مجله دانشگاه علوم پزشکی قم

مقدمه
در سال‌های اخیر رویکرد مردم اکثر کشورهای جهان به مصرف داروهای گیاهی افزایش یافته است. به نظر میرسد عوارض جانبی کمتر نسبت به داروهای شیمیایی، دلیل اصلی این تغییر الگوی مصرف به نفع داروهای گیاهی باشد. داروهایی که امروزه در دنیا به‌طور وسیعی برای درمان انواع بیماری‌ها اعم از عفونت‌های باکتریایی، ویروسی و قارچی تا انواع بیماری‌های متابولیک به کار می‌روند، منشأ طبیعی دارند. این ترکیبات نه‌تنها در درمان بیماری‌های ناشی از میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا نقش دارند، بلکه به‌طور هم‌زمان می‌توانند اثرات جانبی که اغلب با مصرف نگهدارنده‌های شیمیایی و سنتزی همراه هستند را نیز کاهش دهند [1، 2]. این مسئله به همراه عوارض جانبی بعضی آنتی‌بیوتیک‌ها موجب شده است که محققین و دانشمندان همواره به دنبال آنتی‌بیوتیک‌های جدید با اثرات جانبی کمتر باشند. به همین دلیل منابع طبیعی، به‌خصوص گیاهان دارویی دارای اسرار بی‌شماری هستند و کشف هر‌یک از اسرار، گامی در جهت درمان و ریشه‌کن کردن بیماری‌هاست و از جایگاه خاصی برخوردار است [3]. علاوه‌بر‌این به‌منظور حفظ کیفیت مواد غذایی و افزایش طول عمر نگهداری آن‌ها از آنتی‌اکسیدان‌ها استفاده می‌شود.
استفاده از ترکیبات آنتی‌اکسیدانی به دلیل کنترل رادیکال‌های آزاد و جلوگیری از عمل اکسیداسیون (فساد شیمیایی) نقش بسزایی در افزایش پایداری و ماندگاری محصولات غذایی دارد. از سویی دیگر استفاده از آنتی‌اکسیدان‌های سنتزی مانند بوتیل هیدروکسی آنیزول، بوتیل هیدروکسی تولوئن، تری بوتیل هیدروکینون و پروپیل گالات در صنایع داروسازی، پزشکی و غذایی بسیار رواج یافته است [4، 5]. با‌این‌حال اثرات نامطلوب تغذیه‌ای و سمیت این آنتی‌اکسیدان‌های سنتزی در مطالعات مختلف به اثبات رسیده است. به همین دلیل یافتن ترکیبات دارای پتانسیل آنتی‌اکسیدانی و فعالیت ضدمیکروبی با منشأ طبیعی (اسانس و عصاره گیاهی) شدیداً مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته است، تعدادی از ترکیبات با خواص آنتی‌اکسیدانی به‌عنوان فراورده‌های ثانویه توسط گیاهان ساخته می‌شود که ازجمله آن‌ها می‌توان به ترکیبات فنولی اشاره کرد [6]. خوشبختانه سرزمین ایران به دلیل شرایط آب‌و‌هوایی مختلف دارای طیف وسیعی از گیاهان دارویی است و ایرانیان از دیرباز علاقه‌مند به استفاده از ترکیبات طبیعی دارویی بوده‌اند.
بهره‌گیری از روش‌های نوین، امکان شناسایی مواد مؤثره درمانگر موجود در گیاهان را فراهم کرده است. بنابراین در سال‌های اخیر تحقیقات گسترده‌ای جهت بررسی و ارزیابی اثرات ضدمیکروبی فراورده‌هایی با منشأ گیاهی از‌جمله عصاره‌ها و اسانس‌ها صورت گرفته و نتایج بیانگر قدرت و توانایی این ترکیبات در ممانعت از رشد دامنه وسیعی از میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا و عامل فساد است [7].
گیاه به‌لیمو از خانواده شاهپسند بومی آمریکای جنوبی بوده و درختچه‌ای همیشه سبز و برافراشته به ارتفاع 5/1 تا 2 متر با برگ‌های سرنیزه‌ای به طول 7 تا 10 سانتی‌متر است [8]. جنس Lippia دارای بیش از 200 گونه است که در این بین، گونه citriodora دارای اهمیت ویژه‌ای است. به‌لیمو یکی از گیاهان دارویی ارزشمند است که به‌عنوان یک گیاه معطر کشت و استفاده می‌شود. از برگ‌های این گیاه بوی خوشایند لیمو به مشام می‌رسد. برگ‌های این گیاه به‌صورت کشیده و به رنگ سبز کم‌رنگ به‌صورت دسته‌های سه‌تایی روی ساقه قرار می‌گیرند. برگ‌های به‌لیمو دارای ترکیبات فنولیک، فلاونوئیدها، اسیدهای فنولیک و فنیل پروپانوئیدها هستند [9]. همچنین گزارش شده است که عصاره به‌لیمو دارای 2 نوع ایریدوئید به نام وربنالین و هاستاتوزید است [10]. در فرهنگ گیاه‌درمانی ایران، برگ‌های این گیاه به‌صورت دم‌کردنی برای آرام‌بخشی، ضد‌تشنج بودن و برطرف‌ کردن تپش قلب و سرگیجه مصرف دارد. برگ‌ها و اندام رویشی این گیاه دارای خاصیت تب‌بر، مسکن، ضد‌نفخ و کمک‌کننده به هضم غذاست. چای به‌لیمو فوق‌العاده آرام‌بخش و تسکین‌دهنده اعصاب است [11]. همچنین گیاه به‌لیمو یک وسیله سنتی برای درمان سرماخوردگی، تب و اسپاسم است و برای درمان تب و درد معده نیز کاربرد دارد. عصاره این گیاه حاوی ترکیبات فنولی و دارای خواص ضد‌التهابی، ضدمیکروبی، ضد دردی و آنتی‌اکسیدانی است [12]. به همین دلیل می‌تواند در صنایع دارویی و غذایی کاربرد زیادی داشته باشد.
با‌توجه‌به خواص آنتی‌اکسیدانی و ضدمیکروبی گیاه به‌لیمو و از طرفی به دلیل سهل‌الوصول و ارزان بودن این گیاه و همچنین مصرف دارویی آن از زمان‌های دور، این تحقیق می‌تواند مقدمه‌ای جهت استفاده عملی از عصاره این گیاه در صنایع دارویی و غذایی باشد. مطالعه حاضر به‌منظور ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی و ضدمیکروبی عصاره اتانولی گیاه به‌لیمو روی باکتری‌های گرم مثبت (استافیلوکوک اورئوس، لیستریا اینوکوا و باسیلوس سرئوس) و گرم منفی (اشرشیاکلی، سودوموناس آئروژینوزا و سالمونلا تیفیموریوم) در شرایط آزمایشگاهی انجام گرفت.
روش بررسی
در این مطالعه تجربی، برگ‌های گیاه به‌لیمو در ابتدای مرحله گل‌دهی در مهر ماه 1398 از گلخانه آموزشی‌پژوهشی دانشگاه نهاوند برداشت شد. بعد از انتقال برگ‌ها به آزمایشگاه کشاورزی، جهت رفع گرد و غبار برگ‌ها با آب سرد به‌صورت سطحی شسته شدند و سپس 4 روز در سایه خشک شدند. برگ‌های خشک‌شده این گیاه توسط آسیاب آزمایشگاهی پودر شدند و با استفاده از حلال اتانول به نسبت 5 به 1 مخلوط شدند و 72 ساعت در دستگاه شیکر در دمای اتاق (25 درجه سانتی‌گراد) نگهداری شدند. عمل تکاندن دادن به دلیل تأثیر بهتر حلال بر گیاه جهت استحصال هر‌چه بهتر ترکیبات گیاه بود. بعد از 72 ساعت، ابتدا مخلوط حلال و گیاه از پارچه تمیز توری عبور داده شد و بقایای گیاه پس از چند مرحله فشردن و اطمینان از استخراج کامل دور ریخته شد. مخلوط عصاره و حلال از کاغذ صافی عبور داده شده و سپس 10 دقیقه در 3000 دور سانتریفیوژ (Centrifugus، ایران) شد. جهت حذف حلال اتانول، مخلوط به دستگاه روتاری (Heidolph, Hei-Vap, Germany) منتقل شد و در‌نهایت در دمای 45 درجه سانتی‌گراد در آون خشک شد. عصاره به‌لیمو توسط کاردک به‌طور دقیق تراشیده و درون ظرف شیشه‌ای تیره رنگ در یخچال نگهداری شد [13].
محلول کوئرستین، معرف فولین سیوکالتو و محلول 2 و 2 دی فنیل 1- پیکریل هیدرازیل از شرکت سیگما (آمریکا) و اتانول از شرکت صنایع شیمیایی غدیر (ایران) و بقیه مواد از شرکت مرک (آلمان) تهیه شدند.
مقدار 50 میلی‌گرم عصاره را با 1 میلی‌لیتر متانول مخلوط کرده و 50 میکرولیتر از آن با 1 میلی‌لیتر آب‌مقطر و 5 میلی‌لیتر معرف فولین سیوکالتو ترکیب شد. محلول مذکور 20 دقیقه در تاریکی قرار گرفت و سپس 5/2 میلی‌لیتر کربنات سدیم به آن افزوده و میزان جذب در طول موج 735 نانومتر قرائت شد [14]. منحنی استاندارد با استفاده از گالیک اسید در غلظت‌های 250، 500، 1000 و 1500 پی‌پی‌اِم تهیه و میزان جذب آن‌ها در طول موج 760 نانومتر قرائت شد. سپس منحنی استاندارد رسم و استفاده شد [15].
میزان محتوای فلاونوئید عصاره اتانولی به‌لیمو از‌طریق روش رنگ‌سنجی ارزیابی شد. برای این منظور، غلظت 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از عصاره تهیه شد و 5/0 میلی‌لیتر از نمونه در 5/1 میلی‌لیتر متانول حل شد و 1/0 میلی‌لیتر آلومنیوم کلراید 10 درصد به آن اضافه شد. سپس 1/0 میلی‌لیتر از محلول پتاسیم استات 1 مولار و در‌نهایت 8/2 میلی‌لیتر آب‌مقطر هم به آن اضافه شد و 30 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد و جذب مخلوط حاصل در طول موج 415 نانومتر قرائت شد. کوئرستین به‌عنوان استاندارد برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد [16].
اندازه‌گیری توانایی عصاره به‌لیمو در مهار رادیکال‌های آزاد محلول 2 و 2 دی فنیل 1- پیکریل هیدرازیل به این صورت انجام شد که ابتدا محلول‌هایی با غلظت‌های مختلف (25/31، 5/62، 125، 250، 500 و 1000 پی‌پی‌اِم) از عصاره آماده شدند، سپس 3/0 میلی‌لیتر از عصاره با 7/2 میلی‌لیتر از محلول متانولی 2 و 2 دی فنیل 1- پیکریل هیدرازیل به‌شدت مخلوط شد و 60 دقیقه در مکانی تاریک نگهداری شد و جذب آن در طول موج 517 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Analytik Jena AG, Jena, Germany) خوانده شد [17]. از آنتی‌اکسیدان سنتزی بوتیل هیدروکسی آنیزول جهت مقایسه استفاده شد. در‌نهایت درصد مهارکنندگی رادیکال‌های آزاد محلول 2 و 2 دی فنیل 1- پیکریل هیدرازیل طبق فرمول شماره 1 محاسبه شد:
1.
100 × Acش/ (Ac – As) = درصد مهارکنندگی رادیکال‌های آزاد DPPH
در این رابطه Ac و As به ترتیب جذب شاهد و جذب نمونه است. سپس با رسم منحنی درصد مهار در مقابل غلظت‌های مختلف عصاره، مقدار IC50 (غلظتی از سوبسترا بر حسب میکروگرم بر میلی‌لیتر که برای کاهش محلول 2 و 2 دی فنیل 1- پیکریل هیدرازیل به میزان 50 درصد اولیه مورد نیاز است) برای عصاره تعیین شد [18].
سویه‌های میکروبی استاندارد به‌صورت آمپول لیوفیلیزه خریداری شدند. سویه‌های میکروبی شامل 3 سویه گرم مثبت (استافیلوکوک اورئوس، لیستریا اینوکوا و باسیلوس سرئوس) و 3 سویه گرم منفی (اشرشیاکلی، سودوموناس ائروژینوزا و سالمونلا تیفیموریوم) بود (جدول شماره 1).
جهت فعال‌سازی سویه‌های میکروبی و استاندارد کردن آن‌ها جهت ارزیابی فعالیت ضدمیکروبی عصاره به‌لیمو بر آن‌ها، مطابق با استاندارد نیم مک‌فارلند اقدام شد. در این آزمایش از کشت تازه و 24 ساعت از سویه‌های میکروبی استفاده شد. تک کلنی خالص از هر سویه میکروبی با دقت برداشته و در محلول رینگر ریخته شد و تا برابری جذب آن با محلول نیم مک‌فارلند عمل رقیق‌سازی انجام شد. جذب در طول موج 625 نانومتر اندازه‌گیری شد. در این حالت میزان هر سویه میکروبی برابر با 108×5/1 واحد تشکیل کلنی بر میلی‌لیتر است [19].
اولین روش ضدمیکروبی برای ارزیابی فعالیت ضدمیکروبی عصاره اتانولی به‌لیمو شامل روش دیسک دیفیوژن آگار بود. در این روش از 5 دیسک کاغذی (ساخت پادتن طب) در اطراف و یک دیسک در مرکز پلیت به‌عنوان شاهد منفی استفاده شد. میزان 20 میکرولیتر از غلظت‌های 5/12، 25‌، 50 و 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره اتانولی به‌لیمو به‌آرامی بر سطح دیسکهای قرار گرفته و در سطح محیط کشت حاوی هر‌یک از سویه‌های استاندارد ریخته شد. پس از آن پتری دیش‌های کشت شده و جهت عمل پیش‌انتشار 15 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند [20]. در‌نهایت پتری دیش‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد 24 ساعت درون انکوباتور قرار گرفتند. پس از اتمام زمان انکوباسیون پتری دیش‌های میکروبی از انکوباتور خارج شده و منطقه بازدارندگی یا عدم رشد در محیط اطراف دیسک‌ها با در نظر گرفتن قطر دیسک توسط خط‌کش اندازه‌گیری و برحسب میلی‌متر گزارش شد [21].
روش چاهک در آگار دومین روش به کار گرفته‌شده برای اندازه‌گیری عصاره اتانولی به‌لیمو بر سویه‌های مورد‌بررسی بود. در این روش به‌طور خلاصه 5 عدد چاهک به قطر 6 میلی‌متر که شامل 4 عدد چاهک در اطراف پتری دیش و یک عدد چاهک به‌عنوان کنترل منفی بود توسط پیپت پاستور در سطح محیط کشت مولر هینتون آگار تعبیه شد.
 از پتری دیش 8 سانتی‌متری که حاوی 20 میلی‌لیتر محیط کشت مولر هینتون آگار بود استفاده شد. میزان 20 میکرولیتر از غلظت‌های 5/12، 25‌، 50 و 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره اتانولی به‌لیمو توسط سمپلر به‌آرامی درون 4 چاهک ریخته شد. پس از آن پتری دیش‌های کشت‌شده 15 دقیقه در دمای یخچال قرار گرفتند. در‌نهایت پتری دیش‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد 24 ساعت درون انکوباتور قرار گرفتند. پس از اتمام زمان انکوباسیون پتری دیش‌های میکروبی از انکوباتور خارج شده و منطقه بازدارندگی یا عدم رشد در اطراف هر‌یک از چاهک‌ها با خط‌کش به‌طور دقیق اندازه‌گیری و برحسب میلی‌متر گزارش شد [22].
برای تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی ابتدا غلظت‌های مختلفی از عصاره اتانولی به‌لیمو شامل 5/0، 1، 2، 4، 8، 16، 32، 64، 128 و 256 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تهیه شدند. میزان 100 میکرولیتر از غلظت‌های مختلف عصاره اتانولی به‌لیمو درون خانه‌های میکروپلیت 96 خانه‌ای ریخته شد. 10 میکرولیتر از هر یک از سوسپانسیون میکروبی استاندارد نیز به هر خانه اضافه شد. جهت تهیه غلظت‌های مختلف عصاره به‌لیمو میزان 56/2 گرم از عصاره اتانولی این گیاه با 5/9 میلی‌لیتر محیط کشت مولر هینتون براث و 5/0 میلی‌لیتر دیمتیل سولفواکسید 5/0 درصد مخلوط شد و غلظت 256 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر ساخته شد. برای تهیه سایر غلظت‌ها با نصف کردن غلظت مادر، رقت‌های بعدی عصاره ساخته شد. در‌نهایت میکروپلیت 96 خانه‌ای درون انکوباتور 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. پس از گذشت 24 ساعت، میکروپلیت 96 خانه‌ای از انکوباتور خارج شد و میزان 20 میکرولیتر از معرف تری فنیل تترازویلیوم کلرید به هر‌یک از چاهک‌ها اضافه شد و مجدداً عمل انکوبه‌گذاری 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد. در اثر واکنش بین معرف رنگی تری فنیل تترازویلیوم کلرید با سویه‌های میکروبی (در صورت رشد) رنگ قرمز یا ارغوانی مشاهده می‌شود. اولین چاهکی که در آن تغییر رنگ قرمز و ارغوانی مشاهده نشد غلظت آن، به‌عنوان حداقل غلظت مهارکنندگی برای سویه بیماری‌زا گزارش و ثبت شد [23].
برای تعیین حداقل غلظت کشندگی عصاره اتانولی به‌لیمو، از غلظت حداقل غلظت مهارکنندگی به سمت غلظت‌های بیشتر به روش پورپلیت میزان 100 میکرولیتر از غلظت‌ها بر محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شد. پس از کشت غلظت‌های مختلف عصاره به‌لیمو، پتری دیش‌های کشت‌شده درون انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی‌گراد 24 ساعت قرار گرفتند. پس از گذشت 24 ساعت پتری دیش‌ها به‌صورت چشمی ارزیابی شدند. اولین پتری دیشی که در آن کلنی باکتری قابل‌مشاهده پیدا نشد، غلظت آن به عنوان حداقل غلظت کشندگی در نظر گرفته شد [24].
آنالیز آماری
تمامی آزمایش‌های ذکر‌شده 3 بار تکرار شد و داده‌های جمع‌آوری‌شده با استفاده از آنالیز واریانس با نرم‌افزار SPSS ویرایش 20 تجزیه‌و‌تحلیل آماری شدند. مقایسه میانگین‌ها با آزمون آماری چند‌دامنه‌ای دانکن انجام شد و میانگین آن‌ها به‌عنوان مقدار مورد نظر اعلام شد. داده‌ها با P کمتر از 05/0 معنی‌دار در نظر گرفته شدند. نتایج بر‌اساس میانگین±‌انحراف معیار بیان شدند. همچنین جهت رسم نمودار از نرم‌افزار اکسل استفاده شد.
یافته‌ها
محتوای فنول و فلاونوئید اندازه‌گیری‌شده عصاره اتانولی به‌لیمو به ترتیب برابر 35/0±47/96 میلی‌گرم اسید گالیک در گرم عصاره و 42/0±07/31 میلی‌گرم کوئرستین در هر گرم عصاره بود. ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره این گیاه به روش محلول 2 و 2 دی فنیل 1- پیکریل هیدرازیل انجام شد و IC50 برای عصاره مورد‌نظر برابر با 76/0±79/11 میکروگرم بر میلی‌لیتر به دست آمد که در مقایسه با آنتی‌اکسیدان سنتزی بوتیل هیدروکسی آنیزول (29/0±16/10 میکروگرم بر میلی‌لیتر) ضعیف‌تر بود. همچنین فعالیت مهار رادیکال‌های آزاد محلول 2 و 2 دی فنیل 1- پیکریل هیدرازیل عصاره این گیاه در غلظت‌های مختلف (25/31، 5/62، 125، 250، 500 و 1000 پی‌پی‌اِم) تعیین شد. همان‌طور که در تصویر شماره 1 مشاهده می‌شود، با افزایش غلظت عصاره به‌لیمو همانند افزایش غلظت بوتیل هیدروکسی آنیزول میزان مهار رادیکال‌های آزاد نیز افزایش یافت و تفاوت آن (به غیر از غلظت 1000 پی‌پی‌اِم عصاره) با بوتیل هیدروکسی آنیزول معنی‌دار بود (05/0>P). بیشترین درصد مهار رادیکال‌های آزاد در غلظت 1000 پی‌پی‌اِم برابر با 25/84 درصد و کمترین قدرت مهارکنندگی برابر با 56/12 درصد، در غلظت 25/31 پی‌پی‌اِم حاصل شد (تصویر شماره 1).
نتایج ارزیابی فعالیت ضدمیکروبی عصاره اتانولی گیاه به‌لیمو به روش دیسک دیفیوژن آگار بر باکتری‌های مورد‌بررسی در جدول شماره 2 نشان داده شده است. نتایج نشان داد عصاره اتانولی در غلظت 5/12 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بر تمامی باکتری‌های گرم مثبت (استافیلوکوک اورئوس، لیستریا اینوکوا و باسیلوس سرئوس) کاملاً مؤثر بود، اما تأثیری بر باکتری‌های گرم منفی (اشرشیاکلی، سودوموناس ائروژینوزا و سالمونلا تیفیموریوم) نداشت و نتوانست از رشد این باکتری‌ها بر روی محیط کشت جلوگیری کند (جدول شماره 2). در غلظت‌های 25، 50 و 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره به‌لیمو برای تمامی میکروارگانیسم‌ها هاله عدم رشد مشاهده شد. همچنین مشخص شد که قطر هاله عدم رشد مشاهده‌شده در اطراف دیسک برای باکتری‌های گرم مثبت بزرگ‌تر از باکتری‌های گرم منفی بود.
با افزایش غلظت عصاره به‌لیمو در تمامی باکتری‌ها، قطر هاله عدم رشد افزایش یافت. به‌طوری‌که قطر هاله مشاهده‌شده در غلظت 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر برای تمامی سویه‌های میکروبی بیشترین بود. در غلظت 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره این گیاه، بیشترین قطر هاله عدم رشد برای باکتری استافیلوکوک ارئوس با قطر 95/0±10/19 میلی‌متر حاصل شد. در همین غلظت کمترین قطر هاله عدم رشد نیز متعلق به باکتری سودوموناس آئروژینوزا با قطر 45/0±60/9 میلی‌متر بود. نتایج آزمون آماری و مقایسه دوتایی میان غلظت‌های مختلف عصاره به‌لیمو نشان داد به غیر از غلظت‌های 25 و 50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر برای باکتری‌های باسیلوس سرئوس، اشرشیاکلی و سودوموناس ائروژینوزا در سایر غلظت‌های عصاره مورد‌بررسی اختلاف معنی‌داری وجود دارد (05/0>P).
همان‌طور که در جدول شماره 3 مشاهده می‌شود در روش چاهک در آگار با افزایش غلظت عصاره به‌لیمو از 5/12 به 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر قطر هاله عدم رشد به‌طور معنی‌داری افزایش یافت، به‌طوری‌که آنالیز آماری برای مقایسه دوتایی هر‌یک از غلظت‌های استفاده‌شده از عصاره به‌لیمو برای تمامی سویه‌های میکروبی دارای اختلاف معنی‌داری بود (05/0>P). در این روش نیز همانند روش دیسک دیفیوژن آگار عصاره به‌لیمو در غلظت 5/12 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر روی تمامی باکتری‌های گرم منفی بی‌تأثیر بود (جدول شماره 3). در غلظت 100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بیشترین و کمترین قطر هاله عدم رشد به ترتیب متعلق به باکتری‌های استافیلوکوک اورئوس و سودوموناس ائروژینوزا بود. مقایسه نتایج فعالیت ضدمیکروبی عصاره اتانولی به‌لیمو در روش‌های انتشار دیسک و چاهک در آگار نشان داد قطر هاله عدم رشد در روش چاهک در آگار نسبت به دیسک دیفیوژن آگار بیشتر بود.
نتایج حداقل غلظت مهارکنندگی و کشندگی عصاره اتانولی به‌لیمو بر سویه‌های میکروبی در جدول شماره 4 نشان داده شده است. نتایج نشان داد حداقل غلظت مهارکنندگی برای باکتری‌های استافیلوکوک اورئوس، لیستریا اینوکوا، باسیلوس سرئوس، اشرشیاکلی، سودوموناس آئروژینوزا و سالمونلا تیفیموریوم به ترتیب 8، 16، 64، 64، 128 و 128 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بود. حداقل غلظت بازدارندگی عصاره به‌لیمو در باکتری‌های گرم منفی بیشتر از باکتری‌های گرم مثبت بود. همچنین مشخص شد به غیر از باکتری باسیلوس سرئوس حداقل غلظت کشندگی برای تمامی سویه‌ها بزرگ‌تر از حداقل غلظت مهارکنندگی بود. به‌طوری‌که برای کشندگی سویه‌های میکروبی باید از غلظت‌های بالاتری نسبت به مهار آن استفاده کرد (جدول شماره 4).
بحث
با‌توجه‌به افزایش آگاهی مصرف‌کنندگان نسبت به عوارض مواد شیمیایی و سنتزی در انسان‌ها، امروزه پژوهشگران صنعت غذا به استفاده از گیاهان دارویی جهت کنترل اکسیداسیون محصولات غذایی و افزایش عمر نگهداری آن‌ها علاقه‌مند شده‌اند [25]. بنابراین، با‌توجه‌به پتانسیل بالای به‌لیمو جهت ایجاد عطر و طعم در مواد غذایی و درمان بسیاری از بیماری‌ها، عصاره این گیاه دارویی استخراج و پتانسیل آنتی‌اکسیدانی و فعالیت ضدمیکروبی آن در این مطالعه بررسی شد. میزان فنول کل و فلاونوئید عصاره اتانولی به‌لیمو به ترتیب برابر با 35/0±47/96 میلی‌گرم اسید گالیک در هر گرم عصاره و 42/0±07/31 میلی‌گرم کوئرستین در هر گرم عصاره تعیین شد. میزان محتوای فنول و فلاونوئید حاصل از این تحقیق می‌تواند فعالیت آنتی‌اکسیدانی موجود در عصاره این گیاه را توجیه کند. همبستگی مثبت بین میزان ترکیبات فنولی و فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌ها و اسانس‌های گیاهی در مطالعات مختلف به اثبات رسیده است [15، 26]. نوشاد و همکاران (2021) محتوای فنولی و فلاونوئیدی عصاره برگ به‌لیمو را به ترتیب 55/72 میلی‌گرم اسید گالیک در هر گرم عصاره و 5/40 میلی‌گرم کوئرستین در هر گرم عصاره گزارش کردند [27] که محتوای فنولی آن به مراتب از عصاره اتانولی این گیاه کمتر و محتوای فلاونوئیدی آن بیشتر بود.
 کومار و همکاران (2008) گزارش کردند که محتوای فنولی عصاره اتانولی به‌لیمو 1/53 میلی‌گرم اسید گالیک در هر گرم عصاره بود [28]. آلدین و همکاران (2015) نیز بیان کردند که محتوای فلاونوئیدی عصاره آبی به‌لیمو در محدوده 2 تا 8 میلی‌گرم کوئرستین در هر گرم عصاره بود [29]. تفاوت در نتایج محتوای فنول و فلاونوئید در این مطالعه با سایر تحقیقات صورت‌گرفته می‌تواند ناشی از نوع واریته، محل رشد گیاه (نوع خاک، دما و میزان آب)، زمان جمع‌آوری گیاه، روش خشک کردن، روش و شرایط مختلف استخراج عصاره و همچنین روش‌های مختلف اندازه‌گیری این ترکیبات باشد [30، 31].
آنتی‌اکسیدان‌هایی که مهارکننده رادیکال‌های آزاد هستند یکی از مهم‌ترین انواع آنتی‌اکسیدان هستند کـه بررسی ظرفیت آن‌هـا موضوع بسیاری از تحقیقـات و بحث‌های علمـی است. آنتی‌اکسیدان‌های مهاری از‌طریق مهار رادیکال آزاد قبل از حمله به مولکول‌های ضروری بدن عمل می‌کنند [32]. مهار رادیک‌ال آزاد یکـی از شناخته‌شده‌ترین مکانیسم‌هایی است کـه بـه واسـطه آن ترکیبـات آنتی‌اکسیدان می‌توانند اکسیداسیون چربی‌ها را مهار کننـد. اساس این روش بر مبنای احیای رادیکال آزاد محلول 2 و 2 دی فنیل 1- پیکریل هیدرازیل به وسیله آنتی‌اکسیدان‌ها در غیاب سایر رادیکال‌های آزاد در محیط است که نتیجه این عمل باعث ایجاد رنگی در محیط می‌شود که شدت آن با دستگاه طیف‌سنجی قابل‌اندازه‌گیری اسـت [33].
نتایج حاصل از بررسی خواص آنتی‌اکسیدانی عصاره به‌لیمو نیز دال بر خاصیت آنتی‌اکسیدانی آن بود و ﺑﺎ اﻓﺰایﺶ ﻏﻠﻈﺖ ﻋﺼﺎره ﻣﯿﺰان ﻣﻬﺎرﮐﻨﻨﺪﮔﯽ رادیﮑﺎل آزاد اﻓﺰایﺶ یافت ﮐﻪ ﺑﻪ ﻋﻠﺖ اﻓﺰایﺶ ﻣﻘﺪار ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت ﻓﻨوﻟﯽ و فلاونوئیدی در ﻏﻠﻈﺖ ﺑﺎﻻﺗﺮ ﻋﺼﺎره اﺳـﺖ. غلظت 1000 پی‌پی‌اِم عصاره این گیاه با آنتی‌اکسیدان بوتیل هیدروکسی آنیزول تفاوت معنی‌داری نداشت. قاسمی و همکاران (2019) به بررسی فعالیت آنتی‌اکسیدانی غلظت‌های مختلف اسانس به‌لیمو پرداختند، آن‌ها اعلام کردند تمامی غلظت‌های اسانس به‌لیمو دارای خاصیت آنتی‌اکسیدانی بود [34]. نوشاد و همکاران همچنین پتانسیل آنتی‌اکسیدانی عصاره آبی و اتانولی به‌لیمو را بررسی و مشاهده کردند که عصاره به‌لیمو از فعالیت آنتی‌اکسیدانی مناسبی برخوردار بود و عصاره اتانولی ظرفیت مهار رادیکال آزاد بالاتری نسبت به عصاره آبی نشان داد [27]. رودکی و همکاران (2015) گزارش کردند عصاره گیاه به‌لیمو دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی نسبتاً بالایی (70 درصد) است [35].
نتایج حاصل از اندازه‌گیری قطر هاله عدم رشد به روش انتشار در آگار (دیسک و چاهک) نشان داد که عصاره اتانولی به‌لیمو بر همه میکروارگانیسم‌های مورد‌بررسی موثر بود و با کاهش غلظت عصاره اثر بازدارندگی آن نیز کاهش یافت. به‌طوری‌که غلظت 5/12 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر اثر کمی بر باکتری‌های گرم مثبت مورد‌آزمون داشت، اما بر هیچ‌یک از باکتری‌های گرم منفی موثر نبود و نتوانست هاله عدم رشد ایجاد کند. بر‌اساس نتایج حاصل در هر 2 روش مورد‌بررسی کمترین میانگین قطر هاله عدم رشد در باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی به ترتیب مربوط به غلظت‌های 5/12 و 25 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بود. پروین و همکاران (2013) گزارش کردند باکتری‌های گرم مثبت نسبت به اسانس گیاه زردچوبه حساس‌تر از سایر میکروارگانیسم‌ها بودند [36]. نوشاد و همکاران نیز گزارش کردند که در غلظت 25 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره اتانولی به‌لیمو در باکتری سالمونلا تیفی هیچ‌گونه هاله عدم رشد مشاهده نشد [27].
چوپانی و همکاران (2014) گزارش کردند عصاره متانولی گیاه به‌لیمو در غلظت‌های 25 درصد و بالاتر از آن بر باکتری‌های استافیلوکوک اورئوس و اشرشیاکلی دارای اثر ضدمیکروبی است [37]. باکتری‌های گرم مثبت نسبت به باکتری‌های گرم منفی حساس‌تر بودند. در بررسی اثر روش‌های مختلف اسانس بر میزان فعالیت ضدمیکروبی اسانس برگ به‌لیمو گزارش شده است که مستقل از روش استخراج، باکتری‌های گرم مثبت در مقایسه با انواع گرم منفی از حساسیت بیشتری برخوردار بودند [38]. نوشاد و همکاران نیز گزارش کردند که سویه‌های گرم منفی (اشرشیاکلی و سالمونلا تیفی) در مقایسه با سویه‌های گرم مثبت (استافیلوکوک اورئوس و استرپتوکوک پیوژنز) دارای هاله عدم رشد کمتری بودند [27]. شاید علت حساسیت کمتر باکتری‌های گرم منفی نسبت به عصاره این گیاه غشای خارجی اطراف دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی باشد که سبب محدود کردن انتشار ترکیبات ضدمیکروبی به لایه لیپوپلی ساکاریدی می‌شود.
 باکتری‌های گرم منفی غشا، 2 لایه دارند که لایه پپتیدوگلیکان در فضایی بین غشای داخلی و خارجی به نام فضای پری پلاسمی قرار دارد. پری پلاسم بسیار فعال بوده و دارای آنزیم‌های مختلف تجزیه‌کننده و سم‌زداست. آنزیم‌های موجود در فضای پری پلاسمی (فسفاتاز و پروتئازها از گروه آنزیم‌های تجزیه‌ای و بتالاکتامازها) پنی سیلیناز و آنزیم‌های فسفوریله‌کننده آمینوگلیکوزید از گروه آنزیم‌های سم‌زدا قادرند مولکول‌های وارد‌شده را تجزیه کنند [39]. در‌مورد باکتری‌های گرم مثبت، مواد ضدمیکروبی به‌راحتی دیواره سلولی و غشای سیتوپلاسمی را تخریب می‌کنند که به نشت سیتوپلاسم و انعقاد آن منجر می‌شود. مکانیسم دیگر توانایی ترکیبات فنولی در اتصال با پروتئین‌هاست. این ترکیبات با تخریب گیرنده‌های سطحی دیواره باکتری‌ها، در سنتز پروتئین‌ها اختلال ایجاد می‌کنند [40]. در شناسایی ترکیبات شیمیایی، فعالیت آنتی‌اکسیدانی و ضدمیکروبی اسانس به‌لیمو رشد یافته در یونان مشخص شد که میکروارگانیسم‌های لیستریا مونوسیتوژنز، استافیلوکوک اپیدرمایدیس، استافیلوکوک اورئوس، ساکارومایسس سروزیه و آسپرژیلوس نایجر از حساس‌ترین میکروارگانیسم‌ها و سالمونلا تیفیموریوم و اشرشیاکلی از مقاوم‌ترین باکتری‌ها به اسانس این گیاه بودند [41].
در مطالعه‌ای دیگر که روی 16 گیاه جمع‌آوری‌شده از مناطق مختلف یمن انجام شد، مشخص شد که عصاره متانولی گیاه به‌لیمو بر استافیلوکوک اورئوس، باسیلوس سوبتیلیس و میکروکوکوس فلاووس دارای اثر ضدمیکروبی است. در‌حالی‌که در برابر باکتری‌هایی مانند اشرشیاکلی فاقد این خاصیت بود [42]. همچنین مشخص شد که فعالیت ضدمیکروبی عصاره وابسته به غلظت است. با مطالعه اثر ضدمیکروبی عصاره اتانولی کرفس کوهیمشخص شد افزایش غلظت عصاره سبب افزایش قطر هاله عدم رشد در روش دیسک دیفیوژن می‌شود [43]. سمنانی و همکاران نیز بیان کردند که با افزایش غلظت عصاره‌های اتانولی، استونی و آبی به‌لیمو، اثر ضد‌میکروبی تمامی عصاره‌ها افزایش یافت [44]. وجود یا عدم وجود تفاوت معنی‌دار بین میانگین قطر هاله عدم رشد در غلظت‌های مختلف را می‌توان به مقدار ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی موجود در عصاره نسبت داد. ارتباط مستقیمی بین افزایش غلظت عصاره و افزایش اثر مهارکنندگی وجود داشت. با افزایش غلظت، قطر هاله عدم رشد به‌طور معنی‌داری افزایش یافت. رابطه مثبت و معنی‌دار بین غلظت عصاره و ترکیبات فنولی گیاهانی چون آویشن شیرازی، بادرنجبویه، کاکوتی، رزماری، برگبو، مورد، زنیان، نعناع، اسطوخودوس، سیاه دانه و بوزیدان ثابت شده است. بنابراین با افزایش غلظت عصاره، غلظت ترکیبات فنولی به‌طور معنی‌داری افزایش یافته و به دنبال آن خاصیت ضدمیکروبی آن‌ها نیز افزایش یافت [45].
به‌طور‌کلی مقایسه نتایج بین 2 روش دیسک دیفوژن آگار و چاهک در آگار نشان داد قطر هاله عدم رشد در روش چاهک در آگار نسبت به دیسک دیفیوژن آگار بیشتر است. علت این امر را می‌توان نفوذ بهتر عصاره اتانولی به‌لیمو در محیط کشت و تماس مستقیم بین عصاره با سویه‌های میکروبی در روش چاهک و ناکارآمدی روش دیسک در جذب کافی عصاره و انتشار آن درون محیط کشت دانست. پژوهشگران زیادی نیز دلیل این اختلاف را ذکر کرده‌اند [46]. نتایج حداقل غلظت مهار‌کنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره این گیاه نیز نشان داد بیشترین حساسیت در برابر عصاره به‌لیمو مربوط به باکتری استافیلوکوک ارئوس بود و بیشترین مقاومت را باکتری‌های سودوموناس آئروژینوزا و سالمونلا تیفیموریوم از خود نشان دادند.
زارع (2018) فعالیت ضدمیکروبی اسانس گیاه به‌لیمو را بر باکتری‌های استافیلوکوک اورئوس، میکروکوکوس لوتئوس، باسیلوس سرئوس، باسیلوس سوبتیلیس، اشرشیاکلی، کلبسیلا پنومونیه، سودوموناس آئروژینوزا، کلبسیلا اکسیتوکا، آسپرژیلوس نایجر و کاندیدا آلبیکانس را با روش دیسک دیفیوژن بررسی کرد. نتایج این پژوهشگر نشان داد فعالیت ضد‌قارچی اسانس این گیاه از فعالیت ضدباکتریایی آن بیشتر است و حساس‌ترین میکروارگانیسم نسبت به اسانس آن آسپرژیلوس نایجر گزارش شد [47]. سمنانی و همکاران گزارش کردند عصاره‌های آبی، اتانولی و استونی استخراج‌شده از گیاه به‌لیمو دارای فعالیت ضدمیکروبی علیه باکتری‌های استرپتوکوک پیوژن، بروسلا ملی تنسیس، استافیلوکوک اپیدرمایدیس و کلبسیلا پنومونیه بودند [44].
نتیجه‌گیری
نتایج مطالعه حاضر نشان داد در عصاره اتانولی گیاه به‌لیمو ظرفیت مهارکنندگی رادیکال آزاد قابل‌توجه بود و اثر ضدمیکروبی بر سویه‌های مورد‌بررسی به‌ویژه باکتری‌های گرم مثبت از خود نشان داد. نتایج نشان داد باکتری‌های استافیلوکوک اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا به ترتیب بیشترین و کمترین حساسیت را در برابر عصاره گیاه به‌لیمو از خود نشان دادند. مطابق نتایج، عصاره زیست‌فعال به‌لیمو قابلیت استفاده به‌عنوان منبع طبیعی ترکیبات ضدمیکروب جهت جلوگیری از ضرر اقتصادی محصولات غذایی، بروز مشکلات سلامتی ناشی از سویه‌های میکروبی و مقاومت باکتریایی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مختلف را دارد. علاوه‌براین، می‌توان از عصاره به‌لیمو جهت تولید غذاهای فراسودمند و به‌منظور خنثی‌سازی صدمات ناشی از رادیکال‌های آزاد در بدن استفاده کرد. اگرچه انجام آزمون‌های تکمیلی به‌منظور کاربرد بالینی عصاره به‌لیمو پیشنهاد می‌شود.
در خاتمه به‌عنوان مهم‌ترین عوامل محدود‌کننده این تحقیق می‌توان به کمبود دستگاه‌ها و امکانات آنالیز فیتوشیمیایی و همچنین محدودیت اعتباری برای استفاده از سایر روش‌های تعیین خصوصیات آنتی‌اکسیدانی اشاره کرد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه دارای مصوبه کمیته اخلاق دانشگاه بوعلی سینا با کد اخلاق IR.BASU.REC.1398.036 است.
حامی مالی
معاونت محترم پژوهش و فناوری دانشگاه بوعلی سینا حامی مالی این مقاله بوده است.
مشارکت نویسندگان
 ایده و طراحی مطالعه: زهرا ایزدی و ناصر میرازی؛ جمع‌آوری داده‌ها: زهرا ایزدی؛ تحلیل و تفسیر داده‌ها: زهرا ایزدی؛ نگارش مقاله: زهرا ایزدی و ناصر میرازی؛ بررسی نتایج و نسخه نهایی: همه نویسندگان.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله از معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه بوعلی سینا به دلیل همکاری و مساعدت در مسیر انجام این تحقیق تشکر و قدردانی می‌شود.