مجله دانشگاه علوم پزشکی قم

مقدمه
بیماری سلیاک یا اسپروی سلیاک یک انتروپاتی خودایمنی مزمن روده باریک با زمینه ژنتیکی است که مربوط به عدم تحمل گلوتن است [1]. طبق مطالعات قبلی‌، این بیماری در بزرگسالان و کودکان با نرخ نزدیک به 1درصد بروز می‌کند و شیوع نسبتاً یکنواخت در بسیاری از کشورها جهان دارد [2]. اولین توصیف دقیق از بیماری توسط ساموئل جی در سال 1888 انجام شد. او پیشنهاد کرد که رژیم‌ درمانی ممکن است برای بهبود علائم بیماری مفید باشد [3].
گلوتن ترکیبی از دو گلیکوپروتئین پرولامین (در گندم به نام گلیادین) و گلوتلین (در گندم به نام گلوتنین) است. گلوتن در آندوسپرم دانه‌های غلات از جمله گندم، تریتیکاله، چاودار، جو دوسر و جو یافت می‌شود. مولکول‌های غیرقابل تجزیه گلیادین از جمله α_گلیادین که نسبت به هضم توسط آنزیم‌های گوارشی مقاوم هستند، در مجرای گوارشی باقی می‌مانند و ایجاد سمیت می‌کنند. در صورتی که فرد مبتلا، پروتئینی از دسته گلوتن را مصرف کنند، دچار یک واکنش ایمنی می‌شود که منجر به آسیب پرزهای روده باریک و اختلال در جذب مواد غذایی می‌شود [4، 5]. علائم بالینی در نوزادان و کودکان کم‌سن‌و‌سال به صورت رشد ناکافی و اتساع شکمی است. کودکان با سن بیشتر و نوجوانان علائم خارج روده‌ای و علائم نورولوژیک و آنمی را بروز می‌دهند [6].
درمان اصلی بیماری سلیاک رژیم غذایی فاقد گلوتن است [7] و بهبودی و رفع علائم بیماری طی چند روز تا چند هفته رخ می‌دهد. با وجود اثربخشی این رژیم غذایی، به دلیل هزینه‌بر بودن، آلودگی‌های احتمالی به گلوتن و عدم امکان دسترسی مداوم به مواد غذایی بدون گلوتن، بیماران به یک درمان غیررژیمی علاقه بیشتری نشان می‌دهند [8]. پیشرفت‌های جدید در پاتوفیزیولوژی سلیاک سبب ارائه درمان‌هایی نوینی از قبیل گلوتن‌های تغییریافته ژنتیکی، مهارکننده zonulin، واکسن‌درمانی (Nexvax2) و مهارکننده ترنس‌گلوتامیناز بافتی شده است [9].
یکی از جدیدترین این درمان‌ها، استفاده از پروبیوتیک‌هاست. منبع باکتری‌های پروبیوتیک، لبنیات و میوه‌ها هستند [10]. مهم‌ترین میکروارگانیسم‌هایی که در منابع گوناگون تحت عنوان پروبیوتیک از آن‌ها یاد می‌شود را می‌توان در 4 دسته جنس لاکتوباسیل، جنس غیرلاکتوباسیل، جنس بیفیدوباکتریوم و سایر پروبیوتیک‌ها خلاصه کرد. مهم‌ترین و مرسوم‌ترین پروبیوتیک‌ها به جنس‌های لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم تعلق دارند [11]. مطابق مطالعات انجام‌شده پروبیوتیک‌ها با پیشگیری از اسهال، متعادل کردن میکروفلور روده، تعدیل ایمنی، کاهش کلسترول، بهبود تحمل لاکتوز و پیشگیری از سرطان، کاهش فشار خون،کاهش التهاب و کاهش نشانه‌های آلرژیک نقش درمانی مؤثری را ایفا می‌کنند [12]. همچنین پروبیوتیک‌ها می‌توانند سبب بهبود بیماری‌های خود‌ایمنی همچون میاستنی گراویس و اسکیزوفرنی شوند [14 ،13].
بررسی‌ها در خصوص پروبیوتیک‌ها نشان می‌دهد که این‌ها قادر به تولید آنزیم‌های تجزیه‌کننده گلیادین هستند که منجر به بهبود علائم بیماری می‌شود [15]. در بررسی‌ها نشان داده ‌شده که تعدادی از باکتری‌ها متعلق به گونه لاکتوباسیل و بیفیدوباکتریوم که دارای آنزیم‌های تجزیه‌کننده گلوتن هستند، سبب حفاظت سلول‌های اپی‌تلیال در برابر اثرات سمی گلیادین می‌شوند [9]. نمونه تجاری VSL#3 که ترکیبی از 8 گونه پروبیوتیک (Bifidobacterium breve, B. longum, B. infantis, Lactobacillus plantarum, L. acidophilus, L. casei, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, and Streptococcus thermophiles) است در تجزیه پلی‌پپتیدهای گلیادین کارآمد عمل می‌کند. فعالیت آنزیم‌های تجزیه‌کننده پپتیدهای غنی از پرولین و آمینوپپتیدازهایی که تنظیم‌کننده تجزیه اپیتوپ‌های گلیادین است به ‌طور وسیعی در VSL#3 موجود است [16].
با توجه به شیوع رو به افزایش بیماری سلیاک در جهان [17] و ایران [18] و نیز با توجه به عوارض جسمی، روانی، اجتماعی و اقتصادی حاصل از ابتلا به بیماری سلیاک [19] و همچنین محدودیت‌های مطالعات انجام‌شده در ایران در رابطه با اثر پروبیوتیک بر تجزیه پلی‌پپتید گلوتن، طراحی مطالعه‌ای مبتنی بر بررسی اثرات پروبیوتیک‌های بومی ایران در تجزیه گلوتن (گیلیادین) ضروری به نظر می‌رسد.
روش بررسی
جمع آوری نمونه
نمونه‌های مورد‌نظر از لبنیات محلی (شیر، ماست، پنیر، کشک، کره و سر شیر) و گیاهان دارویی ایران (نعنا و پونه و ریحون) در شرایط استریل جمع‌آوری شدند [20]. نمونه‌ها از شهرهایی همچون اصفهان، اراک، یزد،‌ زنجان، تالش، گلپایگان،‌ فیروزکوه، شیراز، تبریز، طالقان و پلور در بین سال 1396 تا 1397 جمع‌آوری شدند. سپس نمونه‌ها در دمای 4 درجه نگهداری شدند.
آماده‌سازی نمونه‌ها
یک گرم از نمونه‌های گیاهی ابتدا با تیغ استریل خرد شدند و نمونه‌های لبنی تنها با ورتکس به مدت یک دقیقه در 10 میلی‌لیتر محیط MRS broth هموژن شدند. سپس نمونه‌ها به مدت 48 ساعت در دمای ۳7 درجه در شرایط بی‌هوازی انکوبه شدند. بعد از انکوباسیون، برای به دست آوردن تک‌کلنی از هر‌یک از محیط‌های ذکرشده، ۳/0میلی‌لیتر سوسپانسیون به پلیت‌های MRS agar منتقل و به ‌صورت چمنی کشت داده شدند. سپس نمونه‌ها به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در شرایط بی‌هوازی انکوبه شدند.
رنگ‌آمیزی و تست بیوشیمیایی
بعد از انکوباسیون، از هریک از کلنی‌های به‌دست‌آمده رنگ‌آمیزی گرم و تست کاتالاز به عمل آمد. پس از اطمینان از وجود باکتری‌های میله‌ای، کوکو باسیل تا کوکسی، گرم مثبت و کاتالاز منفی، از هرکدام کشت خالص تهیه ‌شد و برای انجام آزمایش‌های بعدی در محیط MRS broth حاوی20 درصد گلیسرول، در دمای منفی 20 درجه نگهداری شد.
جداسازی پروبیوتیک و تهیه بیومس
به 10 میلی‌لیتر از محیط کشت MRS Broth‌، 1 درصد از سوسپانسیون سویه‌های جداسازی‌شده از لبنیات تلقیح شد و برای 24 ساعت در شرایط بی‌هوازی و در دمای ۳۵ درجه انکوبه شد. بعد از انکوباسیون، بیومس باکتری به وسیله سانتریفیوژ به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه و دور g 5000 جدا سازی شد. سپس آنزیم‌ها از بیومس جداسازی شدند.

استخراج آنزیم
بعد از انکوباسیون، بیومس باکتری به وسیله سانتریفیوژ (g5000) جدا شد. سپس آنزیم‌ها از بیومس جداسازی شدند. برای این منظور بیومس باکتری دو بار با سرم فیزیولوژیک استریل شست‌وشو شدند و هر بار به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه و دور g 5000 جدا شدند. سپس سلول‌ها با اضافه کردن μl 500 بافر لیز‌کننده و μl 5 تریتون به صورت سوسپانسیون درآمدند. بافر لیز‌کننده ترکیبی از Tris 50mM ،EDTA 5 mM ،NaCl 50mM بود. بعد از اضافه کردن بافر لیز‌کننده سلول‌ها در معرض سونیفیکاسیون (2 دقیقه در دمای 15 درجه، 15 ثانیه پالس روشن و 15 ثانیه پالس خاموش سونیکاتور) قرار گرفتند. در مرحله بعد برای حذف سلول‌های آسیب‌دیده، سانتریفیوژ به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه و دور g 5000 انجام گرفت. سوپرناتانت حاوی آنزیم‌ها برای آنالیزهای بعدی مورد استفاده قرار گرفت.
غربالگری گونه‌های تولید‌کننده آنزیم‌های پروتئولیتیک
 سوبسترای کروموژنیک Z-Gly-Pro-4-nitroanilide (Sigma, St . Louis USA) برای غربالگری گونه‌ها از نظر تولید آنزیم‌های آمینوپپتیداز نوع N (PepN) و Leu-p-nitro-anilin (pNA) (Santa Cruz Biotechnology, Inc) برای غربالگری گونه‌ها از نظر تولید پرولیل‌اندوپپتیداز (PEP) مورد استفاده قرار گرفت. سوبستراهای فوق دارای p-nitro-anilin (pNA) هستند که در صورت وجود آنزیم پروتئولیتیک در نمونه برش خورده و آزاد می‌شوند. رهایی آن‌ها را می‌توان با اندازه‌گیری جذب با دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج nm 410 بررسی کرد. فعالیت پروتئولیتیک بدین صورت مورد ارزیابی قرار گرفت که μl 100 از محلول حاوی آنزیم که در بالا آماده‌سازی آن توضیح داده شد در ml2 بافر پتاسیم فسفات حل شد و μl 50 سوبسترای کروموژنیک که در متانول حل شده بود، به آن اضافه شد. ترکیب واکنش برای 1 ساعت در دمای 37 درجه تحت لرزش مداوم انکوبه شد. آزادسازی ملکول pNA با دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج nm 410 اندازه‌گیری شد. 5 نمونه از گونه‌هایی که بیشترین جذب را داشتند تعیین سویه شدند که می‌توانند به‌ عنوان گونه‌های دارای توانایی بالقوه جهت بهبود بیماران سلیاکی در نظر گرفته شوند.

شناسایی ملکولی سویه‌های انتخاب‌شده
استخراج DNA با استفاده از ‌itK DNG PLUS (سینا کلون) طبق دستورالعمل تولیدکننده انجام گرفت. شناسایی مولکولی توسط تعیین توالی ژن S rRNA16 انجام شد. هر 25 میکرولیتر از ترکیب PCR حاوی 5/12 میکرولیتر Amplicon Master Mix‌، 1 میکرولیتر از هرکدام پرایمرهای Forward و Reverse‌، 1میکرولیتر از DNA الگو (100 نانوگرم) و 5/9 میکرولیتر آب ‌دیونیزه بود. PCR به ترتیب در 32 سیکل انجام شد. دناتوراسیون اولیه (95 درجه برای 3 دقیقه) ، دناتوراسیون (95 درجه برای30 ثانیه) ، اتصال (56 درجه برای30 ثانیه) ، تکثیر (72 درجه برای 1 دقیقه و 30 ثانیه) و تکثیر نهایی (72 درجه برای 10 دقیقه). توالی پرایمر ژن S rRNA16 مورد استفاده برای انجام واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز و شناسایی مولکولی باکتری‌ها در جدول شماره 1 آمده است.
آنالیز نتایج PCR
قطعات تکثیرشده از S rRNA16 (تقریباً 1500 جفت باز) در ژل آگارز 1 درصد و بافر TBE در 100 ولت برای 30 دقیقه بررسی شد. رنگ‌آمیزی با استفاده از رنگ فلورسنت safe stain انجام شد و درنهایت برای مشاهده نتیجه، ژل زیر تابش نور UV در دستگاه ژل داک قرار گرفت (Gel DocTM XR, Bio- Rad, Laboratories, Hercules, CA). سایز قطعات DNA با استفاده از لدر 1000 جفت باز (Sinaclon) مورد آنالیز قرار گرفتند.
توالی‌یابی و هم‌ترازی توالی
محصول PCR جهت توالی‌یابی به همراه پرایمرها به شرکت تکاپوزیست ارسال شد. توالی به‌دست‌آمده به کمک خوانش از هر دو طرف توالی‌یابی شد. در انتها نیز توالی موردنظر در پایگاه‌های داده ثبت شد و با دیگر توالی‌های موجود در این سایت‌ها هم‌ترازی شدند.
آنالیز آماری
داده‌های این پژوهش، به ‌طور متوسط در 3 آزمایش مستقل از هم انجام گرفت. میزان خطای هر آزمایش با استفاده از انحراف معیار محاسبه شد. تحلیل آماری داده‌ها، ابتدا به روش غیرپارامتری انجام گرفت و سپس با استفاده از آزمون من‌ویتنی محاسبه شد. تفاوت معنی‌دار در محاسبات،P کمتر از 50/0 در نظر گرفته شد. آنالیز آماری این مطالعه عمدتاً با استفاده از نرم‌افزارهای آماری SPSS نسخه 22 انجام گرفت.
یافته‌ها
غربالگری گونه‌های تولید‌کننده آنزیم‌های پروتئولیتیک
از میان نمونه‌های گیاهی و لبنی جداسازی‌شده 50 نمونه باسیل گرم مثبت و کاتالاز منفی جداسازی شد. جدول شماره 2 مشخصات سویه‌ها، منبع جداسازی آن‌ها و میزان جذب در 410 نانومتر را نشان می‌دهد. تمام داده‌های ارائه‌شده میانگین±انحراف معیار هستند.
نتایج غربالگری (جدول شماره 2) برای سوبسترای Z-Gly-Pro-4nitroanilid(S1) که ارزیابی آنزیم پرولیل‌اندوپپتیداز را انجام می‌دهد به ترتیب بیشترین میزان جذب سویه‌های C‏1-10 ،B6-1 ،C5-2 ،Y5 و C11-1 به خود اختصاص می‌دهند. مقایسه میزان جذب 50 سویه پروبیوتیک بومی با VSL#3 که به ‌عنوان سویه کنترل مثبت مورد ارزیابی قرار گرفت، نشان می‌دهد که فعالیت آنزیم پرولیل‌اندوپپتیداز به ‌طور عمومی در همه‌ سویه‌ها مشاهده می‌شود. همه‌ سویه‌ها نسبت به کنترل منفی که حاوی بافر و سوبسترا بود جذب را با اختلاف معناداری را نشان دادند (P<0/05). در 10 سویه، میزان جذب از کنترل مثبت، مقادیر بالاتری را نشان می‌دهد که البته این اختلاف معنادار نیست که بتوان ادعا کرد در سویه‌های بومی فعالیت بالاتری مشاهده می‌‌شود، اما فعالیت در سطح VSL#3 را می‌توان برای سویه‌های بومی مطرح کرد. در رابطه با سوبسترای Leu-p-NA که ارزیابی آمینوپپتیداز نوع N را انجام می‌دهد، بیشترین میزان جذب به ترتیب مربوط به سویه‌های K1، B8-2، Y5، P2-3 و P35 است. سویه Y5 برای هردو آنزیم دارای فعالیت است. در مقایسه با فعالیت آنزیمی پرولیل‌اندوپپتیداز، همه‌ سویه‌های پروبیوتیک بومی برای آنزیم آمینوپپتیداز نوع N دارای فعالیت نیستند و اختلاف معناداری نسبت به کنترل منفی نشان ندادند. البته 8 سویه جذب بیشتری نسبت به VSL#3 که به ‌عنوان سویه کنترل مثبت مورد ارزیابی قرار گرفت، نشان دادند و سایر سویه‌ها فاقد چنین فعالیتی بودند. در این مورد هم اختلاف میزان جذب برای سویه‌های مثبت نسبت به VSL#3 معنادار نبوده و تنها می‌توان ادعا کرد که سویه‌های فوق دارای فعالیت هم‌سطح با نمونه تجاری هستند. 5 سویه که دارای بیشترین میزان جذب برای دو سوبسترای مذکور بودند، به‌ عنوان سویه‌های برتر شناسایی مولکولی شدند تا جنس و گونه آن‌ها مشخص شود. تصویرهای شماره 1 و 2، به ترتیب 5 سویه مثبت برای آنزیم پرولیل‌اندوپپتیداز و آمینوپپتیداز نوع N را در مقایسه با VSL#3 نشان می‌دهند.
شناسایی ملکولی سویه‌های انتخاب‌شده
تصویر شماره ۱ محصول PCR ژن s rDNA 16 برای 9 سویه لاکتوباسیل انتخاب‌شده (حدود bp 1500) را نشان می‌دهد که ابتدا بر روی ژل آگارز 1 درصد برده شد تا از کیفیت آن اطمینان حاصل شود.
 جدول شماره 3، جنس و گونه حاصل از Blast سویه‌های انتخاب‌شده در این پژوهش و نیز Accession number ژن ثبت‌شده در NCBI را نشان می‌دهد. همچنین نتایج میزان شباهت بین سویه‌های جدا شده با سویه‌های موجود در درخت فیلوژنی در تصویر شماره 2 ارائه شده است. اعداد نوشته شده بروی خطوط بیانگر بوت استرپ است.
مقایسه نتایج عملکرد پروبیوتیک‌های بومی و تجاری
 نتایج مطالعه نشان می‌دهد که پروبیوتیک‌های بومی از طریق تولید آنزیم‌های پرولیل‌اندوپپتیداز و آمینوپپتیداز نوعN قادر به تجزیه و تغییر گلوتن هستند (جدول شماره 4).
مطالعه حاضر نشان داد که پروبیوتیک‌های بومی ایران از نظر فعالیت آنزیمی پرولیل‌اندوپپتیداز و آمینوپپتیداز نوع N دارای اختلاف فعالیت معناداری نسبت به نمونه تجاری (VSL#3) است (تصویر شماره 3). یافته‌های حاصل از این تحقیق ضمن مشخص کردن اثر پروبیوتیک‌ها در تجزیه گلوتن می‌تواند مبنایی جهت مطالعات کاربردی در این زمینه باشد.

بحث
لاکتوباسیل‌ها از مهم‌ترین گروه باکتری‌های اسیدلاکتیک هستند که نقش سلامت‌بخشی آن‌ها به اثبات رسیده است [21]. این باکتری‌ها به دلیل GRAS بودن، اهمیت زیادی برای استفاده در بیوتکنولوژی غذایی و دارویی دارند. نتایج تحقیقات بیانگر آن‌اند که پروبیوتیک‌ها در درمان بیماری‌های خودایمنی از جمله مولتیپل اسکلروزیس، دیابت نوع 1 و آرتریت روماتوئید نقش مؤثری دارند [2]. همچنین اثربخشی پروبیوتیک‌ها در درمان و پیشگیری سلیاک در مطالعات مختلف مورد ارزیابی قرار گرفته است. در بررسی‌ها نشان داده شده که تعدادی از باکتری‌ها متعلق به گونه لاکتوباسیل و بیفیدوباکتریوم سبب حفاظت سلول‌های اپی‌تلیال در برابر گلوتن می‌شوند [14]. در یک بررسی که در سال 2017 انجام گرفت 18 گونه پروبیوتیک تجاری از لحاظ توانایی آنزیماتیک برای تجزیه گلوتن مورد ارزیابی قرار گرفتند. 10 گونه لاکتوباسیل با بیشترین فعالیت آنزیمی در تجزیه اپیتوپ‌های غنی از پرولین انتخاب شدند. نتایج نشان داد که ترکیب این 10 گونه لاکتوباسیل می‌تواند به‌ عنوان یک فرمول پروبیوتیک بالقوه برای درمان بیماران سلیاک باشد [22]‌.
در یک بررسی که در سال 2017 انجام گرفت 18 گونه پروبیوتیک تجاری از لحاظ فعالیت آمینوپپتیداز نوع N، ایمنوپپتیداز، پرولیل‌اندوپپتیداز، تری‌پپتیداز، پرولیداز، پرولیناز و دی‌پپتیداز بررسی شدند. لاکتوباسیلوس پلانتاروم LP27 و LP35، لاکتوباسیلوس بولگاریکوس SP5 و دلبروکی بیشترین فعالیت آمینوپپتیداز نوع N و لاکتوباسیلوس پاراکازئی GP12 و ‌BGP2، لاکتوباسیلوس پلانتاروم LP33 و لاکتوباسیلوس رامنوسوس SP1 دارای بیشترین فعالیت پرولیل‌اندوپپتیداز بودند. 10 گونه لاکتوباسیل با بیشترین فعالیت آنزیمی در تجزیه اپیتوپ‌های غنی از پرولین انتخاب شدند. نتایج نشان داد که ترکیب این 10 گونه لاکتوباسیل می‌تواند به‌ عنوان یک فرمول پروبیوتیک بالقوه برای درمان بیماران سلیاک باشد [22].
در مطالعه‌ای که در سال 2015 انجام‌ شد، به منظور افزایش باکتری‌های تجزیه‌کننده گلوتن در روده، خوک‌ها به مدت 16 هفته با رژیم غنی از گلوتن تغذیه شدند. سپس باکتری‌های روده‌ای جداسازی و کشت داده شدند. 4 گونه به ‌طور مؤثری قادر به تجزیه گلوتن و کاهش ایمنی‌زایی آن بودند که شامل Lact. amylovorus, Lact. johnsonii, Lact. Ruminis، Lact. salivarius بودند [23]. این مطالعه نشان داد که لاکتوباسیلوس‌ها باکتری‌های روده‌ای غالب تجزیه‌کننده گلوتن هستند که یافته‌های آن موافق با یافته‌های بررسی‌ای است که توسط کامینرو انجام شد و هردو مطالعه Lact. Amylovorus، Lact. Ruminis را به ‌عنوان گونه‌های اصلی تجزیه‌کننده گلوتن شناسایی کردند [24]. در یک مطالعه که روی مدل‌های موشی حساس به گلیادین انجام‌گرفته به نظر می‌رسد تجویز Lactobasillus casei در کاهش علائم مؤثر واقع‌شده است [25].
همسو با یافته‌های پژوهش ما تحقیقاتی انجام گرفته که اثربخشی سویه‌های مذکور را در تجزیه‌ گلوتن و بهبود بیماری سلیاک نشان می‌دهد. در یک مطالعه در سال ۲۰۱۲ محققان Lactobacillus fermentum را به محیط کشت سلول‌های اپیتلیال روده اضافه کردند تا اثرات این پروبیوتیک را بر آسیب‌های ناشی از گلیادین بر سلول بررسی کنند. بررسی‌ها نشان داد اضافه کردن پروبیوتیک فوق به علت سم‌زدایی گلیادین و بهبود وضعیت سلول‌های روده می‌تواند در درمان بیماران سلیاکی مفید واقع شود [26].
در بررسی‌ای که در آن کودکان مبتلا به بیماری سلیاک با رژیم گلوتن تغذیه می‌شدند، نشان داده شد که تجویز روزانه خوراکی دو زیرگونه از L. paracasei و L.planarum سبب تسکین پاسخ‌های ایمنی در کودکان مبتلا به بیماری سلیاک می‌شود [27].
در یک بررسی که در سال 2017 انجام گرفت 18 گونه پروبیوتیک تجاری از لحاظ توانایی آنزیماتیک برای تجزیه گلوتن مورد ارزیابی قرار گرفتند. این بررسی نشان داد که گونه‌های لاکتوباسیل ارزیابی‌شده توانایی آنزیماتیک مختلفی در تجزیه اپیتوپ‌های غنی از پرولین دارند. L.plantarum (‌27LP‌‌‌ و 35LP) بیشترین فعالیت آمینوپپتید از نوع N را داشت.L.paracasei(GP12 و BGP2) و L.planarum(LP33) نیز دارای بیشترین فعالیت پرولیل‌اندوپپتیداز بودند. در‌نتیجه به عنوان سویه‌های بالقوه در تجزیه گلوتن قابل انتخاب هستند [28].
سویه‌های پروبیوتیک که در بررسی‌های ما به عنوان سویه‌های مؤثر در تجزیه‌ گلوتن و درمان بالقوه بیماران سلیاک معرفی شدند علاوه بر نقش مذکور، در درمان سایر بیماری‌ها هم به طور مؤثری به کار برده شده‌اند. به عنوان نمونه L. paracasei بر روی سلول‌های سرطانی دهانه‌ی رحم (هلا) نقش ضدسرطانی دارد و این نقش ضدسرطانی خود را از طریق افزایش بیان ژن‌های آپوپتوتیک BAX ،BAD ،caspase3 ،caspase8 ،caspase9 و کاهش بیان ژن BCl-2 القا می‌کند [29]. همچنین سویه‌ فوق می‌تواند یک ابزار مناسب در درمان بیماری روده‌ التهابی باشد [30]. به علاوه این سویه می‌تواند در پیشگیری و درمان کبد چرب غیر‌الکلی مؤثر واقع شود [31]. L.plantarum که سویه شناسایی‌شده دیگر بررسی‌های ما بود در درمان بیماری‌های کبدی الکلی مؤثر نشان داده شده است [32]. همچنین سویه‌ مذکور اثرات ضد‌آلزایمر از خود نشان داده است [33]. نشان داده شده که سویه‌ pentosus. L در پیشگیری و درمان هایپرکلسترمیا ایفای نقش می‌کند [34]. سویه دیگری که در بررسی‌های ما نقش اثربخشی در تجزیه گلوتن داشت L. helveticus بود که اثر‌بخشی آن در درمان سایر بیماری‌ها نیز نشان داده شده است. از جمله در یک تحقیق نشان داده شده که سویه‌ مذکور می‌تواند نقش پیشگیرانه در ابتلا به آرتریت روماتویید داشته باشد [35]. همچنین اثرات سودمند دیگری از جمله پیشگیری از عفونت‌های معده‌ای‌روده‌ای، افزایش محافظت در برابر عوامل پاتوژن و تعدیل پاسخ‌های ایمنی بیمار در سویه‌ مذکور مشخص شده است [36]. درنهایت سویه L. fermentum که اثرات مفیدی همچون کاهش کلسترول خون, نقش پیشگیرانه در عفونت‌های معده‌ای و تنفسی, پیشگیری از بیماری‌های کبدی الکلی و سرطان کلورکتال را دارد [37].
نتیجه‌گیری
مطالعه حاضر در محدوده‌ اثربخشی این پروبیوتیک‌ها تنها از نظر دو آنزیم بررسی شد و از نظر سایر بررسی‌ها به دلیل کمبود منابع مالی و امکانات دارای محدودیت است و نیاز است که کارایی آن‌ها از لحاظ فعالیت سایر آنزیم‌های موردنیاز جهت تجزیه کامل گلوتن شامل ایمنوپپتیداز، تری‌پپتیداز، پرولیداز، پرولیناز و دی‌پپتیداز مورد بررسی قرار گیرد تا بتوان به ترکیبی از پروبیوتیک‌های بومی با کارایی بالا جهت تجزیه گلوتن دست یافت. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که پروبیوتیک‌های بومی ایران دارای فعالیت مؤثر پرولیل‌اندوپپتیداز و آمینوپپتیداز نوع N هستند که می‌توانند به ‌عنوان گزینه‌های انتخابی جهت استفاده در ترکیبی جهت تجزیه گلوتن و کمک به بیماران سلیاکی مورد استفاده قرار گیرند. یافته‌های این پژوهش می‌تواند به‌ عنوان مبنایی در تحقیقات کاربردی مورد استفاده قرار گیرد.

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مقاله شامل هیچ‌گونه مطالعه‌ای بر روی نمونه‌های انسانی و حیوانانی نیست و در طول مسیر این مطالعه کلیه اصول اخلاق پژوهش در نظر گرفته شد.
حامی مالی
این مقاله با حمایت دانشگاه علوم‌پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی تهران انجام شده است.
مشارکت نویسندگان
طراحی پروژه: محمدعلی مظلومی؛ نگارش مقاله: الهام رستمی‌، رضا حیدری، مهدیه شیرزاد؛ طراحی جداول: الهام رستمی‌، رضا حیدری؛ کار آزمایشگاهی‌: الهام رستمی‌، رضا حیدری، مهدیه شیرزاد؛ بررسی متن مقاله: محمدعلی مظلومی، الهه متوسلی.
تعارض منافع
نویسندگان اعلام می‌کنند که هیچ تضاد منافعی در این مقاله وجود ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مراتب سپاس‌گزاری خود را از معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم‌پزشکی تهران بابت حمایت مالی از این مطالعه به عمل می‌آورند.