دوره 15، شماره 1 - ( فروردین 1400 )
جلد 15 شماره 1 صفحات 47-38 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Soleimani Mehranjani M, Delbari N, Ahmadi S. The Effects of Quercetin on the Tissue Quality and Function of Mouse Autotransplanted Ovary. Qom Univ Med Sci J 2021; 15 (1) :38-47
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3012-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3012-fa.html
سلیمانی مهرنجانی ملک، دلبری نعیمه، احمدی سپیده. اثر کوئرستین بر کیفیت بافت و عملکرد تخمدان اتوگرفت موش. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1400; 15 (1) :38-47
1- گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه اراک، اراک، ایران ، m-soleimani@araku.ac.ir
2- گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه اراک، اراک، ایران
2- گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه اراک، اراک، ایران
متن کامل [PDF 5905 kb]
(510 دریافت)
| چکیده (HTML) (1491 مشاهده)
متن کامل: (577 مشاهده)
مقدمه
با توسعه برنامههای پیشگیری از سرطان، تشخیص زودهنگام و روشهای مدرن درمان سیتوتوکسیک در دوران کودکی، نوجوانی و بلوغ، جمعیت افراد درمانشده در سنین مختلف تا حد زیادی افزایش یافته است. با وجود پیشرفتهای روزافزون در روشهای درمان سرطان، مانند شیمیدرمانی، رادیوتراپی و پیوند مغز استخوان، این روشهای درمانی فعالیت تولید مثلی و اندوکرینی این افراد را تحت تأثیر قرار داده و تعداد بسیار زیادی از زنان و دختران جوان مبتلا به سرطان تحت این روشهای درمانی دچار ناباروی یا ناتوانی زودرس تخمدانی میشوند. این در حالی است که این افراد خواهان حفظ باروری پس از بهبودی هستند و حفظ باروری این بیماران قبل از شروع درمان ضروری به نظر میرسد [1، 2]. اتوگرفت بافت تخمدان یکی از رایجترین راهکارهای حفظ باروری در این بیماران است [3]. اما آسیب ایسکمی ریپرفیوژن از محدودیتهای اصلی پیوند بافت تخمدان به شمار میرود [4]. تولید بیش از حد رادیکالهای آزاد اکسیژن و پراکسیداسیون لیپیدی در طی ایسکمی ریپرفیوژن پس از پیوند، مکانیسمهای متعدد مخربی چون مهار عملکرد میتوکندری، افزایش سطح کلسیم، التهاب و مرگ سلولی را موجب میشود [5، 6] که درنهایت باعث از بین رفتن تعداد زیادی از فولیکولها در تخمدان پیوندی میشود [7]؛ به طوری که گروهی از محققین بیان کردهاند که آسیب ایسکمی در طی فرایند اتوگرفت بافت تخمدان، منجر به تهی شدن ۶۰-۹۵ درصد از ذخائر فولیکولی میشود [8]؛ بنابراین حذف رادیکالهای آزاد به عنوان هدف دارویی مهمی برای بهبود عوارض ایسکمی ریپرفیوژن شناخته شدهاند [9]. بررسی مطالعات صورتگرفته در این زمینه بهخوبی روشن میکند که همگام با پیوند بافت، اقداماتی نیز باید جهت کاهش آسیبهای ایسکمی ریپرفیوژن صورت پذیرد. در مطالعهای که نوگنت در سال ۱۹۹۸ انجام داد به این نتیجه رسید که افزودن آنتی اکسیدان از طریق کاهش آسیبهای ایسکمی ریپرفیوژن، موجب بهبود بقای فولیکولی در طی پیوند بافت تخمدان میشود [10]. کوئرستین با فرمول مولکولی C15H10O7 به عنوان یکی از مهمترین و فراوانترین ترکیبات خانواده فلاونوئیدها به شمار میرود که در میوهها (عمدتاً مرکبات)، سبزیجات، بسیاری از دانهها، روغن زیتون، سیب، پیاز، چای سبز، شراب قرمز و توت یافت میشود و دارای بیشترین خاصیت آنتیاکسیدانی در میان فلاونوئیدهاست [11-13].
کوئرستین دارای خاصیت آنتیاکسیدانی و ضدالتهابی است؛ به طوری که باعث حفظ سطح سرمی گلوتاتیون، کاهش سطح سرمی مالون دیآلدئید، کاهش متابولیسم نیتریک اکسید، کاهش تشکیل سوپراکسید، کاهش آزادسازی واسطههای اکسیدانی و التهابی میشود [13، 14]. خواص آنتیاکسیدانی فلاونوئیدها به دلیل ویژگی مهارکننده هیدروژن و رادیکالهای آزاد است. بنابراین از سلول در برابر مرگ آپوپتوز ناشی از اکسیدان محافظت میکنند [15]. ژنسر و همکارانش، مطالعهای پیرامون اثر حفاظتی کوئرستین بر سطوح آلبومین تغییریافته ایسکمی (به عنوان یک مارکر برای شرایط مربوط به ایسکمی و التهاب) و آپوپتوز در آسیب آزمایشی ایسکمی ریپرفیوژن تخمدان در رت انجام دادند. در این تحقیق کوئرستین با دُز 15 میلیگرم / کیلوگرم / وزن بدن به صورت داخل صفاقی 30 دقیقه قبل از ایجاد ایسکمی ریپرفیوژن تزریق شد. آنها نشان دادند که تیمار با کوئرستین باعث کاهش پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از ایسکمی ریپرفیوژن میشود، از آسیب ایسکمی ریپرفیوژن تخمدان جلوگیری و به حفظ مرفولوژی طبیعی تخمدان کمک میکند [15]؛ بنابراین با توجه به نقش آنتیاکسیدانی، آنتیآپوپتوزی و ضد التهابی کوئرستین، در مطالعه حاضر اثر آن بر کاهش آسیبهای ایسکمی-ریپرفیوژن، کیفیت بافت و عملکرد تخمدان اتوگرفت موش مورد بررسی قرار گرفت.
روش بررسی
در این مطالعه از 36 سر موش ماده 4 تا 5هفتهای نژاد NMRI استفاده شد. این حیوانات از مؤسسه پاستور در تهران تهیه و در خانه حیوانات دانشگاه اراک، در شرایط متعادل (دمای 2 ± 21 درجه سانتیگراد و نور محیطی با شرایط 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی) به مدت یک هفته قبل از انجام آزمایش جهت تطبیق با محیط نگهداری شدند و آب و غذای کافی در اختیار آنها قرار گرفت. موشها به سه گروه شامل گروه کنترل، گروه اتوگرفت (تزریق نرمال سالین به صورت درون صفاقی یک روز قبل تا هفت روز بعد از پیوند) و گروه اتوگرفت + کوئرستین (دریافتکننده کوئرستین با دُز 50 میلیگرم بر کیلوگرم در روز [16، 17] به صورت درون صفاقی یک روز قبل تا هفت روز بعد از پیوند) تقسیم شدند و هر گروه به دو زیرگروه (6=n) تقسیم شد: زیرگروه هفت روز بعد از پیوند (برای اندازهگیری غلظت مالون دیآلدئید و ظرفیت آنتیاکسیدانی کل سرم) و زیرگروه 28 روز بعد از پیوند (برای بررسیهای بافتشناسی، سیکل استروس و سنجش غلظت هورمونها و مالون دیآلدئید سرم). به منظور انجام پیوند تخمدان، ابتدا موشها با ترکیب دو ماده بیهوشی کتامین (100 میلیگرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلیگرم بر کیلوگرم) بیهوش شدند. به این صورت که به ازای هر 10 گرم وزن موش 100 لاندا از آن به صورت درون صفاقی تزریق شد. پس از بیهوش کردن، موهای پشت بدن جانور در هر دو سمت به وسیله تیغ تراشیده شد. سپس در دو طرف ستون فقرات، برشهای کوچکی (حدودا نیم سانتیمتر) در پوست و صفاق ایجاد شد و تخمدانها از اویداکت و چربی جدا و بلافاصله به عضله سرینی سطحی پیوند زده شد. 28 روز پس از پیوند ابتدا موشها با ترکیب ماده بیهوشی کتامین زایلازین بیهوش شدند. پوست ناحیه موردنظر برای خروج تخمدان از محل پیوند (عضله پشتی) برداشته شد، بعد از آن ماهیچه در ناحیه پیوند باز شده و تخمدان با دقت از ماهیچه جدا و به محلول فیکساتیو بوئن به مدت 24 ساعت انتقال داده شد و از قلب موشها خونگیری انجام گرفت، سپس نمونههای خون به مدت 10 دقیقه با 13 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و نمونههای سرم جهت اندازهگیری سطح هورمونهای استرادیول و پروژسترون و میزان مالون دیآلدئید مورد استفاده قرار گرفت. بعد از انجام مراحل پاساژ بافتی و قالبگیری، به کمک دستگاه میکروتوم از بلوکهای پارافینی تهیهشده به روش IUR، برشهای 5 و 20میکرونی به طور متناوب و به صورت سریال تهیه و با رنگآمیزی هماتوکسیلین ائوزین رنگآمیزی شد. سپس با استفاده از روشهای استریولوژی، پارامترهای کمی از جمله حجم کل تخمدان، حجم کورتکس، حجم مدولا و تعداد انواع مختلف فولیکولها اندازهگیری شد.
محاسبه حجم کل تخمدان، حجم کورتکس و حجم مدولا با استفاده از روش کاوالیری انجام گرفت. ابتدا با استفاده از میکروسکوپ نوری (BX41TF, Olympus, Japan) و نرم افزار Olysia، تصویر برشهای 5میکرونی با بزرگنمایی 40 برابر روی مانیتور انداخته شد. سپس پروب نقطهای به طور تصادفی و بدون هیچگونه سوگیری روی تصویر انداخته و نقاط برخورد کرده با کل تصویر تخمدان، کورتکس و مدولا (به طور جداگانه) شمارش شدند. حجم کل تخمدان با استفاده از فرمول شماره 1 و با وارد کردن مجموع نقاط شمارششده در هر برش (∑P)، ضخامت مقاطع (t) و سطح پروب نقطهای a(p)، به دست آمد.
1.
Vtotal ovary = ∑ni=1p × a(P) × t
برای محاسبه حجم کورتکس و مدولا، ابتدا دانسیته حجمی کورتکس و مدولا محاسبه شد. سپس حجم کورتکس و مدولا به طور غیر مستقیم به وسیله ضرب کردن دانسیته حجمی در حجم کل تخمدان طبق فرمول شماره 2 تخمین زده شد [18].
2.
Vvcortex/medulla =
Vvcortex/medulla = Vtotal ovary × Vvcortex/medulla
برای محاسبه تعداد فولیکولها از روش اپتیکال دایسکتور و از فریم مخصوص شمارش و دستگاه میکروکیتور (Heidenhain ND221B, Germany) استفاده شد. در این روش با استفاده از میکروسکوپ نوری متصل به کامپیوتر تصویر برشهای ۲۰ میکرونی با بزرگنمایی 1000 برابر روی مانیتور قرار داده شد و میدان دیدهای تصادفی انتخاب شدند، سپس از دو ناحیه به نام حفاظت شده به ضخامت ۵ میکرون از بالا و پایین برش برای شمارش صرف نظر شد (به دلیل وجود آرتیفکتهای احتمالی در سطح بافت) و تمام انواع فولیکولهایی که در فریم شمارش نصبشده روی صفحهی مانیتور کامپیوتر انتخاب شدند، شمارش شدند. در ادامه ابتدا بر اساس فرمول شماره 3، دانسیته عددی انواع فولیکولها محاسبه شد.
3.
Nv =
که در آن ΣQ مجموع تعداد فولیکولهای شمارششده، Σp مجموع نقاط وسط فریم که با میدانهای دید انتخابی برخورد کرده، h ارتفاعی که شمارش در آن انجام گرفت و a/f مساحت فریم در مقیاس واقعی بافت است.
سپس تعداد مطلق فولیکولها با ضرب دانسیته عددی در حجم کل تخمدان به دست آمد (فرمول شماره 4) [18].
4.
Ntotal = Vtotal ovary × Nv
سنجش میزان غلظت هورمونهای استرادیول و پروژسترون سرم خون با کیت ELISA (شرکت DRG آلمان) و طبق پروتکل شرکت انجام گرفت. درنهایت میزان جذب با دستگاه الیزا ریدر در طول موج 450 نانومتر اندازهگیری و بر حسب نانوگرم بر میلیلیتر گزارش شد.
هفت روز بعد از پیوند، نمونههای خون از قلب موشها جمعآوری و به مدت 10 دقیقه با 13 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و بعد از جداسازی سرم، نمونههای سرم در دمای منفی 80 درجه سانتیگراد تا زمان آنالیز بیوشیمیایی سرم (اندازهگیری میزان مالون دیآلدئید و ظرفیت آنتیاکسیدانی کل) نگهداری شدند. اندازهگیری مالون دیآلدهید طبق روش Buege و Aust انجام گرفت. ابتدا محلول واکنش شامل تریکلرواستیک اسید 15 درصد گرم بر میلیلیتر، تیوباربیوتیک اسید 375 درصد گرم بر میلیلیتر و اسید کلریدریک 25/0 نرمال تهیه شد. سپس 50 میکرولیتر از نمونه سرم با 100 میکرولیتر از محلول تهیهشده مخلوط شد و نمونهها به مدت 15 دقیقه در بنماری جوش قرار داده شد. سپس نمونهها بهسرعت توسط آب سرد، خنک و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی جدا شد و جذب آن در 532 نانومتر در برابر بلانک که حاوی تمام ترکیبات به جز نمونه بود، قرائت شد. درنهایت غلظت مالون دیآلدئید با استفاده از ضریب خاموشی آن که عبارت است از 1-MC1-M105×56/1، محاسبه شد و بر حسب نانومول بر میلیلیتر گزارش شد [19].
برای اندازهگیری ظرفیت آنتیاکسیدانی کل سرم از تست FRAP استفاده شد. روش انجام تست FRAP بدینگونه بود که به ازای هر 50 میکرولیتر از نمونه سرم، 5/1 میلیلیتر از معرف ساختهشده اضافه شد و به مدت 5 دقیقه در بنماری در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت و جذب آن در طول موج 593 نانومتر خوانده شد. سپس با استفاده از فرمول رگرسیون حاصل در منحنی استاندارد، میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی تام نمونهها بر حسب میکرومول بر میلیلیتر به دست آمد [20].
برای بررسی سیتولوژی واژن به عنوان شاخص از سرگیری فعالیتهای سیکلی تخمدان، از روز هفتم بعد از پیوند و به صورت روزانه تا ظهور اولین پروفایل سیکل استروس، اسمیر واژنی از گروههای مختلف 28 روزه تهیه شد. با یک سوآپ مرطوبشده با آبمقطر دیواره واژن بهآرامی خراشیده شد و با چرخاندن سوآپ داخل مجرای واژن موش، سلولهای مجرای واژن کنده شده و به اسلاید شیشهای منتقل شد. اسمیر واژنی هر موش بلافاصله بعد از تهیه، با ائوزین رنگآمیزی و زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 40 برابر مشاهده و بررسی شد. مرحله سیکل استروس از نوع سلولها ( سلولهای اپیتلیال شاخی) تعیین شد.
دادههای حاصل توسط نرمافزار SPSS و روش آنالیز واریانس یکطرفه و تست آماری توکی مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و تفاوت میانگینها در سطح 05/P<0 معنیدار درنظر گرفته شد.
یافتهها
با بررسی میکروسکوپی مقاطع بافتی و مقایسه آنها در گروههای مختلف مشاهده شد که تخمدانهای گروه کنترل دارای تعداد زیادی از انواع فولیکولها بودند. در حالیکه فولیکولهای مختلف در گروه اتوگرفت کاهش قابل توجهی پیدا کردند. در گروه اتوگرفت + کوئرستین فولیکولها نسبت به گروه اتوگرفت تراکم بیشتری را نشان دادند (تصویر شماره 1).
میانگین حجم کل تخمدان، حجم کورتکس و حجم مدولا در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل به طور معنیداری کاهش یافت (001/P<0). از طرفی افزایش معنیداری در میانگین حجم کل تخمدان (001/P<0)، حجم کورتکس (01/P<0) و حجم مدولا (01/P<0) در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت مشاهده شد و میانگین حجم مدولا به سطح گروه کنترل رسید (05/P>0) (جدول شماره 1).
مقایسه میانگین تعداد فولیکولهای بدوی، اولیه، پرهآنترال و آنترال و تعداد کل فولیکولها در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل، کاهش معنیداری را نشان داد (001/P<0). در حالی که افزایش معنیداری در میانگین تعداد فولیکولهای بدوی (01/P<0)، اولیه (001/P<0)، پرهآنترال (001/P<0) و آنترال (001/P<0) و تعداد کل فولیکولها (001/P<0) در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت مشاهده شد (001/P<0) و در میانگین، تعداد فولیکولهای اولیه و تعداد کل فولیکولها به سطح گروه کنترل رسید (05/P>0) (جدول شماره 2).
کاهش معنیداری در میانگین سطح هورمونهای استرادیول (05/P<0) و پروژسترون (001/P<0) در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. در حالی که میزان هورمونهای استرادیول (01/P<0) و پروژسترون (001/P<0) در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت دارای افزایش معنیدار بود (001/P<0) و در حد گروه کنترل جبران شد (05/P>0) (جدول شماره 3).
شروع سیکل استروس در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل به طور معنیداری دیرتر رخ داد (001/P<0). در گروه اتوگرفت + کوئرستین، شروع سیکل استروس به طور معنیداری زودتر از گروه اتوگرفت مشاهده شد (001/P<0). به طوری که در مقایسه با گروه کنترل اختلاف معنیداری را نشان نداد (05/P>0) (جدول شماره 3).
افزایش معنیداری در میانگین سطح مالون دیآلدئید هفتروزه (001/P<0) و 28روزه (01/P<0) در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. این پارامتر در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت به طور معنیداری کاهش یافت (001/P<0) و نسبت به گروه کنترل تفاوت معنیداری را نشان نداد (05/P>0) (جدول شماره 4). مقایسه میانگین ظرفیت آنتیاکسیدانی کل در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری را نشان داد (01/P<0). از طرفی افزایش معنیداری در میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی کل در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت مشاهده شد (01/P<0) و این افزایش در سطح گروه کنترل بود (05/P>0) (جدول شماره 4).
بحث
با توجه به نتایج مطالعه حاضر، میانگین حجم کل تخمدان، حجم کورتکس و حجم مدولا و همچنین تعداد انواع مختلف فولیکولها در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل، به طور معنیداری کاهش یافت. این نتایج مطابق با تعدادی از مطالعات پیشین است که طبق گزارشات آنها، این پارامترها در گروه اتوگرفت به طور معناداری کاهش یافته است [21، 22]. همچنین در مطالعه حاضر با مقایسه حجم کل تخمدان، حجم کورتکس، حجم مدولا و تعداد انواع مختلف فولیکولها در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت، افزایش معنیداری مشاهده شد. مطالعات نشان دادهاند که تولید رادیکالهای آزاد و وقوع التهاب و آپوپتوز در بافتی که دچار شرایط ایسکمی شده است [22]، موجب آترزی فولیکولی و کاهش تشکیل جسم زرد در تخمدانهای اتوگرفت میشود [21] و این میتواند دلیلی برای کاهش حجم تخمدان و کورتکس در گروه اتوگرفت باشد. از طرفی مرکز بافت پیوندی، بیشتر از نواحی کناری بافت در معرض خطر هیپوکسی و به دنبال آن ایسکمی قرار دارد که خود میتواند منجر به کاهش حجم مدولا شود [23]. آسیب ایسکمی ریپرفیوژن سبب تولید واسطههای استرس اکسیداتیو مثل رادیکالهای آزاد اکسیژن از سلولهای ملتهب در اطراف ناحیه دچار ایسکمی ریپرفیوژن میشود [24] و این رها شدن رادیکالهای آزاد باعث بیان ژنهای پیشبرنده التهاب میشود. درنتیجه میزان سایتوکینها افزایش یافته و بیان مولکولهای اتصالی مثل مولکول اتصال داخل سلولی P-selectin ،ICAM-1 و E-selectin در سطح سلولهای اندوتلیال القا شده که سبب اتصال لکوسیتها به سلولهای اندوتلیالی در بافت آسیبدیده میشود؛ به طوری که لکوسیتها به دیواره رگها چسبیده و به بافت آسیبدیده مهاجرت و شروع به ترشح واسطههای پیشبرنده التهابی و آسیب ثانویه بافتی میکنند [25]. مشخص شده است که اثر آنتیاکسیدانی کوئرستین در شرایطی که سطح التهاب و استرس اکسیداتیو بالاتر باشد بیشتر است [26]. اثر آنتیاکسیدانی کوئرستین توسط چندین مکانیسم از جمله مهار رادیکال آزاد، حفاظت سلول، شلاته کردن یونهای فلزی و نمایش اثرات ضدالتهابی به واسطه پایبندی کاهش لکوسیت رخ میدهد [15]. همچنین کوئرستین توانایی کاهش سایتوکینهای التهابی مانند IL-18 و افزایش انواع سایتوکاینهای ضدالتهابی مانند IL-10 را داراست [27].
در این مطالعه، میانگین غلظت هورمونهای استرادیول و پروژسترون سرم خون در گروه اتوگرفت به طور معنیداری از گروه کنترل پایینتر بود و شروع سیکل استروس نیز در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل به طور معنیداری دیرتر رخ داد. این نتایج با گزارش گروهی از محققین مطابقت دارد [21، 22]. همچنین نتایج مطالعه ما، افزایش معنیداری در میانگین میزان این پارامترها در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه کنترل نشان داد. با توجه به مطالعات صورتگرفته پیشین، اندوکرینولوژی در حیوانات با تخمدان پیوندشده میتواند در بررسی نتایج مربوط به بهبود تکوین اووسیت و فولیکول و همچنین در بازگشت عملکرد طبیعی تخمدان کمک کند [28]. از آنجایی که فولیکولهای آنترال مسئول ترشح بخش مهمی از استرادیول و جسم زرد نیز مسئول ترشح هورمون پروژسترون هستند [29]، کاهش تعداد فولیکولهای آنترال و جسم زرد پس از پیوند میتواند عاملی برای کاهش استرادیول و پروژسترون در گروه اتوگرفت باشد. اثرات مفید کوئرستین در روند فولیکولوژنز و لوتئینیزاسیون از طریق کاهش قابل توجه فولیکولهای آترتیک و کیستیک، افزایش فولیکولهای نرمال در مراحل مختلف رشد و عروقزایی در لایه تکا گزارش شده است [30].
با توجه به نتایج تحقیق حاضر، افزایش معنیداری در میانگین میزان مالون دیآلدئید سرم خون (هفت و 28روزه) در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل مشاهده شد و مقایسه میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی کل در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل، کاهش معنیداری را نشان داد. این نتایج در راستای یافتههای تحقیق گروهی از محققین در سالهای پیشین است [21، 22] و این میتواند به دلیل وقوع استرس اکسیداتیو در طول ایسکمی ریپرفیوژن [31] در تخمدان اتوگرفت باشد. درواقع آسیب رادیکالهای آزاد، مکانیسمی است که در فازهای اولیه ایسکمی شروع میشود و یکی از وقایع اصلی در این زمان، وقوع پراکسیداسیون لیپیدی است [32]. واکنش رادیکالهای آزاد با لیپیدها، تحت واکنش پراکسیداسیون لیپیدی موجب تشکیل پراکسیدهای لیپیدی میشود. رادیکالهای آزاد با لیپیدها واکنشهای زنجیرهای مخربی را شروع میکنند. اکسیداسیون لیپید باعث تولید رادیکال بسیار فعال آلکیل میشود که بهسرعت با اکسیژن واکنش داده و رادیکال پراکسید تولید میکند. رادیکالهای پراکسید نیز میتوانند باعث اکسید شدن لیپیدها شوند و لیپید هیدرو پراکسیدهایی تولید کنند که به ترکیبات متعددی نظیر الکلها، آلدئیدها، فورما آلکیلها، کتونها و هیدروکربنها و رادیکالهایی نظیر آلکوکسیل تجزیه میشوند. یکی از ترکیبات حاصل از پراکسیداسیون لیپیدی، مالون دیآلدئید است [33].
مالون دیآلدئید و آلدئیدهای مشابه حاصل از پراکسیداسیون لیپید میتوانند با پروتئینها و DNA مکانهای فعال نوکلئوفیل در فسفولیپیدها واکنش داده و ضایعات متنوعی ایجاد کنند [34]. از طرفی در مطالعه حاضر در گروه اتوگرفت + کوئرستین، کاهش معنیداری در میانگین سطح مالون دیآلدئید و افزایش معنیداری در میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی کل نسبت به گروه اتوگرفت مشاهده شد. در همین راستا برخی مطالعات نیز گزارش کرده اند که کوئرستین باعث حفظ سطح سرمی آنتیاکسیدان گلوتاتیون و کاهش سطح سرمی مالون دیآلدئید میشود [13، 14]. این یافتهها نشان میدهد که کوئرستین به عنوان یک آنتیاکسیدان توانسته موجب کاهش استرس اکسیداتیو و افزایش ظرفیت آنتیاکسیدانی کل شود.
نتیجهگیری
نتایج این پژوهش نشان داد که کوئرستین میتواند از طریق ممانعت از استرس اکسیداتیو به طور موثری آسیب ایسکمی ریپرفیوژن را مهار کرده و موجب بهبود کیفیت بافت تخمدان اتوگرفت موش، بقا و تکوین فولیکولی و نیز بازگشت سریعتر عملکرد تخمدان شود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
در این مطالعه اصول اخلاق کار با حیوانات رعایت شده است.
حامی مالی
این مقاله برگرفته از پایاننامه کارشناسی ارشد نویسنده دوم در گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه اراک است، و معاون پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک از آن حمایتمالی کرده است.
مشارکت نویسندگان
تحقیق و بررسی: ملک سلیمانی مهرنجانی و نعیمه دلبری؛ منابع: سپیده احمدی و نعیمه دلبری؛ نگارش پیشنویس: سپیده احمدی؛ ویراستاری و نهاییسازی نوشته: ملک سلیمانی مهرنجانی؛ نظارت: ملک سلیمانی مهرنجانی؛ مدیریت پروژه: ملک سلیمانی مهرنجانی.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از همکاریهای آقای فراهانی، کارشناس آزمایشگاه تحقیقاتی گروه زیستشناسی دانشگاه اراک، تشکر میکنیم.
با توسعه برنامههای پیشگیری از سرطان، تشخیص زودهنگام و روشهای مدرن درمان سیتوتوکسیک در دوران کودکی، نوجوانی و بلوغ، جمعیت افراد درمانشده در سنین مختلف تا حد زیادی افزایش یافته است. با وجود پیشرفتهای روزافزون در روشهای درمان سرطان، مانند شیمیدرمانی، رادیوتراپی و پیوند مغز استخوان، این روشهای درمانی فعالیت تولید مثلی و اندوکرینی این افراد را تحت تأثیر قرار داده و تعداد بسیار زیادی از زنان و دختران جوان مبتلا به سرطان تحت این روشهای درمانی دچار ناباروی یا ناتوانی زودرس تخمدانی میشوند. این در حالی است که این افراد خواهان حفظ باروری پس از بهبودی هستند و حفظ باروری این بیماران قبل از شروع درمان ضروری به نظر میرسد [1، 2]. اتوگرفت بافت تخمدان یکی از رایجترین راهکارهای حفظ باروری در این بیماران است [3]. اما آسیب ایسکمی ریپرفیوژن از محدودیتهای اصلی پیوند بافت تخمدان به شمار میرود [4]. تولید بیش از حد رادیکالهای آزاد اکسیژن و پراکسیداسیون لیپیدی در طی ایسکمی ریپرفیوژن پس از پیوند، مکانیسمهای متعدد مخربی چون مهار عملکرد میتوکندری، افزایش سطح کلسیم، التهاب و مرگ سلولی را موجب میشود [5، 6] که درنهایت باعث از بین رفتن تعداد زیادی از فولیکولها در تخمدان پیوندی میشود [7]؛ به طوری که گروهی از محققین بیان کردهاند که آسیب ایسکمی در طی فرایند اتوگرفت بافت تخمدان، منجر به تهی شدن ۶۰-۹۵ درصد از ذخائر فولیکولی میشود [8]؛ بنابراین حذف رادیکالهای آزاد به عنوان هدف دارویی مهمی برای بهبود عوارض ایسکمی ریپرفیوژن شناخته شدهاند [9]. بررسی مطالعات صورتگرفته در این زمینه بهخوبی روشن میکند که همگام با پیوند بافت، اقداماتی نیز باید جهت کاهش آسیبهای ایسکمی ریپرفیوژن صورت پذیرد. در مطالعهای که نوگنت در سال ۱۹۹۸ انجام داد به این نتیجه رسید که افزودن آنتی اکسیدان از طریق کاهش آسیبهای ایسکمی ریپرفیوژن، موجب بهبود بقای فولیکولی در طی پیوند بافت تخمدان میشود [10]. کوئرستین با فرمول مولکولی C15H10O7 به عنوان یکی از مهمترین و فراوانترین ترکیبات خانواده فلاونوئیدها به شمار میرود که در میوهها (عمدتاً مرکبات)، سبزیجات، بسیاری از دانهها، روغن زیتون، سیب، پیاز، چای سبز، شراب قرمز و توت یافت میشود و دارای بیشترین خاصیت آنتیاکسیدانی در میان فلاونوئیدهاست [11-13].
کوئرستین دارای خاصیت آنتیاکسیدانی و ضدالتهابی است؛ به طوری که باعث حفظ سطح سرمی گلوتاتیون، کاهش سطح سرمی مالون دیآلدئید، کاهش متابولیسم نیتریک اکسید، کاهش تشکیل سوپراکسید، کاهش آزادسازی واسطههای اکسیدانی و التهابی میشود [13، 14]. خواص آنتیاکسیدانی فلاونوئیدها به دلیل ویژگی مهارکننده هیدروژن و رادیکالهای آزاد است. بنابراین از سلول در برابر مرگ آپوپتوز ناشی از اکسیدان محافظت میکنند [15]. ژنسر و همکارانش، مطالعهای پیرامون اثر حفاظتی کوئرستین بر سطوح آلبومین تغییریافته ایسکمی (به عنوان یک مارکر برای شرایط مربوط به ایسکمی و التهاب) و آپوپتوز در آسیب آزمایشی ایسکمی ریپرفیوژن تخمدان در رت انجام دادند. در این تحقیق کوئرستین با دُز 15 میلیگرم / کیلوگرم / وزن بدن به صورت داخل صفاقی 30 دقیقه قبل از ایجاد ایسکمی ریپرفیوژن تزریق شد. آنها نشان دادند که تیمار با کوئرستین باعث کاهش پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از ایسکمی ریپرفیوژن میشود، از آسیب ایسکمی ریپرفیوژن تخمدان جلوگیری و به حفظ مرفولوژی طبیعی تخمدان کمک میکند [15]؛ بنابراین با توجه به نقش آنتیاکسیدانی، آنتیآپوپتوزی و ضد التهابی کوئرستین، در مطالعه حاضر اثر آن بر کاهش آسیبهای ایسکمی-ریپرفیوژن، کیفیت بافت و عملکرد تخمدان اتوگرفت موش مورد بررسی قرار گرفت.
روش بررسی
در این مطالعه از 36 سر موش ماده 4 تا 5هفتهای نژاد NMRI استفاده شد. این حیوانات از مؤسسه پاستور در تهران تهیه و در خانه حیوانات دانشگاه اراک، در شرایط متعادل (دمای 2 ± 21 درجه سانتیگراد و نور محیطی با شرایط 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی) به مدت یک هفته قبل از انجام آزمایش جهت تطبیق با محیط نگهداری شدند و آب و غذای کافی در اختیار آنها قرار گرفت. موشها به سه گروه شامل گروه کنترل، گروه اتوگرفت (تزریق نرمال سالین به صورت درون صفاقی یک روز قبل تا هفت روز بعد از پیوند) و گروه اتوگرفت + کوئرستین (دریافتکننده کوئرستین با دُز 50 میلیگرم بر کیلوگرم در روز [16، 17] به صورت درون صفاقی یک روز قبل تا هفت روز بعد از پیوند) تقسیم شدند و هر گروه به دو زیرگروه (6=n) تقسیم شد: زیرگروه هفت روز بعد از پیوند (برای اندازهگیری غلظت مالون دیآلدئید و ظرفیت آنتیاکسیدانی کل سرم) و زیرگروه 28 روز بعد از پیوند (برای بررسیهای بافتشناسی، سیکل استروس و سنجش غلظت هورمونها و مالون دیآلدئید سرم). به منظور انجام پیوند تخمدان، ابتدا موشها با ترکیب دو ماده بیهوشی کتامین (100 میلیگرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلیگرم بر کیلوگرم) بیهوش شدند. به این صورت که به ازای هر 10 گرم وزن موش 100 لاندا از آن به صورت درون صفاقی تزریق شد. پس از بیهوش کردن، موهای پشت بدن جانور در هر دو سمت به وسیله تیغ تراشیده شد. سپس در دو طرف ستون فقرات، برشهای کوچکی (حدودا نیم سانتیمتر) در پوست و صفاق ایجاد شد و تخمدانها از اویداکت و چربی جدا و بلافاصله به عضله سرینی سطحی پیوند زده شد. 28 روز پس از پیوند ابتدا موشها با ترکیب ماده بیهوشی کتامین زایلازین بیهوش شدند. پوست ناحیه موردنظر برای خروج تخمدان از محل پیوند (عضله پشتی) برداشته شد، بعد از آن ماهیچه در ناحیه پیوند باز شده و تخمدان با دقت از ماهیچه جدا و به محلول فیکساتیو بوئن به مدت 24 ساعت انتقال داده شد و از قلب موشها خونگیری انجام گرفت، سپس نمونههای خون به مدت 10 دقیقه با 13 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و نمونههای سرم جهت اندازهگیری سطح هورمونهای استرادیول و پروژسترون و میزان مالون دیآلدئید مورد استفاده قرار گرفت. بعد از انجام مراحل پاساژ بافتی و قالبگیری، به کمک دستگاه میکروتوم از بلوکهای پارافینی تهیهشده به روش IUR، برشهای 5 و 20میکرونی به طور متناوب و به صورت سریال تهیه و با رنگآمیزی هماتوکسیلین ائوزین رنگآمیزی شد. سپس با استفاده از روشهای استریولوژی، پارامترهای کمی از جمله حجم کل تخمدان، حجم کورتکس، حجم مدولا و تعداد انواع مختلف فولیکولها اندازهگیری شد.
محاسبه حجم کل تخمدان، حجم کورتکس و حجم مدولا با استفاده از روش کاوالیری انجام گرفت. ابتدا با استفاده از میکروسکوپ نوری (BX41TF, Olympus, Japan) و نرم افزار Olysia، تصویر برشهای 5میکرونی با بزرگنمایی 40 برابر روی مانیتور انداخته شد. سپس پروب نقطهای به طور تصادفی و بدون هیچگونه سوگیری روی تصویر انداخته و نقاط برخورد کرده با کل تصویر تخمدان، کورتکس و مدولا (به طور جداگانه) شمارش شدند. حجم کل تخمدان با استفاده از فرمول شماره 1 و با وارد کردن مجموع نقاط شمارششده در هر برش (∑P)، ضخامت مقاطع (t) و سطح پروب نقطهای a(p)، به دست آمد.
1.
Vtotal ovary = ∑ni=1p × a(P) × t
برای محاسبه حجم کورتکس و مدولا، ابتدا دانسیته حجمی کورتکس و مدولا محاسبه شد. سپس حجم کورتکس و مدولا به طور غیر مستقیم به وسیله ضرب کردن دانسیته حجمی در حجم کل تخمدان طبق فرمول شماره 2 تخمین زده شد [18].
2.
Vvcortex/medulla =
Vvcortex/medulla = Vtotal ovary × Vvcortex/medulla
برای محاسبه تعداد فولیکولها از روش اپتیکال دایسکتور و از فریم مخصوص شمارش و دستگاه میکروکیتور (Heidenhain ND221B, Germany) استفاده شد. در این روش با استفاده از میکروسکوپ نوری متصل به کامپیوتر تصویر برشهای ۲۰ میکرونی با بزرگنمایی 1000 برابر روی مانیتور قرار داده شد و میدان دیدهای تصادفی انتخاب شدند، سپس از دو ناحیه به نام حفاظت شده به ضخامت ۵ میکرون از بالا و پایین برش برای شمارش صرف نظر شد (به دلیل وجود آرتیفکتهای احتمالی در سطح بافت) و تمام انواع فولیکولهایی که در فریم شمارش نصبشده روی صفحهی مانیتور کامپیوتر انتخاب شدند، شمارش شدند. در ادامه ابتدا بر اساس فرمول شماره 3، دانسیته عددی انواع فولیکولها محاسبه شد.
3.
Nv =
که در آن ΣQ مجموع تعداد فولیکولهای شمارششده، Σp مجموع نقاط وسط فریم که با میدانهای دید انتخابی برخورد کرده، h ارتفاعی که شمارش در آن انجام گرفت و a/f مساحت فریم در مقیاس واقعی بافت است.
سپس تعداد مطلق فولیکولها با ضرب دانسیته عددی در حجم کل تخمدان به دست آمد (فرمول شماره 4) [18].
4.
Ntotal = Vtotal ovary × Nv
سنجش میزان غلظت هورمونهای استرادیول و پروژسترون سرم خون با کیت ELISA (شرکت DRG آلمان) و طبق پروتکل شرکت انجام گرفت. درنهایت میزان جذب با دستگاه الیزا ریدر در طول موج 450 نانومتر اندازهگیری و بر حسب نانوگرم بر میلیلیتر گزارش شد.
هفت روز بعد از پیوند، نمونههای خون از قلب موشها جمعآوری و به مدت 10 دقیقه با 13 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و بعد از جداسازی سرم، نمونههای سرم در دمای منفی 80 درجه سانتیگراد تا زمان آنالیز بیوشیمیایی سرم (اندازهگیری میزان مالون دیآلدئید و ظرفیت آنتیاکسیدانی کل) نگهداری شدند. اندازهگیری مالون دیآلدهید طبق روش Buege و Aust انجام گرفت. ابتدا محلول واکنش شامل تریکلرواستیک اسید 15 درصد گرم بر میلیلیتر، تیوباربیوتیک اسید 375 درصد گرم بر میلیلیتر و اسید کلریدریک 25/0 نرمال تهیه شد. سپس 50 میکرولیتر از نمونه سرم با 100 میکرولیتر از محلول تهیهشده مخلوط شد و نمونهها به مدت 15 دقیقه در بنماری جوش قرار داده شد. سپس نمونهها بهسرعت توسط آب سرد، خنک و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی جدا شد و جذب آن در 532 نانومتر در برابر بلانک که حاوی تمام ترکیبات به جز نمونه بود، قرائت شد. درنهایت غلظت مالون دیآلدئید با استفاده از ضریب خاموشی آن که عبارت است از 1-MC1-M105×56/1، محاسبه شد و بر حسب نانومول بر میلیلیتر گزارش شد [19].
برای اندازهگیری ظرفیت آنتیاکسیدانی کل سرم از تست FRAP استفاده شد. روش انجام تست FRAP بدینگونه بود که به ازای هر 50 میکرولیتر از نمونه سرم، 5/1 میلیلیتر از معرف ساختهشده اضافه شد و به مدت 5 دقیقه در بنماری در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت و جذب آن در طول موج 593 نانومتر خوانده شد. سپس با استفاده از فرمول رگرسیون حاصل در منحنی استاندارد، میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی تام نمونهها بر حسب میکرومول بر میلیلیتر به دست آمد [20].
برای بررسی سیتولوژی واژن به عنوان شاخص از سرگیری فعالیتهای سیکلی تخمدان، از روز هفتم بعد از پیوند و به صورت روزانه تا ظهور اولین پروفایل سیکل استروس، اسمیر واژنی از گروههای مختلف 28 روزه تهیه شد. با یک سوآپ مرطوبشده با آبمقطر دیواره واژن بهآرامی خراشیده شد و با چرخاندن سوآپ داخل مجرای واژن موش، سلولهای مجرای واژن کنده شده و به اسلاید شیشهای منتقل شد. اسمیر واژنی هر موش بلافاصله بعد از تهیه، با ائوزین رنگآمیزی و زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 40 برابر مشاهده و بررسی شد. مرحله سیکل استروس از نوع سلولها ( سلولهای اپیتلیال شاخی) تعیین شد.
دادههای حاصل توسط نرمافزار SPSS و روش آنالیز واریانس یکطرفه و تست آماری توکی مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و تفاوت میانگینها در سطح 05/P<0 معنیدار درنظر گرفته شد.
یافتهها
با بررسی میکروسکوپی مقاطع بافتی و مقایسه آنها در گروههای مختلف مشاهده شد که تخمدانهای گروه کنترل دارای تعداد زیادی از انواع فولیکولها بودند. در حالیکه فولیکولهای مختلف در گروه اتوگرفت کاهش قابل توجهی پیدا کردند. در گروه اتوگرفت + کوئرستین فولیکولها نسبت به گروه اتوگرفت تراکم بیشتری را نشان دادند (تصویر شماره 1).
میانگین حجم کل تخمدان، حجم کورتکس و حجم مدولا در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل به طور معنیداری کاهش یافت (001/P<0). از طرفی افزایش معنیداری در میانگین حجم کل تخمدان (001/P<0)، حجم کورتکس (01/P<0) و حجم مدولا (01/P<0) در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت مشاهده شد و میانگین حجم مدولا به سطح گروه کنترل رسید (05/P>0) (جدول شماره 1).
مقایسه میانگین تعداد فولیکولهای بدوی، اولیه، پرهآنترال و آنترال و تعداد کل فولیکولها در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل، کاهش معنیداری را نشان داد (001/P<0). در حالی که افزایش معنیداری در میانگین تعداد فولیکولهای بدوی (01/P<0)، اولیه (001/P<0)، پرهآنترال (001/P<0) و آنترال (001/P<0) و تعداد کل فولیکولها (001/P<0) در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت مشاهده شد (001/P<0) و در میانگین، تعداد فولیکولهای اولیه و تعداد کل فولیکولها به سطح گروه کنترل رسید (05/P>0) (جدول شماره 2).
کاهش معنیداری در میانگین سطح هورمونهای استرادیول (05/P<0) و پروژسترون (001/P<0) در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. در حالی که میزان هورمونهای استرادیول (01/P<0) و پروژسترون (001/P<0) در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت دارای افزایش معنیدار بود (001/P<0) و در حد گروه کنترل جبران شد (05/P>0) (جدول شماره 3).
شروع سیکل استروس در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل به طور معنیداری دیرتر رخ داد (001/P<0). در گروه اتوگرفت + کوئرستین، شروع سیکل استروس به طور معنیداری زودتر از گروه اتوگرفت مشاهده شد (001/P<0). به طوری که در مقایسه با گروه کنترل اختلاف معنیداری را نشان نداد (05/P>0) (جدول شماره 3).
افزایش معنیداری در میانگین سطح مالون دیآلدئید هفتروزه (001/P<0) و 28روزه (01/P<0) در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. این پارامتر در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت به طور معنیداری کاهش یافت (001/P<0) و نسبت به گروه کنترل تفاوت معنیداری را نشان نداد (05/P>0) (جدول شماره 4). مقایسه میانگین ظرفیت آنتیاکسیدانی کل در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری را نشان داد (01/P<0). از طرفی افزایش معنیداری در میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی کل در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت مشاهده شد (01/P<0) و این افزایش در سطح گروه کنترل بود (05/P>0) (جدول شماره 4).
بحث
با توجه به نتایج مطالعه حاضر، میانگین حجم کل تخمدان، حجم کورتکس و حجم مدولا و همچنین تعداد انواع مختلف فولیکولها در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل، به طور معنیداری کاهش یافت. این نتایج مطابق با تعدادی از مطالعات پیشین است که طبق گزارشات آنها، این پارامترها در گروه اتوگرفت به طور معناداری کاهش یافته است [21، 22]. همچنین در مطالعه حاضر با مقایسه حجم کل تخمدان، حجم کورتکس، حجم مدولا و تعداد انواع مختلف فولیکولها در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه اتوگرفت، افزایش معنیداری مشاهده شد. مطالعات نشان دادهاند که تولید رادیکالهای آزاد و وقوع التهاب و آپوپتوز در بافتی که دچار شرایط ایسکمی شده است [22]، موجب آترزی فولیکولی و کاهش تشکیل جسم زرد در تخمدانهای اتوگرفت میشود [21] و این میتواند دلیلی برای کاهش حجم تخمدان و کورتکس در گروه اتوگرفت باشد. از طرفی مرکز بافت پیوندی، بیشتر از نواحی کناری بافت در معرض خطر هیپوکسی و به دنبال آن ایسکمی قرار دارد که خود میتواند منجر به کاهش حجم مدولا شود [23]. آسیب ایسکمی ریپرفیوژن سبب تولید واسطههای استرس اکسیداتیو مثل رادیکالهای آزاد اکسیژن از سلولهای ملتهب در اطراف ناحیه دچار ایسکمی ریپرفیوژن میشود [24] و این رها شدن رادیکالهای آزاد باعث بیان ژنهای پیشبرنده التهاب میشود. درنتیجه میزان سایتوکینها افزایش یافته و بیان مولکولهای اتصالی مثل مولکول اتصال داخل سلولی P-selectin ،ICAM-1 و E-selectin در سطح سلولهای اندوتلیال القا شده که سبب اتصال لکوسیتها به سلولهای اندوتلیالی در بافت آسیبدیده میشود؛ به طوری که لکوسیتها به دیواره رگها چسبیده و به بافت آسیبدیده مهاجرت و شروع به ترشح واسطههای پیشبرنده التهابی و آسیب ثانویه بافتی میکنند [25]. مشخص شده است که اثر آنتیاکسیدانی کوئرستین در شرایطی که سطح التهاب و استرس اکسیداتیو بالاتر باشد بیشتر است [26]. اثر آنتیاکسیدانی کوئرستین توسط چندین مکانیسم از جمله مهار رادیکال آزاد، حفاظت سلول، شلاته کردن یونهای فلزی و نمایش اثرات ضدالتهابی به واسطه پایبندی کاهش لکوسیت رخ میدهد [15]. همچنین کوئرستین توانایی کاهش سایتوکینهای التهابی مانند IL-18 و افزایش انواع سایتوکاینهای ضدالتهابی مانند IL-10 را داراست [27].
در این مطالعه، میانگین غلظت هورمونهای استرادیول و پروژسترون سرم خون در گروه اتوگرفت به طور معنیداری از گروه کنترل پایینتر بود و شروع سیکل استروس نیز در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل به طور معنیداری دیرتر رخ داد. این نتایج با گزارش گروهی از محققین مطابقت دارد [21، 22]. همچنین نتایج مطالعه ما، افزایش معنیداری در میانگین میزان این پارامترها در گروه اتوگرفت + کوئرستین نسبت به گروه کنترل نشان داد. با توجه به مطالعات صورتگرفته پیشین، اندوکرینولوژی در حیوانات با تخمدان پیوندشده میتواند در بررسی نتایج مربوط به بهبود تکوین اووسیت و فولیکول و همچنین در بازگشت عملکرد طبیعی تخمدان کمک کند [28]. از آنجایی که فولیکولهای آنترال مسئول ترشح بخش مهمی از استرادیول و جسم زرد نیز مسئول ترشح هورمون پروژسترون هستند [29]، کاهش تعداد فولیکولهای آنترال و جسم زرد پس از پیوند میتواند عاملی برای کاهش استرادیول و پروژسترون در گروه اتوگرفت باشد. اثرات مفید کوئرستین در روند فولیکولوژنز و لوتئینیزاسیون از طریق کاهش قابل توجه فولیکولهای آترتیک و کیستیک، افزایش فولیکولهای نرمال در مراحل مختلف رشد و عروقزایی در لایه تکا گزارش شده است [30].
با توجه به نتایج تحقیق حاضر، افزایش معنیداری در میانگین میزان مالون دیآلدئید سرم خون (هفت و 28روزه) در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل مشاهده شد و مقایسه میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی کل در گروه اتوگرفت نسبت به گروه کنترل، کاهش معنیداری را نشان داد. این نتایج در راستای یافتههای تحقیق گروهی از محققین در سالهای پیشین است [21، 22] و این میتواند به دلیل وقوع استرس اکسیداتیو در طول ایسکمی ریپرفیوژن [31] در تخمدان اتوگرفت باشد. درواقع آسیب رادیکالهای آزاد، مکانیسمی است که در فازهای اولیه ایسکمی شروع میشود و یکی از وقایع اصلی در این زمان، وقوع پراکسیداسیون لیپیدی است [32]. واکنش رادیکالهای آزاد با لیپیدها، تحت واکنش پراکسیداسیون لیپیدی موجب تشکیل پراکسیدهای لیپیدی میشود. رادیکالهای آزاد با لیپیدها واکنشهای زنجیرهای مخربی را شروع میکنند. اکسیداسیون لیپید باعث تولید رادیکال بسیار فعال آلکیل میشود که بهسرعت با اکسیژن واکنش داده و رادیکال پراکسید تولید میکند. رادیکالهای پراکسید نیز میتوانند باعث اکسید شدن لیپیدها شوند و لیپید هیدرو پراکسیدهایی تولید کنند که به ترکیبات متعددی نظیر الکلها، آلدئیدها، فورما آلکیلها، کتونها و هیدروکربنها و رادیکالهایی نظیر آلکوکسیل تجزیه میشوند. یکی از ترکیبات حاصل از پراکسیداسیون لیپیدی، مالون دیآلدئید است [33].
مالون دیآلدئید و آلدئیدهای مشابه حاصل از پراکسیداسیون لیپید میتوانند با پروتئینها و DNA مکانهای فعال نوکلئوفیل در فسفولیپیدها واکنش داده و ضایعات متنوعی ایجاد کنند [34]. از طرفی در مطالعه حاضر در گروه اتوگرفت + کوئرستین، کاهش معنیداری در میانگین سطح مالون دیآلدئید و افزایش معنیداری در میزان ظرفیت آنتیاکسیدانی کل نسبت به گروه اتوگرفت مشاهده شد. در همین راستا برخی مطالعات نیز گزارش کرده اند که کوئرستین باعث حفظ سطح سرمی آنتیاکسیدان گلوتاتیون و کاهش سطح سرمی مالون دیآلدئید میشود [13، 14]. این یافتهها نشان میدهد که کوئرستین به عنوان یک آنتیاکسیدان توانسته موجب کاهش استرس اکسیداتیو و افزایش ظرفیت آنتیاکسیدانی کل شود.
نتیجهگیری
نتایج این پژوهش نشان داد که کوئرستین میتواند از طریق ممانعت از استرس اکسیداتیو به طور موثری آسیب ایسکمی ریپرفیوژن را مهار کرده و موجب بهبود کیفیت بافت تخمدان اتوگرفت موش، بقا و تکوین فولیکولی و نیز بازگشت سریعتر عملکرد تخمدان شود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
در این مطالعه اصول اخلاق کار با حیوانات رعایت شده است.
حامی مالی
این مقاله برگرفته از پایاننامه کارشناسی ارشد نویسنده دوم در گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه اراک است، و معاون پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک از آن حمایتمالی کرده است.
مشارکت نویسندگان
تحقیق و بررسی: ملک سلیمانی مهرنجانی و نعیمه دلبری؛ منابع: سپیده احمدی و نعیمه دلبری؛ نگارش پیشنویس: سپیده احمدی؛ ویراستاری و نهاییسازی نوشته: ملک سلیمانی مهرنجانی؛ نظارت: ملک سلیمانی مهرنجانی؛ مدیریت پروژه: ملک سلیمانی مهرنجانی.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از همکاریهای آقای فراهانی، کارشناس آزمایشگاه تحقیقاتی گروه زیستشناسی دانشگاه اراک، تشکر میکنیم.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
بافت شناسی و جنین شناسی
دریافت: 1399/9/28 | پذیرش: 1399/12/28 | انتشار: 1400/1/10
دریافت: 1399/9/28 | پذیرش: 1399/12/28 | انتشار: 1400/1/10
فهرست منابع
1. Dath C, Van Eyck AS, Dolmans MM, Romeu L, Delle Vigne L, Donnez J, et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: Comparison between four grafting sites. Hum Reprod. 2010; 25(7):1734-43. Link [DOI:10.1093/humrep/deq131] [PMID] [DOI:10.1093/humrep/deq131]
2. Kawamura K, Cheng Y, Sun YP, Zhai J, Diaz-Garcia C, Simon C, et al. Ovary transplantation: To activate or not to activate. Hum Reprod. 2015; 30(11):2457-60. [DOI:10.1093/humrep/dev211] [PMID] [DOI:10.1093/humrep/dev211]
3. Diaz-Garcia C, Domingo J, Garcia-Velasco JA, Herraiz S, Mirabet V, Iniesta I, et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertil Steril. 2018; 109(3):478-85. [DOI:10.1016/j.fertnstert.2017.11.018] [PMID] [DOI:10.1016/j.fertnstert.2017.11.018]
4. Shiroma ME, Botelho NM, Damous LL, Baracat EC, Soares JM Jr. Melatonin influence in ovary transplantation: Systematic review. J Ovarian Res. 2016; 9(1):33. [DOI:10.1186/s13048-016-0245-8] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/s13048-016-0245-8]
5. Juranek I, Bezek S. Controversy of free radical hypothesis: Reactive oxygen species-cause or consequence of tissue injury? Gen Physiol Biophys 2005; 24(3):263-78. [PMID]
6. Slegtenhorst BR, Dor FJ, Rodriguez H, Voskuil FJ, Tullius SG. Ischemia/reperfusion injury and its consequences on immunity and inflammation. Curr Transplant Rep. 2014; 1(3):147-54. [DOI:10.1007/s40472-014-0017-6] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1007/s40472-014-0017-6]
7. Mahajan N. Fertility preservation in female cancer patients: An overview. J Hum Reprod Sci. 2015; 8(1):3-13. [DOI:10.4103/0974-1208.153119] [PMID] [PMCID] [DOI:10.4103/0974-1208.153119]
8. Aubard Y, Piver P, Cognie Y, Fermeaux V, Poulin N, Driancourt MA. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 1999; 14(8):2149-54. [DOI:10.1093/humrep/14.8.2149] [PMID] [DOI:10.1093/humrep/14.8.2149]
9. Ozkan OV, Yuzbasioglu MF, Ciralik H, Kurutas EB, Yonden Z, Aydin M, et al. Resveratrol, a natural antioxidant, attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury in rats. Tohoku J Exp Med. 2009; 218(3):251-8. [DOI:10.1620/tjem.218.251] [PMID] [DOI:10.1620/tjem.218.251]
10. Nugent D, Newton H, Gallivan L, Gosden RG. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 1998; 114(2):341-6. [DOI:10.1530/jrf.0.1140341] [PMID] [DOI:10.1530/jrf.0.1140341]
11. Atala E, Fuentes J, Wehrhahn MJ, Speisky H. Quercetin and related flavonoids conserve their antioxidant properties despite undergoing chemical or enzymatic oxidation. Food Chem. 2017; 234:479-85. [DOI:10.1016/j.foodchem.2017.05.023] [PMID] [DOI:10.1016/j.foodchem.2017.05.023]
12. Zizkova P, Stefek M, Rackova L, Prnova M, Horakova L. Novel quercetin derivatives: From redox properties to promising treatment of oxidative stress related diseases. Chem Biol Interact. 2017; 265:36-46. [DOI:10.1016/j.cbi.2017.01.019] [PMID] [DOI:10.1016/j.cbi.2017.01.019]
13. Anand David AV, Arulmoli R, Parasuraman S. Overviews of biological importance of quercetin: A bioactive flavonoid. Pharmacogn Rev. 2016; 10(20):84-9. [DOI:10.4103/0973-7847.194044] [PMID] [PMCID] [DOI:10.4103/0973-7847.194044]
14. Xu D, Hu MJ, Wang YQ, Cui YL. Antioxidant activities of quercetin and its complexes for medicinal application. Molecules. 2019; 24(6):1123. [DOI:10.3390/molecules24061123] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/molecules24061123]
15. Gencer M, Karaca T, Güngör AN, Hacıvelioğlu SÖ, Demirtaş S, Turkon H, et al. The protective effect of quercetin on IMA levels and apoptosis in experimental ovarian ischemia-reperfusion injury. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2014; 177:135-40. [DOI:10.1016/j.ejogrb.2014.03.036] [PMID] [DOI:10.1016/j.ejogrb.2014.03.036]
16. Wang J, Qian X, Gao Q, Lv C, Xu J, Jin H, et al. Quercetin increases the antioxidant capacity of the ovary in menopausal rats and in ovarian granulosa cell culture in vitro. J Ovarian Res. 2018; 11(1):51. [DOI:10.1186/s13048-018-0421-0] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/s13048-018-0421-0]
17. Zohrabi D, Parivar K, Sanati MH, Hayati Roodbari N. [The effect of Quercetin on ovarian tissue of Female Wistar Rats treated with cyclophosphamide and growth indexes of their offspring (Persian)]. J Cell Tissue. 2017; 8(3):285-93. http://jct.araku.ac.ir/article_30363.html?lang=en
18. Shojafar E, Soleimani Mehranjani M, Shariatzadeh SMA. Adipose derived mesenchymal stem cells improve the structure and function of autografted mice ovaries through reducing oxidative stress and inflammation: A stereological and biochemical analysis. Tissue Cell. 2019; 56:23-30. [DOI:10.1016/j.tice.2018.11.005] [PMID] [DOI:10.1016/j.tice.2018.11.005]
19. Buege JA, Aust SD. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol. 1978; 52:302-10. [DOI:10.1016/S0076-6879(78)52032-6] [DOI:10.1016/S0076-6879(78)52032-6]
20. Benzie IF, Strain JJ. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: The FRAP assay. Anal Biochem. 1996; 239(1):70-6. [DOI:10.1006/abio.1996.0292] [PMID] [DOI:10.1006/abio.1996.0292]
21. Mahmoodi M, Soleimani Mehranjani M, Shariatzadeh SM, Eimani H, Shahverdi A. N-acetylcysteine improves function and follicular survival in mice ovarian grafts through inhibition of oxidative stress. Reprod Biomed Online. 2015; 30(1):101-10. [DOI:10.1016/j.rbmo.2014.09.013] [PMID] [DOI:10.1016/j.rbmo.2014.09.013]
22. Shojafar E, Soleimani Mehranjani M, Shariatzadeh SMA. Adipose-derived mesenchymal stromal cell transplantation at the graft site improves the structure and function of autografted mice ovaries: A stereological and biochemical analysis. Cytotherapy. 2018; 20(11):1324-36. [DOI:10.1016/j.jcyt.2018.09.006] [PMID] [DOI:10.1016/j.jcyt.2018.09.006]
23. Amable PR, Teixeira MV, Carias RB, Granjeiro JM, Borojevic R. Mesenchymal stromal cell proliferation, gene expression and protein production in human platelet-rich plasma-supplemented media. PloS One. 2014; 9(8):e104662. [DOI:10.1371/journal.pone.0104662] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1371/journal.pone.0104662]
24. Wong CH, Crack PJ. Modulation of neuro-inflammation and vascular response by oxidative stress following cerebral ischemia-reperfusion injury. Curr Med Chem. 2008; 15(1):1-4. [DOI:10.2174/092986708783330665] [PMID] [DOI:10.2174/092986708783330665]
25. Yilmaz G, Granger DN. Cell adhesion molecules and ischemic stroke. Neurol Res. 2008; 30(8):783-93. [DOI:10.1179/174313208X341085] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1179/174313208X341085]
26. Gnoni GV, Paglialonga G, Siculella L. Quercetin inhibits fatty acid and triacylglycerol synthesis in rat‐liver cells. Eur J Clin Invest. 2009; 39(9):761-8. [DOI:10.1111/j.1365-2362.2009.02167.x] [PMID] [DOI:10.1111/j.1365-2362.2009.02167.x]
27. Zhou DS, Liang ZQ, Qin Q, Zhang MH, Li SL. [Therapeutic efficacy and mechanisms of quercetin in a rat model of nonalcoholic fatty liver disease (Chinese)]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2013; 21(2):134-7. [PMID] [DOI:10.1111/j.1365-2362.2009.02167.x] [DOI:10.1111/j.1365-2362.2009.02167.x]
28. Li F, Tao Y, Zhang Y, Li Y, Fang F, Liu Y, et al. Follicle growth and oocyte development after ovary transplantation into back muscle of immune-intact adult castrated male mice. Reproduction. 2010; 140(3):465-76. [DOI:10.1530/REP-10-0076] [PMID] [DOI:10.1530/REP-10-0076]
29. Greenfeld CR, Babus JK, Furth PA, Marion S, Hoyer PB, Flaws JA. BAX is involved in regulating follicular growth, but is dispensable for follicle atresia in adult mouse ovaries. Reproduction. 2007; 133(1):107-16. [DOI:10.1530/REP-06-0144] [PMID] [DOI:10.1530/REP-06-0144]
30. Pourteymour Fard Tabrizi F, Hajizadeh-Sharafabad F, Vaezi M, Jafari-Vayghan H, Alizadeh M, Maleki V. Quercetin and polycystic ovary syndrome, current evidence and future directions: A systematic review. J Ovarian Res. 2020; 13(1):11. [DOI:10.1186/s13048-020-0616-z] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/s13048-020-0616-z]
31. Slegtenhorst BR, Dor FJ, Rodriguez H, Voskuil FJ, Tullius SG. Ischemia/reperfusion injury and its consequences on immunity and inflammation. Curr Transplant Rep. 2014; 1(3):147-54. [DOI:10.1007/s40472-014-0017-6] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1007/s40472-014-0017-6]
32. Rumley AG, Paterson JR. Analytical aspects of antioxidants and free radical activity in clinical biochemistry. Ann Clin Biochem. 1998; 35(Pt 2):181-200. [DOI:10.1177/000456329803500202] [PMID] [DOI:10.1177/000456329803500202]
33. Esterbauer H, Schaur RJ, Zollner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic Biol Med. 1991; 11(1):81-128. [DOI:10.1016/0891-5849(91)90192-6] [DOI:10.1016/0891-5849(91)90192-6]
34. Bryszewska M, Zavodnik IB, Niekurzak A, Szosland K. Oxidative processes in red blood cells from normal and diabetic individuals. Biochem Mol Biol Int. 1995; 37(2):345-54. [PMID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
