دوره 15، شماره 1 - ( فروردین 1400 )
جلد 15 شماره 1 صفحات 9-2 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Moslehi A, Komeili-Movahed T. The Effects of Rosmarinic Acid on the Liver Fibrosis Induced by Non-alcoholic Steatohepatitis in Male Mice. Qom Univ Med Sci J 2021; 15 (1) :2-9
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3091-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3091-fa.html
مصلحی اعظم، کمیلی موحد طاهره. بررسی نقش رزمارینیک اسید بر فیبروز کبدی ناشی از بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی القاشده در موشهای سوری نر. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1400; 15 (1) :2-9
1- مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی قم، قم، ایران. ، moslehi2000@gmail.com
2- مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی قم، قم، ایران.
2- مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی قم، قم، ایران.
متن کامل [PDF 4735 kb]
(773 دریافت)
| چکیده (HTML) (1540 مشاهده)
متن کامل: (716 مشاهده)
مقدمه
امروزه بیماری کبد چرب غیرالکلی یک اختلال شایع و رو به افزایش در سراسر جهان است. این بیماری ناشی از تجمع چربی در سلولهای کبدی است [1]. مطالعات اپیدمیولوژیک نشان دادهاند که در حدود 20 درصد از موارد کبد چرب غیرالکلی به سمت یک عارضه جدیتر به نام استئاتوهپاتیت غیرالکلی یا NASH پیشرفت میکنند [2] که در صورت عدم بهبود میتواند به فیبروز کبدی، سیروز و حتی کارسینوم هپاتوسلولار منجر شود [3]. تجمع بیش از حد چربی در کبد منجر به فعال شدن سلولهای کوپفر و سلولهای ستارهای کبد و رهایش سیتوکینها و کموکینها از آنها و درنتیجه التهاب و فیبروز در کبد میشود [4]. مطالعات مختلف نشان دادهاند که پیشرفت NASH با درجات مختلفی از فیبروز کبدی همراه است [5 ،6]. فیبروز کبدی با تولید غیرطبیعی ماتریکس خارج سلولی، افزایش بیان مارکرهای مزانشیمی مثل α-SMA و desmin، collagen α1 و درنهایت افزایش فیبرهای کلاژن در بافت کبد همراه است [8 ،7]. TGF-β به عنوان اصلیترین سیتوکین پیشفیبروزی شناخته میشود که به وسیله سلولهای ستارهای کبد ترشح میشود [9 ،10]. افزایش تولید TGF-β به نوبه خود موجب افزایش بیان α-SMA و collagen α1 شده و منجر به رسوب رشتههای کلاژن و فیبروز در کبد میشود [11]. تحقیقات انجامشده در این زمینه نشان داده است که ناریجنین به عنوان یک فلاونوئید با مهار ترشح TGF-β موجب کاهش فیبروز کبدی القاشده به وسیله تتراکلرید کربن شود [12]. همچنین ارسنیک میتواند با فعال کردن مسیر TGF-β/Smadو افزایش تولید α-SMA موجب فیبروز کبدی شود [13].
رزمارینیک اسید یک ترکیب سنتتیک است، اما به فراوانی در گیاهانی چون Lamiaceae family including Ros-marinus officinalis (R. officinalis) (rosemary)، Coleus aromaticus Origanum vulgare L. (oregano) و Thymus vulgaris L. (thyme) یافت میشود [14]. مطالعات متعدد اثرات مثبت رزمارینیک اسید را بر بهبود دیابت، شوک سپتیک و آسیبهای کبدی و کلیوی نشان دادهاند [15 ،16]. رزمارینیک اسید با مهار مقاومت به انسولین و افزایش بیان GLUT4 موجب کاهش گلوکز خون میشود [17]. همچنین رزمارینیک اسید اثرات قابل توجهی نیز در کاهش التهاب و استرس اکسیداتیو داشته و به عنوان یک آنتیاکسیدان قوی شناخته میشود [15، 18، 19]. گزارش شده است که رزمارینیک اسید با کاهش فعالیت مسیر TGF-β1/SMAD3/α-SMA، فیبروز کلیوی ایجادشده توسط کادمیم را بهبود بخشیده است [20]. علاوه بر این مطالعهای دیگر نشان داد که رزمارینیک اسید باعث کاهش فعال شدن سلولهای ستارهای کبد و کاهش بیان TGF-β و α-SMA در محیط in vitro در کبد شد [21].
با توجه به شیوع و اهمیت بیماری NASH و گسترش آن به سمت فیبروز کبدی و نیز اثرات مثبت رزمارینیک اسید در کاهش التهاب، استرس اکسیداتیو و فیبروز، این مطالعه جهت بررسی اثرات رزمارینیک اسید بر کاهش فیبروز کبد در بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی القاشده در موشهای سوری نر و نقش TGF-β در این زمینه انجام شد.
روش بررسی
این مطالعه در حیوانخانه دانشگاه علومپزشکی قم و روی 24 سر موش سوری نر نژاد C57/BL6 در محدوده وزنی 25 تا27 گرم انجام شد (خریداریشده از انستیتو پاستور، ایران). حیوانات در مدت مطالعه در شرایط استاندارد دمایی (2±92 درجه سانتیگراد) و رطوبت نسبی (45 تا 48 درصد) و سیکل 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی قرار داشته و دسترسی آزاد به آب و غذا داشتند. حیوانات به طور تصادفی به چهار گروه ششتایی تقسیم شدند؛ شامل گروه کنترل: حیواناتی که سالم بوده و از غذای معمولی استفاده میکردند؛ گروه RA: حیواناتی که رژیم غذایی معمولی داشته و روزانه به مدت هشت هفته 10 میلیگرم / کیلوگرم رزمارینیک اسید را به شکل داخل صفاقی دریافت میکردند [22]؛ گروه NASH: حیواناتی بودند که به مدت هشت هفته تحت رژیم فاقد متیونین کولین یا MCD قرار داشتند تا بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی در آنها ایجاد شود [23] و گروه NASH+ RA: موشهایی بودند که رژیم MCD را به مدت هشت هفته دریافت کرده و همزمان تزریق روزانه همان دُز رزمارینیک اسید را دریافت میکردند. بعد از این مدت حیوانات با استفاده از تزریق داروی بیهوشی کتامین گزیلازین بیهوش شدند [24] و یک برش میانی در ناحیه شکمشان ایجاد شد و کبد در معرض دید قرارگرفت. کبد بلافاصله خارج و شسته شد و بخشی از آن در فرمالین 10 درصد قرار داده شد. بخش دیگری از بافت نیز جهت اندازهگیری بیان ژنها در فریزر منفی 80 درجه سانتیگراد نگهداری شد. نمونه خون به شکل مستقیم از قلب حیوانات تهیه شد.
ارزیابی بیوشیمیایی
نمونههای خون با دور 3500 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند و سرم تهیه شد. برای اندازهگیری غلظت سرمی ALT و AST از دستورالعمل کیتهای بیوشیمیایی (پارس آزمون، ایران) و دستگاه اتوآنالیزر استفاده شد.
مطالعات بافتشناسی
24 ساعت پس از قرار گرفتن بخشی از لوب میانی کبد در فرمالین 10 درصد بافت آبگیری و با پارافین قالبگیری شد. سپس برشهای 5 میکرومتری از این قالبها تهیه شد و تحت رنگآمیزی تریکروم ماسون قرار گرفت و با استفاده از میکروسکپ نوری (OLYMPUS, AX70) جهت بررسی فیبروز کبدی و مشاهده رسوب کلاژن ارزیابی شد.
مطالعات مولکولی
جهت بررسی بیان ژنهای TGF-β و α-SMA از روش Real-time RT-PCR استفاده شد. در این روش ابتدا RNA از بافت کبد استخراج شد و میزان خلوص آن با استفاده از دستگاه نانودراپ (Nanolytik، آلمان) تعیین شد. سپس از روی آن cDNA به طور معکوس ساخته شد و درنهایت با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، میزان بیان هرکدام از ژنها به طور کمی با استفاده از روش 2-ΔΔCt اندازه گیری شد و با میزان بیان ژن GAPDH مقایسه شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده در زیر آورده شده است:
Α-SMA (F): CCCAGACATCAGGGAGTAATGG
(R) TCTATCGGATACTTCAGCGTCA
TGFβ (F): CTTCAATACGTCAGACATTCGGG
(R) GTAACGCCAGGAATTGTTGCTA
GAPDH: (F)TGGCCTTCCGTGTTCCTAC
(R) GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA
ارزیابی آماری دادهها
دادههای این مطالعه به صورت میانگین±خطای استاندارد بیان شدند. برای ارزیابی آماری و مقایسه بین گروههای مختلف از روش آنالیز واریانس یکطرفه و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. در تمامی محاسبات، P<0/05 به عنوان سطح معناداری لحاظ شد.
یافتهها
بررسی اثر رزمارینیک اسید بر غلظت سرمی ALT و AST در بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی القاشده در موشهای سوری نر
نتایج این مطالعه نشان داد که سطح سرمی ALT و AST در گروه NASH نسبت به گروه کنترل به شکل معنیداری افزایش یافته است (37/7±8/140 و 37/5±836/49 در مقابل 76/1±126/82 و 1±7/18، به ترتیب 001/0P<) در حالی که غلظت آنها در خون در گروه NASH+RA نسبت به گروه NASH به شکل معنیداری کاهش پیدا کرد (7/5±110 و 33/4±063/30 در مقابل 37/7±8/140 و 37/5±836/49 به ترتیب، 05/P<) (تصویر شماره 1).
بررسی اثر رزمارینیک اسید بر تغییرات بافتشناسی کبد در بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی القاشده در موشهای سوری نر
ارزیابیها از مطالعات بافتشناسی بیان میکنند که در گروههای کنترل و RA ساختار کبد طبیعی بوده و سلولهای کبدی به شکل منظم در اطراف مجرای ورید مرکزی قرار گرفتهاند در حالی که در گروه NASH سلولها بزرگ شده و در دیواره ورید مرکزی و فضای پورت رسوب فیبرهای کلاژن مشاهده میشود که بهتدریج به سمت سلولهای اطراف پیشروی کرده است و در گروه NASH+RA این رشتهها کاهش یافته و به میزان بسیار کمتری دیده میشود (تصویر شماره 2).
بررسی اثر رزمارینیک اسید بر میزان بیان ژنهای TGF-β و α-SMA کبد در بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی القاشده در موشهای سوری نر
دادههای این مطالعه افزایش معنیداری در میزان بیان mRNA ژن TGF-β در گروه NASH نسبت به گروه کنترل نشان داد (36/0± 66/1 در مقابل 1، 01/0P<). در حالی که استفاده از رزمارینیک اسید به مدت هشت هفته در موشهای مبتلا به استئاتوهپاتیت غیرالکلی موجب کاهش بیان TGF-β در گروه NASH+RA نسبت به گروه NASH شد (08/0± 01/1 در مقابل 36/0 ± 66/1، 05/P<0). به همین شکل میزان بیان mRNA ژن α-SMA در گروه NASH نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری داشت (14/0±92/1 در مقابل 1، 01/0 P<) و در گروه NASH+RA نسبت به گروه NASH به شکل معنیداری کاهش یافت (82/0±22/0در مقابل 14/0 ±92/1، 05/0 P<) (تصویر شماره 3).
بحث
فیبروز کبدی یک اختلال جدی است که میتواند به دنبال بیماریهایی چون کله استاز، NASH، داروهای شیمیدرمانی و مواد شیمیایی مختلف ایجاد شده و کبد را به سمت کارسینوم پیش ببرد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که استفاده از رزمارینیک اسید موجب کاهش سطح سرمی ALT و AST شده، بیان ژنهای TGF-β و α-SMA را مهار کرده و درنهایت موجب کاهش تشکیل و رسوب رشتههای کلاژن و بهبود فیبروز ناشی از بیماری NASH شده است. رزمارینیک اسید ماده مؤثر اصلی در گیاهانی چون رزماری است. مطالعات انجامشده در گذشته نشان دادهاند که رزمارینیک اسید اثرات قابل توجهی در بهبود استرس اکسیداتیو، التهاب و آپوپتوز در بیماریهای مختلف دارد [17-15]. کیم و همکارانش قبلاً نشان دادهاند که رزمارینیک اسید موجب حفاظت کبد در برابر استرس اکسیداتیو و آپوپتوز در موشهای سوری مبتلا به NASH میشود [25].
یافتههای از این مطالعه نشان داد که تزریق رزمارینیک اسید به مدت هشت هفته موجب کاهش سطوح سرمی ALT و AST شد. افزایش سطح این دو آنزیم معمولاً نشاندهنده آسیبهای کبدی است و کاهش غلظت خونی آنها نشانهای از بهبود آسیب ایجادشده است. در این زمینه کمیلی موحد و همکارانش نشان دادند که استفاده از آلانتوئین به مدت چهار هفته موجب کاهش غلظت خونی ALT و AST و بهبود آسیب کبدی در موشهای سوری مبتلا به NASH شد [23]. همچنین حسنین و همکاران گزارش کردند که استفاده از رزمارینیک اسید، آسیب کبدی ناشی از مصرف استامینوفن را بهبود بخشیده و سطوح سرمی ALT و AST را کاهش داده است [26]. در اینجا نیز به نظر میرسد که استفاده از رزمارینیک اسید توانسته است که صدمات کبدی ایجادشده به دلیل بیماری NASH و التهاب ناشی از تجمع بیش از حد تریگلیسریدها را بهبود بخشد.
فیبروز کبدی معمولاً در مراحل انتهایی بیماری NASH ایجاد میشود و ناشی از فعالیت بیش از حد سلولهای ستارهای کبد و افزایش رهایش سیتوکینهای ایجادکننده فیبروز است. ارزیابیهای بافتشناسی در این مطالعه نشان داد که در گروه NASH رسوب فیبرهای کلاژن در فضای پورت و اطراف ورید مرکزی مشاهده میشود که به سمت هپاتوسیتها گسترش یافتهاند در حالی که استفاده از رزمارینیک اسید موجب کاهش معنیداری در رسوب رشتههای کلاژن و فیبروز کبدی شد. قبلاً جواردار و تیمش نشان داده بودند که رزمارینیک اسید موجب کاهش علائم فیبروز در بافت کلیه موشهای صحرایی قرار گرفته در معرض کادمیم شده است [20]. در مطالعهای دیگر گزارش شد که رزمارینیک اسید، فیبروز ریوی ایجادشده توسط اشعه ایکس را کاهش داد [27]. همسو با مطالعات گذشته، در اینجا نیز رزمارینیک اسید توانسته است باعث کاهش رسوب کلاژن و بهبود فیبروز کبدی در موشهای سوری مبتلا به NASH شود.
برای درک بهتر مکانیسمی که به وسیله آن، رزمارینیک اسید موجب بهبود فیبروز کبدی در موشهای سوری مبتلا به NASH میشود، بیان ژنهای TGF-β و α-SMA در بافت کبد اندازهگیری شد. TGF-β به عنوان یک فاکتور نسخه برداری و اصلیترین عامل در فعال کردن مسیرهای فیبروزی شناخته میشود [10]. درواقع با افزایش فعالیت HSC و رهایش سیتوکینها و کموکینهای التهابی از این سلولها، TGF-β فعال شده و موجب افزایش نسخهبرداری از ژنهای سنتزکننده کلاژن مثل α-SMA ،collagen α1 و فیبرونکتین میشود [11]. در یک پژوهش چن و تیمش بیان کردند که رزمارینیک اسید با مهار مسیر سیگنالینگ α-SMA/TGF-β موجب کاهش فیبروز در سلولهای اپیتلیال شده است [28]. همچنین در مطالعهای دیگر گزارش شد که رزمارینیک اسید با کاهش فعالیت مسیر α-SMA /TGF-β فیبروز را در کله استاز خارج کبدی در موشهای صحرایی بهبود بخشید [29]. این مطالعات با نتایج ما سازگار است و به نظر میرسد که احتمالاً بهبود فیبروز ایجادشده، ناشی از کاهش فعالیت TGF-β و درنتیجه کاهش ساخت α-SMA و درنهایت کاهش سنتز و رسوب رشتههای کلاژن باشد.
نتیجهگیری
نتایج این مطالعه نشان داد رزمارینیک اسید با مهار فعالیت مسیر سیگنالینگ α-SMA / TGF-، فیبروز کبدی ایجادشده در موشهای سوری مبتلا به NASH را کاهش داده و میتواند اثرات مثبتی در بهبود آسیب کبدی ناشی از بیماری NASH در موشهای سوری داشته باشد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی قم این مقاله را تأیید کرده است (کد اخلاق:IR.MUQ.REC.1397.037 ).
حامی مالی
دانشگاه علومپزشکی قم حامی مالی این پژوهش بوده است.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش همه بخشهای پژوهش حاضر مشارکت داشتهاند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
امروزه بیماری کبد چرب غیرالکلی یک اختلال شایع و رو به افزایش در سراسر جهان است. این بیماری ناشی از تجمع چربی در سلولهای کبدی است [1]. مطالعات اپیدمیولوژیک نشان دادهاند که در حدود 20 درصد از موارد کبد چرب غیرالکلی به سمت یک عارضه جدیتر به نام استئاتوهپاتیت غیرالکلی یا NASH پیشرفت میکنند [2] که در صورت عدم بهبود میتواند به فیبروز کبدی، سیروز و حتی کارسینوم هپاتوسلولار منجر شود [3]. تجمع بیش از حد چربی در کبد منجر به فعال شدن سلولهای کوپفر و سلولهای ستارهای کبد و رهایش سیتوکینها و کموکینها از آنها و درنتیجه التهاب و فیبروز در کبد میشود [4]. مطالعات مختلف نشان دادهاند که پیشرفت NASH با درجات مختلفی از فیبروز کبدی همراه است [5 ،6]. فیبروز کبدی با تولید غیرطبیعی ماتریکس خارج سلولی، افزایش بیان مارکرهای مزانشیمی مثل α-SMA و desmin، collagen α1 و درنهایت افزایش فیبرهای کلاژن در بافت کبد همراه است [8 ،7]. TGF-β به عنوان اصلیترین سیتوکین پیشفیبروزی شناخته میشود که به وسیله سلولهای ستارهای کبد ترشح میشود [9 ،10]. افزایش تولید TGF-β به نوبه خود موجب افزایش بیان α-SMA و collagen α1 شده و منجر به رسوب رشتههای کلاژن و فیبروز در کبد میشود [11]. تحقیقات انجامشده در این زمینه نشان داده است که ناریجنین به عنوان یک فلاونوئید با مهار ترشح TGF-β موجب کاهش فیبروز کبدی القاشده به وسیله تتراکلرید کربن شود [12]. همچنین ارسنیک میتواند با فعال کردن مسیر TGF-β/Smadو افزایش تولید α-SMA موجب فیبروز کبدی شود [13].
رزمارینیک اسید یک ترکیب سنتتیک است، اما به فراوانی در گیاهانی چون Lamiaceae family including Ros-marinus officinalis (R. officinalis) (rosemary)، Coleus aromaticus Origanum vulgare L. (oregano) و Thymus vulgaris L. (thyme) یافت میشود [14]. مطالعات متعدد اثرات مثبت رزمارینیک اسید را بر بهبود دیابت، شوک سپتیک و آسیبهای کبدی و کلیوی نشان دادهاند [15 ،16]. رزمارینیک اسید با مهار مقاومت به انسولین و افزایش بیان GLUT4 موجب کاهش گلوکز خون میشود [17]. همچنین رزمارینیک اسید اثرات قابل توجهی نیز در کاهش التهاب و استرس اکسیداتیو داشته و به عنوان یک آنتیاکسیدان قوی شناخته میشود [15، 18، 19]. گزارش شده است که رزمارینیک اسید با کاهش فعالیت مسیر TGF-β1/SMAD3/α-SMA، فیبروز کلیوی ایجادشده توسط کادمیم را بهبود بخشیده است [20]. علاوه بر این مطالعهای دیگر نشان داد که رزمارینیک اسید باعث کاهش فعال شدن سلولهای ستارهای کبد و کاهش بیان TGF-β و α-SMA در محیط in vitro در کبد شد [21].
با توجه به شیوع و اهمیت بیماری NASH و گسترش آن به سمت فیبروز کبدی و نیز اثرات مثبت رزمارینیک اسید در کاهش التهاب، استرس اکسیداتیو و فیبروز، این مطالعه جهت بررسی اثرات رزمارینیک اسید بر کاهش فیبروز کبد در بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی القاشده در موشهای سوری نر و نقش TGF-β در این زمینه انجام شد.
روش بررسی
این مطالعه در حیوانخانه دانشگاه علومپزشکی قم و روی 24 سر موش سوری نر نژاد C57/BL6 در محدوده وزنی 25 تا27 گرم انجام شد (خریداریشده از انستیتو پاستور، ایران). حیوانات در مدت مطالعه در شرایط استاندارد دمایی (2±92 درجه سانتیگراد) و رطوبت نسبی (45 تا 48 درصد) و سیکل 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی قرار داشته و دسترسی آزاد به آب و غذا داشتند. حیوانات به طور تصادفی به چهار گروه ششتایی تقسیم شدند؛ شامل گروه کنترل: حیواناتی که سالم بوده و از غذای معمولی استفاده میکردند؛ گروه RA: حیواناتی که رژیم غذایی معمولی داشته و روزانه به مدت هشت هفته 10 میلیگرم / کیلوگرم رزمارینیک اسید را به شکل داخل صفاقی دریافت میکردند [22]؛ گروه NASH: حیواناتی بودند که به مدت هشت هفته تحت رژیم فاقد متیونین کولین یا MCD قرار داشتند تا بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی در آنها ایجاد شود [23] و گروه NASH+ RA: موشهایی بودند که رژیم MCD را به مدت هشت هفته دریافت کرده و همزمان تزریق روزانه همان دُز رزمارینیک اسید را دریافت میکردند. بعد از این مدت حیوانات با استفاده از تزریق داروی بیهوشی کتامین گزیلازین بیهوش شدند [24] و یک برش میانی در ناحیه شکمشان ایجاد شد و کبد در معرض دید قرارگرفت. کبد بلافاصله خارج و شسته شد و بخشی از آن در فرمالین 10 درصد قرار داده شد. بخش دیگری از بافت نیز جهت اندازهگیری بیان ژنها در فریزر منفی 80 درجه سانتیگراد نگهداری شد. نمونه خون به شکل مستقیم از قلب حیوانات تهیه شد.
ارزیابی بیوشیمیایی
نمونههای خون با دور 3500 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند و سرم تهیه شد. برای اندازهگیری غلظت سرمی ALT و AST از دستورالعمل کیتهای بیوشیمیایی (پارس آزمون، ایران) و دستگاه اتوآنالیزر استفاده شد.
مطالعات بافتشناسی
24 ساعت پس از قرار گرفتن بخشی از لوب میانی کبد در فرمالین 10 درصد بافت آبگیری و با پارافین قالبگیری شد. سپس برشهای 5 میکرومتری از این قالبها تهیه شد و تحت رنگآمیزی تریکروم ماسون قرار گرفت و با استفاده از میکروسکپ نوری (OLYMPUS, AX70) جهت بررسی فیبروز کبدی و مشاهده رسوب کلاژن ارزیابی شد.
مطالعات مولکولی
جهت بررسی بیان ژنهای TGF-β و α-SMA از روش Real-time RT-PCR استفاده شد. در این روش ابتدا RNA از بافت کبد استخراج شد و میزان خلوص آن با استفاده از دستگاه نانودراپ (Nanolytik، آلمان) تعیین شد. سپس از روی آن cDNA به طور معکوس ساخته شد و درنهایت با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، میزان بیان هرکدام از ژنها به طور کمی با استفاده از روش 2-ΔΔCt اندازه گیری شد و با میزان بیان ژن GAPDH مقایسه شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده در زیر آورده شده است:
Α-SMA (F): CCCAGACATCAGGGAGTAATGG
(R) TCTATCGGATACTTCAGCGTCA
TGFβ (F): CTTCAATACGTCAGACATTCGGG
(R) GTAACGCCAGGAATTGTTGCTA
GAPDH: (F)TGGCCTTCCGTGTTCCTAC
(R) GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA
ارزیابی آماری دادهها
دادههای این مطالعه به صورت میانگین±خطای استاندارد بیان شدند. برای ارزیابی آماری و مقایسه بین گروههای مختلف از روش آنالیز واریانس یکطرفه و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. در تمامی محاسبات، P<0/05 به عنوان سطح معناداری لحاظ شد.
یافتهها
بررسی اثر رزمارینیک اسید بر غلظت سرمی ALT و AST در بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی القاشده در موشهای سوری نر
نتایج این مطالعه نشان داد که سطح سرمی ALT و AST در گروه NASH نسبت به گروه کنترل به شکل معنیداری افزایش یافته است (37/7±8/140 و 37/5±836/49 در مقابل 76/1±126/82 و 1±7/18، به ترتیب 001/0P<) در حالی که غلظت آنها در خون در گروه NASH+RA نسبت به گروه NASH به شکل معنیداری کاهش پیدا کرد (7/5±110 و 33/4±063/30 در مقابل 37/7±8/140 و 37/5±836/49 به ترتیب، 05/P<) (تصویر شماره 1).
بررسی اثر رزمارینیک اسید بر تغییرات بافتشناسی کبد در بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی القاشده در موشهای سوری نر
ارزیابیها از مطالعات بافتشناسی بیان میکنند که در گروههای کنترل و RA ساختار کبد طبیعی بوده و سلولهای کبدی به شکل منظم در اطراف مجرای ورید مرکزی قرار گرفتهاند در حالی که در گروه NASH سلولها بزرگ شده و در دیواره ورید مرکزی و فضای پورت رسوب فیبرهای کلاژن مشاهده میشود که بهتدریج به سمت سلولهای اطراف پیشروی کرده است و در گروه NASH+RA این رشتهها کاهش یافته و به میزان بسیار کمتری دیده میشود (تصویر شماره 2).
بررسی اثر رزمارینیک اسید بر میزان بیان ژنهای TGF-β و α-SMA کبد در بیماری استئاتوهپاتیت غیرالکلی القاشده در موشهای سوری نر
دادههای این مطالعه افزایش معنیداری در میزان بیان mRNA ژن TGF-β در گروه NASH نسبت به گروه کنترل نشان داد (36/0± 66/1 در مقابل 1، 01/0P<). در حالی که استفاده از رزمارینیک اسید به مدت هشت هفته در موشهای مبتلا به استئاتوهپاتیت غیرالکلی موجب کاهش بیان TGF-β در گروه NASH+RA نسبت به گروه NASH شد (08/0± 01/1 در مقابل 36/0 ± 66/1، 05/P<0). به همین شکل میزان بیان mRNA ژن α-SMA در گروه NASH نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری داشت (14/0±92/1 در مقابل 1، 01/0 P<) و در گروه NASH+RA نسبت به گروه NASH به شکل معنیداری کاهش یافت (82/0±22/0در مقابل 14/0 ±92/1، 05/0 P<) (تصویر شماره 3).
بحث
فیبروز کبدی یک اختلال جدی است که میتواند به دنبال بیماریهایی چون کله استاز، NASH، داروهای شیمیدرمانی و مواد شیمیایی مختلف ایجاد شده و کبد را به سمت کارسینوم پیش ببرد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که استفاده از رزمارینیک اسید موجب کاهش سطح سرمی ALT و AST شده، بیان ژنهای TGF-β و α-SMA را مهار کرده و درنهایت موجب کاهش تشکیل و رسوب رشتههای کلاژن و بهبود فیبروز ناشی از بیماری NASH شده است. رزمارینیک اسید ماده مؤثر اصلی در گیاهانی چون رزماری است. مطالعات انجامشده در گذشته نشان دادهاند که رزمارینیک اسید اثرات قابل توجهی در بهبود استرس اکسیداتیو، التهاب و آپوپتوز در بیماریهای مختلف دارد [17-15]. کیم و همکارانش قبلاً نشان دادهاند که رزمارینیک اسید موجب حفاظت کبد در برابر استرس اکسیداتیو و آپوپتوز در موشهای سوری مبتلا به NASH میشود [25].
یافتههای از این مطالعه نشان داد که تزریق رزمارینیک اسید به مدت هشت هفته موجب کاهش سطوح سرمی ALT و AST شد. افزایش سطح این دو آنزیم معمولاً نشاندهنده آسیبهای کبدی است و کاهش غلظت خونی آنها نشانهای از بهبود آسیب ایجادشده است. در این زمینه کمیلی موحد و همکارانش نشان دادند که استفاده از آلانتوئین به مدت چهار هفته موجب کاهش غلظت خونی ALT و AST و بهبود آسیب کبدی در موشهای سوری مبتلا به NASH شد [23]. همچنین حسنین و همکاران گزارش کردند که استفاده از رزمارینیک اسید، آسیب کبدی ناشی از مصرف استامینوفن را بهبود بخشیده و سطوح سرمی ALT و AST را کاهش داده است [26]. در اینجا نیز به نظر میرسد که استفاده از رزمارینیک اسید توانسته است که صدمات کبدی ایجادشده به دلیل بیماری NASH و التهاب ناشی از تجمع بیش از حد تریگلیسریدها را بهبود بخشد.
فیبروز کبدی معمولاً در مراحل انتهایی بیماری NASH ایجاد میشود و ناشی از فعالیت بیش از حد سلولهای ستارهای کبد و افزایش رهایش سیتوکینهای ایجادکننده فیبروز است. ارزیابیهای بافتشناسی در این مطالعه نشان داد که در گروه NASH رسوب فیبرهای کلاژن در فضای پورت و اطراف ورید مرکزی مشاهده میشود که به سمت هپاتوسیتها گسترش یافتهاند در حالی که استفاده از رزمارینیک اسید موجب کاهش معنیداری در رسوب رشتههای کلاژن و فیبروز کبدی شد. قبلاً جواردار و تیمش نشان داده بودند که رزمارینیک اسید موجب کاهش علائم فیبروز در بافت کلیه موشهای صحرایی قرار گرفته در معرض کادمیم شده است [20]. در مطالعهای دیگر گزارش شد که رزمارینیک اسید، فیبروز ریوی ایجادشده توسط اشعه ایکس را کاهش داد [27]. همسو با مطالعات گذشته، در اینجا نیز رزمارینیک اسید توانسته است باعث کاهش رسوب کلاژن و بهبود فیبروز کبدی در موشهای سوری مبتلا به NASH شود.
برای درک بهتر مکانیسمی که به وسیله آن، رزمارینیک اسید موجب بهبود فیبروز کبدی در موشهای سوری مبتلا به NASH میشود، بیان ژنهای TGF-β و α-SMA در بافت کبد اندازهگیری شد. TGF-β به عنوان یک فاکتور نسخه برداری و اصلیترین عامل در فعال کردن مسیرهای فیبروزی شناخته میشود [10]. درواقع با افزایش فعالیت HSC و رهایش سیتوکینها و کموکینهای التهابی از این سلولها، TGF-β فعال شده و موجب افزایش نسخهبرداری از ژنهای سنتزکننده کلاژن مثل α-SMA ،collagen α1 و فیبرونکتین میشود [11]. در یک پژوهش چن و تیمش بیان کردند که رزمارینیک اسید با مهار مسیر سیگنالینگ α-SMA/TGF-β موجب کاهش فیبروز در سلولهای اپیتلیال شده است [28]. همچنین در مطالعهای دیگر گزارش شد که رزمارینیک اسید با کاهش فعالیت مسیر α-SMA /TGF-β فیبروز را در کله استاز خارج کبدی در موشهای صحرایی بهبود بخشید [29]. این مطالعات با نتایج ما سازگار است و به نظر میرسد که احتمالاً بهبود فیبروز ایجادشده، ناشی از کاهش فعالیت TGF-β و درنتیجه کاهش ساخت α-SMA و درنهایت کاهش سنتز و رسوب رشتههای کلاژن باشد.
نتیجهگیری
نتایج این مطالعه نشان داد رزمارینیک اسید با مهار فعالیت مسیر سیگنالینگ α-SMA / TGF-، فیبروز کبدی ایجادشده در موشهای سوری مبتلا به NASH را کاهش داده و میتواند اثرات مثبتی در بهبود آسیب کبدی ناشی از بیماری NASH در موشهای سوری داشته باشد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی قم این مقاله را تأیید کرده است (کد اخلاق:IR.MUQ.REC.1397.037 ).
حامی مالی
دانشگاه علومپزشکی قم حامی مالی این پژوهش بوده است.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش همه بخشهای پژوهش حاضر مشارکت داشتهاند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
فیزیولوژی
دریافت: 1399/12/23 | پذیرش: 1400/1/31 | انتشار: 1400/1/10
دریافت: 1399/12/23 | پذیرش: 1400/1/31 | انتشار: 1400/1/10
فهرست منابع
1. Gottlieb A, Mosthael W, Sowa JP, Canbay A. Nonalcoholic-fatty-liver-disease and nonalcoholic steatohepatitis: Successful development of pharmacological treatment will depend on translational research. Digestion. 2019; 100(2):79-85. [DOI:10.1159/000493259] [PMID] [DOI:10.1159/000493259]
2. Wree A, Broderick L, Canbay A, Hoffman HM, Feldstein AE. From NAFLD to NASH to cirrhosis-new insights into disease mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2013; 10(11):627-36. [DOI:10.1038/nrgastro.2013.149] [PMID] [DOI:10.1038/nrgastro.2013.149]
3. Liu W, Baker RD, Bhatia T, Bhatia T, Zhu L, Baker SS. Pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis. Cell Mol Liff Sci. 2016; 73(10):1969-87. [DOI:10.1007/s00018-016-2161-x] [PMID] [DOI:10.1007/s00018-016-2161-x]
4. Noureddin M, Mato JM, Lu SC. Nonalcoholic fatty liver disease: update on pathogenesis, diagnosis, treatment and the role of S-adenosylmethionine. Exp Biol Med (Maywood). 2015; 240(6):809-20. [DOI:10.1177/1535370215579161] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1177/1535370215579161]
5. Anty R, Gual P. [Physiopathologie des stéatoses hépatiques métaboliques [Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (French)]. Presse Med. 2019; 48(12):1468-83. [DOI:10.1016/j.lpm.2019.09.051] [PMID] [DOI:10.1016/j.lpm.2019.09.051]
6. Takatani N, Kono Y, Beppu F, Okamatsu-Ogura Y, Yamano Y, Miyashita K, et al. Fucoxanthin inhibits hepatic oxidative stress, inflammation, and fibrosis in diet-induced nonalcoholic steatohepatitis model mice. Biochem Biophys Res Commun. 2020; 528(2):305-10. [DOI:10.1016/j.bbrc.2020.05.050] [PMID] [DOI:10.1016/j.bbrc.2020.05.050]
7. Peverill W, Powell LW, Skoien R. Evolving concepts in the pathogenesis of NASH: Beyond steatosis and inflammation. Int J Mol Sci. 2014; 15(5):8591-638. [DOI:10.3390/ijms15058591] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/ijms15058591]
8. Zhang CY, Yuan WG, He P, Lei JH, Wang CX. Liver fibrosis and hepatic stellate cells: Etiology, pathological hallmarks and therapeutic targets. World J Gastroenterol. 2016; 22(48):10512-22. [DOI:10.3748/wjg.v22.i48.10512] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3748/wjg.v22.i48.10512]
9. Basaranoglu M, Basaranoglu G, Sentürk H. From fatty liver to fibrosis: A tale of "second hit". World J Gastroenterol 2013; 19(8):1158-65. [DOI:10.3748/wjg.v19.i8.1158] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3748/wjg.v19.i8.1158]
10. Xu F, Liu C, Zhou D, Zhang L. TGF-β/SMAD Pathway and Its Regulation in Hepatic Fibrosis. J Histochem Cytochem. 2016; 64(3):157-67. [DOI:10.1369/0022155415627681] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1369/0022155415627681]
11. Zhang L, Zhou F, ten Dijke P. Signaling interplay between transforming growth factor-β receptor and PI3K/AKT pathways in cancer. Trends Biochem Sci. 2013; 38(12):612-20. [DOI:10.1016/j.tibs.2013.10.001] [PMID] [DOI:10.1016/j.tibs.2013.10.001]
12. Hernández-Aquino E, Muriel P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World J Gastroenterol. 2018; 24(16):1679-707. [DOI:10.3748/wjg.v24.i16.1679] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3748/wjg.v24.i16.1679]
13. Dai J, Xu M, Zhang X, Niu Q, Hu Y, Li Y, et al. Bi-directional regulation of TGF-β/Smad pathway by arsenic: A systemic review and meta-analysis of in vivo and in vitro studies. Life Sci. 2019; 220:92-105. [DOI:10.1016/j.lfs.2019.01.042] [PMID] [DOI:10.1016/j.lfs.2019.01.042]
14. Hasanein P, Seifi R. Beneficial effects of rosmarinic acid against alcohol-induced hepatotoxicity in rats. Can J Physiol Pharmacol. 2018; 96(1):32-7. [DOI:10.1139/cjpp-2017-0135] [PMID] [DOI:10.1139/cjpp-2017-0135]
15. Diao J, Wei J, Yan R, Liu X, Li Q, Li L, et al. Rosmarinic Acid suppressed high glucose-induced apoptosis in H9c2 cells by ameliorating the mitochondrial function and activating STAT3. Biochem Biophys Res Commun. 2016; 477(4):1024-30. [DOI:10.1016/j.bbrc.2016.07.024] [PMID] [DOI:10.1016/j.bbrc.2016.07.024]
16. Zhang Y, Chen X, Yang L, Zu Y, Lu Q. Effects of rosmarinic acid on liver and kidney antioxidant enzymes, lipid peroxidation and tissue ultrastructure in aging mice. Food Funct. 2015; 6(3):927-31. [DOI:10.1039/C4FO01051E] [PMID] [DOI:10.1039/C4FO01051E]
17. Prasannarong M, Saengsirisuwan V, Surapongchai J, Buniam J, Chukijrungroat N, Rattanavichit Y. Rosmarinic acid improves hypertension and skeletal muscle glucose transport in angiotensin II-treated rats. BMC Complement Altern Med. 2019; 19(1):165. [DOI:10.1186/s12906-019-2579-4] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/s12906-019-2579-4]
18. Ding Y, Zhang Z, Yue Z, Ding L, Zhou Y, Huanh Z, et al. Rosmarinic Acid Ameliorates H2O2-Induced Oxidative Stress in L02 Cells Through MAPK and Nrf2 Pathways. Rejuvenation Res. 2019; 22(4):289-98. [DOI:10.1089/rej.2018.2107] [PMID] [DOI:10.1089/rej.2018.2107]
19. Lu C, Zou Y, Liu Y, Niu Y. Rosmarinic acid counteracts activation of hepatic stellate cells via inhibiting the ROS-dependent MMP-2 activity: Involvement of Nrf2 antioxidant system. Toxicol Appl Pharmacol. 2017; 318:69-78. [DOI:10.1016/j.taap.2017.01.008] [PMID] [DOI:10.1016/j.taap.2017.01.008]
20. Joardar S, Dewanjee S, Bhowmick S, Dua TK, Das S, Saha A, et al. Rosmarinic Acid Attenuates Cadmium-Induced Nephrotoxicity via Inhibition of Oxidative Stress, Apoptosis, Inflammation and Fibrosis. Int J Mol Sci. 2019; 20(8):2027. [DOI:10.3390/ijms20082027] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/ijms20082027]
21. Li GS, Jiang WL, Tian JW, Qu GW, Zhu HB, Fu FH. In vitro and in vivo antifibrotic effects of rosmarinic acid on experimental liver fibrosis. Phytomedicine. 2010; 17(3-4):282-8. [DOI:10.1016/j.phymed.2009.05.002] [PMID] [DOI:10.1016/j.phymed.2009.05.002]
22. Zhang X, Ma ZG, Yuan YP, Xu SC, Wei WY, Song P, et al. Rosmarinic acid attenuates cardiac fibrosis following long-term pressure overload via AMPKα/Smad3 signaling. Cell Death Dis. 2018; 9(2):102. [DOI:10.1038/s41419-017-0123-3] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1038/s41419-017-0123-3]
23. Komeili Movahhed T, Moslehi A, Golchoob M, Abadzadeh S. Allantoin improves methionine-choline deficient diet-induced nonalcoholic steatohepatitis in mice through involvement in endoplasmic reticulum stress and hepatocytes apoptosis-related genes expressions. Iran J Basic Med Sci. 2019; 22(7):736-44. [DOI:10.22038/IJBMS.2019.33553.8012]
24. Nikoukar LR, Nabavizadeh F, Mohamadi SM, Moslehi A, Hassanzadeh G, Nahrevanian H, et al. Protective effect of ghrelin in a rat model of celiac disease. Acta Physiol Hung. 2014; 101(4):438-47. [DOI:10.1556/APhysiol.101.2014.4.5] [PMID] [DOI:10.1556/APhysiol.101.2014.4.5]
25. Kim M, Yoo G, Randy A, Son YJ, Hong CR, Kim SM, et al. Lemon balm and its constituent, Rosmarinic Acid, alleviate liver damage in an animal model of nonalcoholic steatohepatitis. Nutrients. 2020; 12(4):1166. [DOI:10.3390/nu12041166] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/nu12041166]
26. Hasanein P, Sharifi M. Effects of rosmarinic acid on acetaminophen-induced hepatotoxicity in male Wistar rats. Pharm Biol. 2017; 55(1):1809-16. [DOI:10.1080/13880209.2017.1331248] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1080/13880209.2017.1331248]
27. Zhang T, Ma S, Liu C, Hu K, Xu M, Wang R. Rosmarinic acid prevents radiation-induced pulmonary fibrosis through attenuation of ROS/MYPT1/TGFβ1 signaling via miR-19b-3p. Dose Res. 2020; 18(4):1559325820968413. [DOI:10.1177/1559325820968413] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1177/1559325820968413]
28. Chen YY, Tsai CF, Tsai MC, Chen WK, Hsu YW, Lu FJ. Anti-fibrotic effect of rosmarinic acid on inhibition of pterygium epithelial cells. Int J Ophthalmol. 2018; 11(2):189-95. [DOI:10.1177/1559325820968413] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1177/1559325820968413]
29. Lin SY, Wang YY, Chen WY, Liao SL, Chou ST, Yang CP, et al. Hepatoprotective activities of rosmarinic acid against extrahepatic cholestasis in rats. Food Chem Toxicol 2017; 108(Pt A):214-23. [DOI:10.1016/j.fct.2017.08.005] [PMID] [DOI:10.1016/j.fct.2017.08.005]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
