگ‌آمیزی نیسل، رنگ‌آمیزی گردید. سپس به طور کاملاً تصادفی، پنج مقطع از مقاطع بافتی از گروه‌های مختلف تحت بررسی میکروسکوپی قرار گرفتند. جهت شمارش سلول‌ها از میکروسکوپ OLYMPUS, AX70 استفاده شد و تصاویر نمونه‌ها با بزرگنمایی 40 ثبت گردید. پس از آن شمارش سلولی با استفاده از نرم‌افزار Olysia bio report انجام شد. نورون‌های هرمی شکل در این بررسی در مقطع 6/3-3/3 (نسبت به برگما) با توجه به اطلس پاکسینوس انتخاب شدند (15).

برای انجام عمل RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) ابتدا منطقه هیپوکامپ از مغز موش‌ها خارج شد و بلافاصله در نیتروژن مایع منجمد گردید. نمونه‌های هیپوکامپ به یخچالی با دمای 84- درجه سانتی‌گراد منتقل شدند و تا زمان استخراج RNA (Ribonucleic acid) در آن نگهداری گردیدند. به منظور تعیین بیان ژن a2 و a5 در گیرنده‌های GABA هیپوکامپ، ابتدا بافت مورد نظر هموژنیزه شد و در ادامه کل RNA موجود در بافت‌ها با کمک محلول استخراج RNX+ و پروتکل کلروفرم- الکل استخراج گردید. آزمایش غلظت‌سنجی RNA برای نشان دادن درجه خلوص قابل قبول از آن انجام شد. سنجش غلظت به کمک دستگاه نانودراپ اسپکتروفتومتری (ساخت شرکت Nanolytik، کشور آلمان) صورت گرفت. سپس cDNA (complementary DNA) ساخته شد. به منظور تکثیر قطعه از cDNA مربوط به ژن‌های فوق از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) استفاده گردید. فرایند PCR با استفاده از
AceQ ™ RT_PCR SYBR Green Master با کمک آنزیم
پلیمراز Taq و پرایمرهای اختصاصی برای ژن  GABAAa2
(5’-GAACAGAGAATCGGTGCCAGCAAGA-3’)F، (5’-TGCAAATTCAATTAGGGCAGAGAACACAA-3’)R، ژن GABAAa5 (5’-TGCTATGCATTTGTCTTCT
CTGCTCTGATT-3’)F، (5′-GATTAGACCCGTTACCA
TCGAGAT-3′)R و ژن β-Actin (5′-CCCAGCCATGT
ACGTAGCCA3′)F، (5′-CGTCTCCGGAGTCCATCAC-3′)R بیان شد. شرایط PCR از نظر دمای اتصال پرایمرها، تعداد سیکل و میزان PCR در آزمایشات جداگانه بهینه‌سازی گردید و با استفاده از برنامه Stepone software مورد ارزیابی قرار گرفت. مشخصات چرخه حرارتی به شرح زیر بود: 15 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد و 60 ثانیه در دمای 60 درجه سانتی‌گراد برای 40 سیکل. در ادامه، میانگین Ct ژن‌های مرجع و هدف در هر نمونه محاسبه گردید. تفاوت بین سیکل آستانه ژن‏های هدف و مرجع در نمونه کنترل مورد مطالعه به صورت ΔCt محاسبه شد و تفاوت بین آن‌ها به صورت Ct△△ بیان گردید (16).

آنالیز آماری

 تمامی اطلاعات به صورت میانگین±انحراف معیار استاندارد بیان شده‌اند. برای آنالیز آماری، آزمون‌های به خاطرآوری و هیستولوژی از روش ANOVA (one-way analysis of variance) استفاده گردید. در تمامی محاسبات، اختلاف (05/0P<) به عنوان سطح معناداری لحاظ گردید. داده‌های بخش بیان ژن توسط Ct△△ محاسبه گشته و تجزیه و تحلیل شدند. اختلاف سطح Ct△△ بیش از 1 به عنوان سطح معناداری در نظر گرفته شد.

یافته‌ها

گروه گنادکتومی بدون تیمار نسبت به گروه سالم بدون تیمار، کاهش معناداری را در به یادآوری حافظه و تعداد نورون‌های هرمی سالم هیپوکامپ نشان دادند (شکل 1). گروه گنادکتومی دریافت‌کننده حلال DMSO نسبت به گروه گنادکتومی بدون تیمار در به یادآوری حافظه، تعداد نورون‌ها و بیان ژن GABAA  تفاوت معناداری را نشان ندادند. در مقابل، گروه‌های گنادکتومی دریافت‌کننده 5/3 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین نسبت به گروه گنادکتومی دریافت‌کننده حلال در به یادآوری حافظه (شکل 1) کاهش معناداری داشتند.

شکل شماره 1: اثر گنادکتومی و کومارین بر تأخیر ورود به قسمت تاریک دستگاه شاتل باکس در روز آزمون در رت‌های گنادکتومی شده

نمودارها نشان‌دهنده میانگین±انحراف معیار استاندارد (Mean±SEM) می‎باشند. داده‌ها به روش تجزیه و تحلیل واریانس یک‌طرفه و به دنبال آن آزمون توکی تجزیه و تحلیل شدند.

(***001/0P<)، (**01/0P<)، (*1/0P<)، 8=n

نتایج مطالعات هیستولوژی نشان دادند که گروه‌های گنادکتومی دریافت‌کننده 5/3 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین نسبت به گروه گنادکتومی دریافت‌کننده حلال، کاهش معناداری را در تعداد نورون‌های سالم هیپوکامپ (اشکال 2 و 3) نشان دادند.

نتایج بیان ژن نشان دادند که گروه گنادکتومی دریافت‌کننده

نمودارها نشان‌دهنده میانگین±انحراف معیار استاندارد (Mean±SEM) می‌باشند. داده‌ها به روش تجزیه و تحلیل واریانس یک‌طرفه و به دنبال آن آزمون توکی تجزیه و تحلیل شدند.

(***001/0P<)، (**1/0P<)، 8=n

شکل شماره 3: تصاویر (مطالعه کیفی) هیستولوژی نیسل از منطقه CA1 هیپوکامپ در رت‌های گنادکتومی شده

‌A) مقطع بافتی ناحیه  CA1هیپوکامپ با بزرگنمایی 4 در گروه سالم بدون تیمار که هیچ ماده‌ای را دریافت نکردند؛‌a ) مقطع بافتی ناحیه  CA1 هیپوکامپ با بزرگنمایی 40 در گروه سالم بدون تیمارکه هیچ ماده‌ای را دریافت نکردند (Intact). در این گروه هیچ‌گونه انحطاط یا نکروز سلول‌های عصبی وجود ندارد. تعداد زیاد سلول‌های هرم سالم (White cell) با هسته روشن و هستک واضح با نماد پیکان سیاه قابل مشاهده است؛ B) مقطع بافتی ناحیه CA1 هیپوکامپ با بزرگنمایی 4 در گروه گنادکتومی بدون تیمارکه هیچ ماده‌ای را دریافت نکردند؛ b) مقطع بافتی ناحیه  CA1هیپوکامپ با بزرگنمایی 40 در گروه گنادکتومی بدون تیمار که هیچ ماده‌ای را دریافت نکردند (Control-). در این گروه انحطاط یا نکروز سلول‌های عصبی نسبت به گروه سالم به میزان زیادی وجود دارد. سلول‌های هرمی سالم (White cell) با هسته روشن و هستک واضح با نماد پیکان سیاه قابل مشاهده است. همچنین نکروز سلول‌های هرمی (Dark cell) با هسته پیکنوز شده با نماد پیکان قرمز قابل مشاهده می‌باشد؛ C) مقطع بافتی ناحیه CA1 هیپوکامپ با بزرگنمایی 4 در گروه گنادکتومی که با حلال کومارین تیمار شده است؛‌c ) مقطع بافتی ناحیه CA1  هیپوکامپ با بزرگنمایی 40 در گروه گنادکتومی تیمار با حلال کومارین (Control+). در این گروه انحطاط یا نکروز سلول‌های عصبی نسبت به گروه (Control-) به میزان ناچیزی وجود دارد؛ D) مقطع بافتی ناحیه  CA1هیپوکامپ با بزرگنمایی 4 در گروه گنادکتومی که با دوز 3 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین تیمار شده است؛ d) مقطع بافتی ناحیه  CA1هیپوکامپ با بزرگنمایی 40 در گروه گنادکتومی تیمار با دوز 3 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین (Coum3). در این گروه انحطاط یا نکروز سلول‌های عصبی نسبت به گروه (Control+) به میزان بسیار زیادی وجود دارد؛ E) مقطع بافتی ناحیه CA1 هیپوکامپ با بزرگنمایی 4 در گروه گنادکتومی که با دوز 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین تیمار شده است؛‌e ‌) مقطع بافتی ناحیه  CA1هیپوکامپ با بزرگنمایی 40 در گروه گنادکتومی تیمار با دوز 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین (Coum5). در این گروه انحطاط یا نکروز سلول‌های عصبی نسبت به گروه (Control+) به میزان زیادی وجود دارد.

5 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین نسبت به گروه گنادکتومی دریافت‌کننده حلال در بیان ژن GABAA-a2 (شکل 4) افزایش معناداری داشته است.

شکل شماره 4: سطح نسبی mRNA ژن‌های GABAA-α5 و GABAA- α2 در هیپوکامپ موش‌های صحرایی نر گنادکتومی شده تیمار با دوز 5/3 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین در مقایسه با گروه کنترل

نمودارها نشان‌دهنده میانگین±انحراف معیار استاندارد (Mean±SEM) می‌باشند. اختلاف سطح Ct△△ بیش از یک سطح معنادار در نظر گرفته شد. 8=n

بحث

حافظه یک عملکرد مهم زیست‌شناختی است که بدون آن زندگی امکان‌پذیر نمی‌باشد. ذخیره اطلاعات با عملکرد هماهنگ شبکه‌های عصبی در مغز انجام می‌شود. بیماری‌های عصبی به طور برجسته‌تر، عملکردهای مغز را تحت تأثیر قرار می‌دهند؛ به ویژه یادگیری و پردازش حافظه که منجر به اختلال در حافظه و زوال عقل می‌شود، عملکرد شناختی و فکری مغز را به دلیل آسیب عصبی مختل می‌کند (17). در ﻣﻄﺎﻟﻌﺎﺕ ﻣﺘﻌﺪﺩی ﻧﺸﺎﻥ ﺩﺍﺩﻩ شده ﺍﺳﺖ ﮐﻪ ﻫﻮﺭﻣﻮﻥﻫﺎی جنسی ﺩﺭ ﺭﻓﺘﺎﺭ ﻳﺎﺩﮔﻴﺮی ﻭ ﺣﺎﻓﻈﻪ ﺩﺧﺎﻟﺖ ﺩﺍﺭﻧﺪ ﻭ ﮐﻤﺒﻮﺩ ﻳﺎ ﻋﺪﻡ این ﻫﻮﺭﻣﻮﻥ ﺍﺛﺮﺍﺕ مهمی را ﺑﺮ هیپوکامپ بر جای می‌گذارد (18). از سوی دیگر، تشکیلات هیپوکامپ نقش عمده‌ای را در محاسبه و ذخیره‌سازی اطلاعات فضایی ایفا می‌کند. بسیاری از اختلالات حافظه‌ای ناشی از آسیب به هیپوکامپ، ماهیت فضایی دارند. میزان این اختلالات با حجم تخریب بافت هیپوکامپ، ارتباط مستقیمی دارد. سلول‏های هرمی ناحیه CA1 هیپوکامپ بسیار حساس بوده و از اولین نورون‏هایی هستند که در شرایط پاتولوژیک و بیماری‏های دژنراتیو مغز از بین می‏روند (19). در هیپوکامپ، زیرواحدهای گیرنده GABAA غالباًα2  و α5 هستند که در سراسر مناطق CA1 و CA3 قرار دارند (20). گیرنده GABAA-α2 و GABAA-α5، محل اتصال با میل بالا برای بنزودیازپین‌ها می‌باشند (4). این دو ساب‌یونیت در مکانیسم‌های یادگیری و حافظه اهمیت دارند (21).

در پژوهش حاضر آزمون رفتاری شاتل باکس جهت بررسی یادگیری و حافظه مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان دادند که میزانSTL  در گروه گنادکتومی نسبت به گروه سالم کاهش معناداری داشته است. این مهم حاکی از آن است که گنادکتومی، تراکم گیرنده‌های آندروژنی را در هیپوکامپ کاهش می‌دهد. این مهم با نتایج مطالعات مقدمی و همکاران در سال 2016 (22) همخوانی دارد.

در ﻣﻄﺎﻟﻌﺎﺕ ﻣﺘﻌﺪﺩ ﻧﺸﺎﻥ ﺩﺍﺩﻩ شده ﺍﺳﺖ ﮐﻪ ﻫﻮﺭﻣﻮﻥﻫﺎی جنسی ﺩﺭ ﺭﻓﺘﺎﺭ ﻳﺎﺩﮔﻴﺮی ﻭ ﺣﺎﻓﻈﻪ ﺩﺧﺎﻟﺖ ﺩﺍشته ﻭ ﮐﻤﺒﻮﺩ ﻳﺎ ﻋﺪﻡ آن‌ها ﺍﺛﺮﺍﺕ مهمی را ﺑﺮ هیپوکامپ بر جای میﮔﺬﺍﺭﺩ ﮐﻪ ﻧﻘﺶ ﺑه‌ﺴﺰﺍیی ﺩﺭ ﺣﺎﻓﻈﻪ ﻭ ﻳﺎﺩﮔﻴﺮی ﺩﺍرند (18). ﺗﺴﺘﻮﺳﺘﺮﻭﻥ ﺑﺎ ﺗﺄﺛﻴﺮ ﺑﺮ ﺭﺷﺪ ﺧﺎﺭﻫﺎی ﺩﻧﺪﺭﻳﺘﻴﮏ ﻭ ﺗﺮﺍﮐﻢ ﺳﻴﻨﺎﭘﺲ ﺩﺭ ﺳﻠﻮﻝﻫﺎی ﻫﺮمی هیپوکامپ باعث ﺗﺸﮑﻴﻞ ﻭ ﻧﮕﻬﺪﺍﺭی ﺣﺎﻓﻈﻪ ﻭ ﻳﺎﺩﮔﻴﺮی میﮔﺮﺩﺩ. ﮔﻨﺎﺩﮐﺘﻮمی ﻣﻮﺟﺐ ﺗﻐﻴﻴﺮﺍﺕ ﻓﻴﺰﻳﻮﻟﻮﮊیکی ﺩﺭ ﺳﻄﻮﺡ ﺗﺴﺘﻮﺳﺘﺮﻭﻥ میﺷﻮﺩ ﮐﻪ ﺑﺎ ﮐﺎﻫﺶ ﺧﺎﺭﻫﺎی ﺩﻧﺪﺭیتی ﻭ ﺗﺮﺍﮐﻢ ﺳﻴﻨﺎپسی ﺩﺭ ﻧواحی CA1 ﻭ CA3 هیپوکامپ ﻫﻤﺮﺍﻩ می‌باشد (23). ﺍﻳﻦ ﺧﺎﺭﻫﺎی ﺩﻧﺪﺭیتی، ﻣﺤﻞ ﻣﻨﺎسبی ﺑﺮﺍی ﺣﺎﻓﻈﻪ ﻃﻮﻻنیﻣﺪﺕ ﻫﺴﺘﻨﺪ ﻭ ﺍﻓﺰﺍﻳﺶ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﺁﻥﻫﺎ ﺑﺎﻋﺚ ﺍﻓﺰﺍﻳﺶ ﺧﺎﺭﻫﺎی ﺟﺪﻳﺪ میﺷﻮﺩ (23)؛ از این رو احتمالاً کاهش حافظه در موش‌های گنادکتومی در پژوهش حاضر می‎تواند از طریق کاهش تراکم گیرنده‌های آندروژنی، ﺧﺎﺭﻫﺎی ﺩﻧﺪﺭیتی ﻭ ﺗﺮﺍﮐﻢ ﺳﻴﻨﺎپسی ﺩﺭ نواحی CA1 ﻭ CA3 هیپوکامپ ایجاد شده باشد.

از سوی دیگر، یافته‌هـای مطالعات پیشین وجـود یـک رابطـه نزدیـک بـین سیـستم گابائرژیک و استروئیدها را در مغز نشان می‌دهند (24). کورتیکواستروئیدها می‌توانند اثرات خود را از طریق تنظیم جایگاه‌های خاصی روی سابیونیت‌های گیرنده GABAA به انجام برسانند (25). این احتمال وجود دارد که در پژوهش حاضر‌، افزایش بیان ژن GABAA-α2 در گروه گنادکتومی دریافت‌کننده دوز 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین با احتمال افزایش برخورد بیشتر نورواستروئیدهای مغزی با گیرنده GABAA همراه شود که این مهم می‌تواند تحریک این گیرنده را افزایش دهد، اثرات مهاری بیشتری را اعمال کند و سبب اختلال حافظه در این گروه شود.

در مطالعه حاضر گروه گنادکتومی نسبت به گروه گنادکتومی دریافت‌کننده حلال از نظر میزان STL تفاوت معناداری نداشت. این مهم حاکی از آن می‌باشد که حلال عصاره (DMSO) بر فرایند حافظه و یادگیری در موش‌های گنادکتومی تأثیر چندانی نداشته است. از سوی دیگر، نتایج نشان دادند که میزان STL در گروه گنادکتومی تیمار شده با دوز 5/3 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین نسبت به گروه دریافت‌کننده حلال، تفاوت معناداری داشته است که این کاهش احتمالاً ناشی از اثر مستقیم یا غیر مستقیم بر گیرنده GABAA می‌باشد.

Jarogniew و همکاران نیز در سال 2010 با استفاده از روش کیندلینگ الکتریکی، تشنج را در موش‌ها ایجاد کردند و سپس با تزریق درون صفاقی کومارین به موش‌ها متوجه شدند که کومارین، آستانه تشنج را به شدت کاهش داده و احتمالاً این عمل از طریق اتصال کومارین به رسپتور GABA و افزایش فعالیت آن ایجاد شده است (26).

در مقایسه نتایج ذکر شده با پژوهش حاضر، احتمالاً کومارین با اتصال به جایگاه بنزودیازپین در رسپتورهای GABAA باعث افزایش فعالیت این گیرنده شده و با باز شدن کانال کلری این گیرنده موجب تقویت هیپرپلاریزاسیون گردیده و در نهایت سبب تشدید اختلال در حافظه موش‌های نر گنادکتومی شده است.

در پژوهش حاضر به منظور بیان ژن از آزمون Real time PCR استفاده شد. نتایج نشان دادند که در آزمون RT-PCR، بیان ژن GABAA-a5 و GABAA-α2 در گروه گنادکتومی با گروه سالم و همچنین گروه گنادکتومی دریافت‌کننده حلال، تفاوت معناداری وجود ندارد؛ از این رو احتمالاً گنادکتومی تأثیر چندانی بر بیان این دو ژن نداشته و اثرات کاهش حافظه در این دو گروه بیشتر ناشی از تأثیر گنادکتومی بر تعداد نورون‌های هرمی سالم هیپوکامپ می‌باشد؛ اما بیان ژن GABAA-α2 در گروه گنادکتومی تیمار شده با دوز 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین، افزایش معناداری را نشان داد. از آنجایی که تراکم بالای گیرنده‌های GABAA در هیپوکامپ بیانگر این هستند که فعال‌سازی این گیرنده‌ها فرایند حافظه و یادگیری را کنترل می‌کنند (27)؛ بنابراین، این احتمال وجود دارد که اختلال حافظه در این گروه به علت افزایش بیان ژن GABAA-α2، افزایش تعداد سیناپس‌های مهاری GABA، افزایش مدت زمان این سیناپس‌ها و حساسیت بیشتر این گیرنده‌ها به GABA باشد. این مهم نشان‌دهنده همپوشانی آزمون‌های هیستولوژی و RT-PCR در پژوهش حاضر می‌باشد. این نتایج با یافته‌های مطالعات پیشین همخوانی دارد.

در این راستا، Hofmann و همکاران نشان دادند که تجویز دیازپام به موش‌های وحشی و جهش‌یافته ژن GABAA-α2 باعث تغییر الگوهای فعالیت الکتریکی خود به خود در قشر مغز با استفاده از بنزودیازپین می‌شود؛ به طوری که افزایش کم فرکانس γ تولید شده توسط دیازپام ممکن است منعکس‌کننده افزایش هماهنگی داخل قشر مغزی باشد. در افزایش بالای باند فرکانس γ، دیازپام قدرت فرکانس را از طریق گیرنده‌های GABAA-α2 کاهش
می‌دهد (28).

Nomura و همکاران نیز در مطالعه‌ای متوجه شدند که تقویت زیرواحد α2 حاوی گیرنده‌های GABAA در مدل سندروم Dravet (صرع شدید میوکلونیک در دوران نوزادی)، موش‌ها را در برابر تشنج محافظت می‌کند (29).

در پژوهش حاضر آزمون هیستولوژی با رنگ‌آمیزی نیسل جهت بررسی تراکم نورونی سلول‌های هرمی سالم هیپوکامپ مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان دادند که گنادکتومی سبب کاهش سلول‌های هرمی سالم هیپوکامپ و اختلال حافظه در موش‌ها گردیده است. کاهش تعداد سلول‌های هرمی سالم در گروه گنادکتومی تیمار شده با دوز 5/3 میلی‌گرم بر کیلوگرم کومارین، احتمالاً نشان از تخریب سلول‌های هرمی هیپوکامپ دارد که مؤید نتایج مطالعاتKowalczyk  و همکاران در سال 2020 است. این پژوهشگران بیان نمودند که کومارین دارای اثرات ضد سرطانی و ضد میکروبی می‌باشد. با این وجود، مصرف بیش از حد کومارین ممکن است تأثیر منفی بر سلامت سلول زنده بگذارد و حتی باعث تخریب سلول‌های کبد و ریه شود. علاوه‌براین، کومارین با داشتن اثرات سمی باعث تخریب سلول‌های زنده از جمله باکتری‌ها می‌شود (30،31). این نتایج با یافته‌های مطالعه حاضر همخوانی دارد؛ بنابراین به نظر می‌رسد سمیت کومارین به صورت وابسته به دوز بر روند تکثیر سلول‌های هرمی در هیپوکامپ اثر گذاشته است.

نتیجه‌گیری

گنادکتومی باعث اختلال حافظه و کاهش تعداد نورون‌های هیپوکامپ می‌شود. کومارین از طریق افزایش بیان ژن GABAA-a2 سبب ایجاد هیپرپلاریزاسیون بیشتر شده و با کاهش تعداد نورون‎های هرمی سالم در هیپوکامپ موش‌های گنادکتومی باعث اختلال در حافظه می‌شود.

تشکر و قدردانی

بدین‌وسیله از مسئولین دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم و نیز دانشگاه علوم پزشکی قم که در راستای انجام این پژوهش با پژوهشگران همکاری نمودند، تشکر و قدردانی می‌گردد.