دوره 15، شماره 6 - ( شهریور 1400 )
جلد 15 شماره 6 صفحات 425-414 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Hosseini M, Morovvati H, Anbara H. The Effect of Long-term Exposure to Aspartame on Histomorphometric, Histochemical and Expression of P53, Bcl-2 and Caspase-3 Genes in the Ovaries of Mice. Qom Univ Med Sci J 2021; 15 (6) :414-425
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3140-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3140-fa.html
حسینی محسن، مروتی حسن، عنبرا حجت. تأثیر مصرف طولانی‌مدت آسپارتام بر هیستومورفومتری، هیستوشیمی و بیان ژن‌های P53 ،Bcl-2 و Caspase-3 در تخمدان موش‌های سفید کوچک آزمایشگاهی. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1400; 15 (6) :414-425
محسن حسینی1 
، حسن مروتی* 2، حجت عنبرا1
، حسن مروتی* 2، حجت عنبرا1
1- گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
2- گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران ،hmorovvati@ut.ac.ir
2- گروه علوم پایه، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران ،
واژه‌های کلیدی: آسپارتام، تخمدان، P53، Bcl-2، Caspase-3
متن کامل [PDF 8327 kb]
(526 دریافت)
| چکیده (HTML) (1746 مشاهده)
متن کامل: (327 مشاهده)
مقدمه
آسپارتام از جمله افزودنی‌های مواد غذایی و از گروه شیرین‌کننده‌ها بوده و پودری بی‌بو، شدیداً شیرین، سفیدرنگ و بلورین است که در ترکیب غذاهای رژیمی کم‌کالری و بدون قند به فراوانی وجود دارد [2 ،1]. آسپارتام در میان افراد مبتلا به دیابت و اضافه‌وزن طرفداران بسیاری دارد، از این‌رو معروف‌ترین و پرمصرف‌ترین شیرین‌کننده مصنوعی لقب گرفته است [2 ،1]. آسپارتام دی‌پپتیدی حاصل از ترکیب دو اسیدآمینه اسیدآسپارتیک و فنیل‌آلانین است که در مقادیر یکسان با ساکاروز (قند طبیعی)، میزان کالری مشابهی (4 کیلوکالری بر گرم) را تولید می‌کند، ولی شدت شیرین‌کنندگی آن حدود 200 برابر بیشتر از ساکارز است [3]. آسپارتام در داخل دستگاه معده‌ای روده‌ای توسط استرازها و پپتیدازها به تقریباً 50 درصد فنیل‌آلانین، 40 درصد اسیدآسپارتیک و 10 درصد متانول هیدرولیز می‌شود [4 ،2].
متانول و متابولیت‌های حاصل از آن یعنی فرم‌آلدئید و اسیدفرمیک که نتیجه متابولیسم اصلی متانول هستند با وارد شدن به گردش سیاهرگی باب و سپس اکسیده شدن متانول در کبد، موجب سمیت در اکثر سلول‌ها و بافت‌های بدن می‌شوند [5]. متابولیسم متانول به فرم‌آلدئید و اسیدفرمیک، به سلول‌های کبدی آسیب وارد کرده و با افزایش سطح NADH و تشکیل آنیون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن همراه است که ممکن است در پراکسیداسیون لیپیدی مؤثر باشد [6]. قرار گرفتن در معرض متانول به عنوان یک محصول جانبی آسپارتام، باعث آسیب به غشای میتوکندریایی شده و منجر به بیش‌تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و ایجاد استرس اکسیداتیو، القای شکستگی در DNA، غیرفعال شدن پروتئین‌ها و آپوپتوز می‌شود [7 ،2]. به تازگی، بسیاری از مطالعات تجربی تأیید کرده‌اند که آسپارتام موجب افزایش خطر ابتلا به لنفوم، لوسمی، آسیب دستگاه تناسلی و ادراری، آسیب دستگاه عصبی مرکزی و ایجاد فرایند آپوپتوز می‌شود [10-8].
آپوپتوز یا مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی، فرایند فیزیولوژیکی است که نقشی کلیدی در حفظ هومئوستاز بافت‌های بالغ و نیز تنظیم تکامل سیستم ایمنی در جریان رشد و تومورزایی ایفا می‌کند. آپوپتوز نوعی مرگ سلولی است که در آن سلول‌های میزبان، به دنبال فعالیت برنامه‌ریزی‌شده و به صورت آبشاری از وقایع، از بین می‌روند. این فعالیت توسط مجموعه‌ای از ژن‌ها کنترل می‌شود [11]. این پدیده در شرایط طبیعی باعث می‌شود سلول‌های پیر، آسیب‌دیده، اضافی و مضر حذف شوند که برای تکامل و ترمیم بافت ضروری است. هرگونه اختلال در روند آپوپتوز، کاهش یا افزایش نامتعارف مرگ سلولی و درنهایت بیماری را موجب می‌شود [12 ،11]. مسیرهای درگیر در تحریک فرایند آپوپتوز را به دو دسته مسیر درونی (میتوکندریایی) و مسیر بیرونی (رسپتورهای مرگ) تقسیم می‌کنند. در شرایط آسیب DNA و اختلالات فاکتورهای رشد، مسیر داخلی (مسیر تحت کنترل پروتئین Bcl2) فعال می‌شود. در صورت کاهش بیان پروتئین Bcl2 در غشای میتوکندری‌ها، تولید و سنتز سیتوکروم‌ها افزایش می‌یابد که به ایجاد تغییر در نفوذپذیری و فعالیت غشای میتوکندری‌ها انجامیده و سیتوکروم‌های c درون سیتوپلاسم آزاد می‌شوند. Caspase-3 به عنوان آخرین فاکتور در فرایند آپوپتوز به شمار می‌رود. این ژن در حقیقت مسئول تخریب پروتئین‌ها در سلول‌های در حال آپوپتوز، شکست DNA در سلول‌ها و حتی فشردگی کروماتین در سلول‌هاست که در ادامه منجر به مرگ سلول خواهد شد. پروتئین P53 یا به عبارتی پروتئین مهار‌کننده توموری به عنوان محافظ یکپارچگی ژنومی در سلول‌های ژرمینال شناخته می‌شود. از میان عملکردهای فراوان پروتئین P53، مهار رشد غیرطبیعی سلول‌ها و آپوپتوز در درجه اول اهمیت قرار دارد [13]. بررسی‌ها در گذشته ثابت کرده‌اند که آسپارتام از طریق افزایش گونه‌های اکسیژن فعال سبب آغاز فرایند آپوپتوز می‌شود [10 ،6].
از آنجایی که شیرین‌کننده‌های مصنوعی همانند آسپارتام، ساخارین و سیکلامات توانسته‌اند با افزایش رادیکال‌های آزاد موجب تغییراتی در دستگاه‌های مختلف بدن شوند و با توجه به گزارش‌های اخیر که اثبات نموده‌اند آسپارتام موجب آسیب‌های بافتی و ایجاد فرایند آپوپتوز در دستگاه تولید‌مثلی نر شده است [10 ،9 ،1]، احتمالاً آسپارتام می‌تواند در دستگاه تولید‌مثلی ماده نیز تغییراتی در ساختار بافتی و عملکردی و نیز بیان ژن‌های دخیل در آپوپتوز ایجاد کند. بنابراین هدف از این مطالعه، بررسی اثرات آسپارتام بر پارامترهای بیوشیمیایی، هیستومورفولوژی، هیستومورفومتری، هیستوشیمی و همچنین بیان ژن‌های P53 ،Bcl-2 و Caspase-3 در تخمدان موش‌های سفید کوچک آزمایشگاهی ماده تیمارشده طی یک دوره 91 روزه بود که تا به حال مورد بررسی قرار نگرفته‌اند.
روش بررسی
حیوانات آزمایشگاهی
برای انجام این پژوهش که به صورت یک کارآزمایی تجربی تصادفی‌شده شاهد‌دار طرح‌ریزی شده بود، 36 سر موش سفید کوچک آزمایشگاهی ماده بالغ از نژاد NMRI با وزن 30-25 گرم از مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران تهیه شد. حیوانات در شرایط استاندارد 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی با دمای 2±25 درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی 10±50 درصد در قفس‌های پلی‌اتیلنی مخصوص نگهداری موش با دسترسی آزاد به آب آشامیدنی نگهداری شدند. تمامی حیوانات به صورت برابر از پلیت‌های مخصوص موش تغذیه می‌کردند. کلیه ضوابط و شرایط نگهداری و انجام آزمایش‌ها روی حیوانات در این مطالعه طبق دستورالعمل‌های مصوب کمیته اخلاق دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران با کد اخلاق 21/6/30029 صورت پذیرفت. قبل از شروع دوره تیمار، به منظور سازگاری با شرایط جدید محیط، حیوانات به مدت دو هفته نگهداری شدند و بعد از نشان‌دار کردن، موش‌های ماده به طور تصادفی به چهار گروه 9 تایی تقسیم شدند و به مدت 91 روز متوالی آسپارتام (A5139-5G, Sigma-Aldrich, Cas No: 22839-47-0) را به صورت خوراکی از طریق گاواژ دریافت کردند.
گروه‌بندی حیوانات
36 سر موش سفید کوچک آزمایشگاهی ماده به صورت تصادفی به چهار گروه 9 تایی به‌ترتیب زیر تقسیم شدند. البته قبل از گروه‌بندی موش‌ها، در ابتدای دوره، برای حصول اطمینان از سالم بودن سیکل جنسی، اسمیر واژینال به مدت چهار روز تهیه و با میکروسکوپ بررسی شد و سپس در صورت سالم بودن موش‌ها توانستند به صورت تصادفی در گروه‌ها قرار بگیرند. در ادامه، موش‌های ماده پس از تعیین وزن اولیه، با محلول ثبوت بوئن نشان‌دار شده و گروه‌بندی انجام شد.
گروه اول) کنترل: حیوانات این گروه به مقدار 5/0 میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی به صورت خوراکی از طریق گاواژ روزانه دریافت کردند.
گروه دوم) آسپارتام 40 میلی‌گرم بر کیلوگرم یا دوز پایین آسپارتام: این گروه آسپارتام را به میزان 40 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به صورت خوراکی از طریق گاواژ روزانه دریافت کردند.
گروه سوم) آسپارتام 80 میلی‌گرم بر کیلوگرم یا دوز متوسط آسپارتام: این گروه آسپارتام را به میزان 80 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به صورت خوراکی از طریق گاواژ روزانه دریافت کردند.
گروه چهارم) آسپارتام 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم یا دوز بالای آسپارتام: این گروه آسپارتام را به میزان 160 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به صورت خوراکی از طریق گاواژ روزانه دریافت کردند.
سرم فیزیولوژی و آسپارتام در همه گروه‌ها به روش خوراکی از طریق گاواژ و به مدت 91 روز و هر 24 ساعت تجویز شد. میزان و دوزهای انتخاب‌شده برای آسپارتام بر اساس مطالعات و پژوهش‌های جدیدی که به تازگی چاپ شده بودند، برگزیده شد [14 ،10].
نمونه‌برداری
یک روز پس از پایان دوره تیمار 91 روزه، موش‌ها دوباره توسط ترازوی دقیق آزمایشگاهی در حد میلی‌گرم توزین شده و کلیه حیوانات موجود در چهار گروه ذکرشده با مخلوط کتامین و زایلازین بیهوش شدند. سپس نمونه‌های خون با وارد کردن سرنگ‌های استریل از خلف زائده مانوبریوم جناغ و از قسمت بطن راست قلب موش‌ها جمع‌آوری و آسان‌کشی شد. نمونه‌های خونی در یخ نگهداری شده با میانگین 5/0 میلی‌لیتری از هر موش، در لوله‌های اپندورف 2 میلی‌لیتری ریخته شده و پس از لخته شدن خون، جهت استحصال سرم، نمونه‌ها با سانتریفوژ یخچال‌دار در 3000 دور به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. نمونه‌های سرم جداشده به لوله‌های اپندورف یک میلی‌لیتری منتقل و تا زمان انجام آزمایش‌های هورمونی و سرمی در دمای 70- درجه نگهداری شدند [9]. در مورد تخمدان‌ها نیز تخمدان راست برای کارهای هیستوشیمی و اکسیدانی و تخمدان چپ برای مطالعات هیستومورفولوژی و هیستومورفومتری به کار گرفته شد. برای مشخص کردن تغییرات وزن بدن، اختلاف میانگین وزن نهایی از میانگین وزن ابتدایی به دست آمد.
ارزیابی‌های بیوشیمیایی هورمونی
اندازه‌گیری سطح هورمون تستوسترون با استفاده از کیت اندازه‌گیری تستوسترون به روش الایزا و ایمونواسی، بر اساس اتصال رقابتی تستوسترون نمونه با تستوسترون کونژوگه طراحی و اجرا شد. نمونه‌های سرمی جهت تعیین ظرفیت آنتی‌اکسیدانت تام سرم (TAC)، با استفاده از روش توانایی پلاسما در احیای یون‌های فریک به فرو (FRAP) که براساس توان احیا‌کنندگی آهن سه‌ظرفیتی است، مورد اندازه‌گیری قرار گرفتند [9]. جهت تعیین پراکسیداسیون چربی‌ها (MAD)، سطح تولید مالون‌دی‌آلدئید (MDA) به عنوان شاخص ارزیابی این فرایند بر اساس واکنش با اسیدتیوباربیتوریک (TBA) ارزیابی شد [9].
بررسی‌های هیستومورفولوژی، هیستومورفومتری و هیستوشیمی
پس از پایان دوره تیمار، اقدام به نمونه‌برداری از موش‌ها شد که بدین منظور بعد از آسان‌کشی موش‌ها و بازکردن محوطه شکمی، تخمدان سمت چپ برای برش‌های پارافینی به مدت 72-48 ساعت در داخل محلول ثبوتی بوئن قرار داده شد و تخمدان سمت راست برای بررسی‌های بیوشیمیایی و هیستوشیمی در داخل ازت مایع قرار گرفت. به منظور تهیه برش‌های پارافینی سریالی، تخمدان‌ها پس از تثبیت، به ترتیب وارد مراحل آبگیری، شفاف‌سازی، آغشتگی با پارافین، قالب‌گیری، برش بافت به صورت سریالی با ضخامت 7-5 میکرومتر و ثابت‌کردن مقاطع بافتی روی لام شده و سپس مراحل رنگ‌آمیزی انجام شد. برای مطالعات هیستولوژی شامل هیستومورفولوژی و هیستومورفومتری، رنگ‌آمیزی معمولی هماتوکسیلین ائوزین مورد استفاده قرار گرفت. در همین راستا جهت مطالعات هیستوشیمی نیز از رنگ‌آمیزی‌های تری‌کروم ماسون و پریودیک اسید شیف (PAS) استفاده شد. مطالعات هیستومورفولوژی شامل بررسی پیوستگی ساختار بافتی از نظر ظاهری، پراکندگی، وسعت، ادم، ازهم‌پاشیدگی و حالات غیر‌نرمال بود. مطالعات هیستومورفومتری نیز بر اساس انواع فولیکول‌های در حال رشد و آترزی‌شده صورت گرفت. بدین‌منظور فولیکول‌ها به دسته‌های آغازین (بدوی)، اولیه، ثانویه، ثالث، گراف، آترزی‌شده و جسم زرد تقسیم‌بندی شدند. رنگ‌آمیزی با پریودیک اسید شیف جهت مشخص‌کردن مواد کربوهیدرات در سیتوپلاسم سلول‌ها استفاده شد و رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون جهت تعیین تراکم رشته‌های همبندی و کلاژن و در راستای آن میزان فیبروزی‌شدن بافت تخمدان مورد مطالعه قرار گرفت [15].
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بی‌درنگ یا کمی (Real-Time PCR)
برای بررسی بیان ژن‌های آپوپتوتیک، ابتدا مقداری از بافت تخمدان به وسیله تیغ جراحی جدا و خرد شد و سپس توسط محلول RNX-Plus شرکت سیناژن، استخراج RNA انجام گرفت. همچنین از کیت RevertAid First Strand cDNA Synthesis شرکت فرمنتاز برای سنتز cDNA استفاده شد. ابتدا مقدار معینی از RNA ژن مربوطه با یک میکرولیتر Oligo dT و یک میکرولیتر پرایمر Random Hexamer ترکیب شده و به حجم ۱۲ میکرولیتر رسید و پس از سانتریفوژ به مدت ۵ دقیقه در دمای ۶۵ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد و محلولی شامل ۴ میکرولیتر 5x Reaction Buffer، یک میکرولیتر Ribolock RNase Inhibitor، 2 میکرولیتر 10Mm dNTP Mix و یک میکرولیتر Reverse M-Mulv به آن اضافه شد و پس از سانتریفوژ به مدت ۵ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد و ۱۲۰ دقیقه در دمای ۴۲ درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. در انتها یک گرمای ۷۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه به محلول وارد شد. برای انجام Real-time PCR از ژن‌های P53، Bcl-2 و Caspase-3 و ژن کنترل داخلی GAPDH استفاده شد. حجم نهایی PCR برای هر ژن ۱۵ میکرولیتر شامل 5/7 میکرولیتر SYBR Green Master Mix، 4/0 میکرولیتر پرایمر F، 4/0 میکرولیتر پرایمر R، ۵ میکرولیتر cDNA و 7/1 میکرولیتر آب عاری از نوکلئاز بود. پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه از شرکت سیناژن تهیه شد که توالی پرایمرهای مورد استفاده در جدول شماره 1 ارائه شده است [17 ،16 ،6]. هر سه ژن بایستی هم‌زمان در دستگاه تکثیر شود، از این جهت بایستی پرایمرها را طوری طراحی کرد که در یک شرایط دمایی و زمانی تکثیر شوند. دستورالعمل حرارتی برای انجام این Real-time PCR به شرح زیر بهینه شد:
دناتوراسیون اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه، ۴۰ سیکل تکثیری شامل مرحله دناتوراسیون در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۵ ثانیه، دمای اتصال برای پرایمرهای P53 ،Bcl-2 ،Caspase-3 و GAPDH به ترتیب 62، 68، 58 و 61 درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۰ ثانیه و درنهایت تکثیر نهایی در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه انجام شد. برای پرایمر Bcl-2 37 سیکل و برای پرایمرهای P53 ،Caspase-3 و GAPDH به ترتیب ۳۵، ۴۰ و ۳۳ سیکل انجام شد. پس از اتمام واکنش تکثیر، برای هر واکنش PCR یک نمودار رسم و سپس بر این اساس CT تعیین شد. بیان نسبی ژن‌های P53 ،Bcl-2 و Caspase-3 در موش‌های گروه‌ها با استفاده از فرمول 2-ΔΔct محاسبه شد.
با توجه به کمی و پیوسته بودن داده‌ها، تعداد گروه‌های مستقل مورد ارزیابی و نیز متعاقب اطمینان از نرمال بودن توزیع داده‌ها توسط آزمون کولموگروف اسمیرنوف، ارزیابی آماری داده‌های این مطالعه با استفاده از بسته نرم‌افزاری SPSS نسخه 19 (SPSS Inc, version 19.00, California, USA) انجام پذیرفت و تمامی نتایج بر اساس میانگین±انحراف‌معیار بیان شدند. جهت مقایسه بین گروه‌ها آنالیز واریانس یک‌طرفه و به دنبال آن تست‌های مقایسه‌ای چندگانه توکی مورد استفاده قرار گرفت. مقدار 05/0>P برای تعیین سطح معنی‌داری بین گروه‌ها در نظر گرفته شد [14].
یافته‌ها
ارزیابی تغییرات وزن بدن
بررسی میانگین تغییرات وزن بدن در گروه‌های مختلف آزمایشی نشان داد در هر سه گروه دریافت‌کننده آسپارتام نسبت به گروه کنترل تغییرات وزنی معنی‌داری (05/0>P) نشد (جدول شماره 2).
بررسی‌های بیوشیمیایی
ارزیابی حاصل از سنجش هورمون تستوسترون
بررسی میزان هورمون تستوسترون در گروه‌های مختلف نشان داد در گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام تغییرات معنی‌داری (05/0>P) در سطح هورمون تستوسترون در مقایسه با گروه کنترل رخ نداده است (جدول شماره 2).
سنجش میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام سرم (TAC)
سنجش میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام سرم در گروه‌های مختلف نشان داد سطح TAC در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نسبت به گروه کنترل دارای کاهش معنی‌داری (05/0>P) بوده است (جدول شماره 2).
سنجش میزان مالون‌دی‌آلدئید (MDA)
بررسی میزان پراکسیداسیون چربی‌ها در حیوانات نشان داد تجویز آسپارتام در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن باعث افزایش معنی‌داری در میزان MDA (05/0>P) در مقایسه با گروه کنترل شده است (جدول شماره 2).
بررسی‌های هیستومورفولوژی
مشاهدات هیستومورفولوژی توسط میکروسکوپ نوری از برش‌های سریالی بافت تخمدان نشان داد دریافت آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن موجب ایجاد نشانه‌هایی از تخریب بافت تخمدان و ایجاد به‌هم‌ریختگی و ازهم‌گسستگی سلول‌های تخمدانی نسبت به گروه‌های دیگر به خصوص گروه کنترل و گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 40 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن شده است. همچنین در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، آسیب‌های هیستومورفولوژی و ظاهری تخمدان مانند دژنراسیون اووسیت، مهاجرت هسته اووسیت و واکوئله شدن در فولیکول‌های ثانویه آترزی‌شده به صورت شدیدتری مشاهده شد. این در حالی است که آسیب‌های هیستومورفولوژی تخمدان در فولیکول‌های ثالث و گراف آترزی‌شده همانند ریزش سلول‌های گرانولوزا، احتقان عروقی و درنهایت پاره شدن دیواره فولیکولی نیز در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نیز نسبت به سایر گروه‌ها بیشتر بود (تصویر شماره 1، رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین ائوزین).
بررسی‌های هیستوشیمیایی
با توجه به نتایج هیستوشیمی رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون در تمامی گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام، مشخص شد که هیچ تفاوتی بین این گروه‌ها و گروه کنترل از نظر میزان رشته‌های کلاژن و در راستای آن فیبروزی شدن بافت تخمدان به‌ویژه در اووسیت‌ها و ضخامت تونیکا آلبوژینا (سپید پرده) وجود ندارد و مقاطع رنگ‌آمیزی‌شده با تری‌کروم ماسون تفاوت چندانی با یکدیگر نشان ندادند (تصویر شماره 1، رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون). بر اساس تحلیل هیستوشیمیایی نمونه‌های بافتی رنگ‌آمیزی‌شده توسط پریودیک اسید شیف، در گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام نیز تفاوتی در واکنش PAS و میزان مواد کربوهیدراته در داخل سیتوپلاسم سلول‌ها به خصوص در سلول اووسیت و ضخامت زونا پلوسیدا (منطقه شفاف) در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نشد (تصویر شماره 1، رنگ‌آمیزی پریودیک اسید شیف).
بررسی‌های هیستومورفومتری
بررسی هیستومورفومتری بافت تخمدان بین گروه‌های آزمایشی دریافت‌کننده آسپارتام و کنترل نشان داد میانگین تعداد فولیکول‌های بدوی، اولیه، ثانویه، ثالث و گراف در گروه دریافت آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نسبت به گروه کنترل دارای کاهش معنی‌داری (05/0>P) بوده است. همچنین این گروه از نظر میانگین تعداد جسم زرد نیز کاهش معنی‌داری (05/0>P) نسبت به گروه کنترل از خود نشان داد. در همین راستا در گروه دریافت آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، پارامتر مربوط به میانگین تعداد فولیکول‌های آترزی‌شده ثانویه، ثالث و گراف دارای افزایش معنی‌داری (05/0>P) از نظر میانگین فولیکول‌های آترزی نسبت به گروه کنترل بود (جدول شماره 3).
ارزیابی سطح بیان ژن
به منظور ارزیابی سطح بیان ژن‌های P53 ،Bcl-2 و Caspase-3 فرایند Real-time PCR برای این ژن‌ها انجام شد. این بررسی نشان داد دریافت طولانی‌مدت آسپارتام در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن موجب افزایش معنی‌داری (05/0>P) در سطح بیان ژن P53 در مقایسه با گروه کنترل شده است (تصویر شماره 2). سطح بیان ژن Caspase-3 تنها در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن دارای افزایش معنی‌داری (05/0>P) در مقایسه با گروه کنترل بود و گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 40 و 80 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن با گروه کنترل فاقد اختلاف معنی‌داری (05/0>P) بودند (تصویر شماره 2). از سوی دیگر در گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام، سطح بیان ژن Bcl-2 تنها در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‌داری (05/0>P) نشان داد (تصویر شماره 2).
بحث
می‌توان چنین بیان کرد که نتایج به‌دست‌آمده در مورد تأثیرات مصرف آسپارتام بر پارامترهای موجود در این مطالعه می‌تواند پیامد متابولیت‌های حاصل از هیدرولیز آسپارتام طی فرایند گوارش و جذب این متابولیت‌ها در بدن باشد [5 ،4]. سمیت ناشی از مصرف خوراکی آسپارتام عمدتاً به متابولیت‌های حاصل از گوارش و جذب روده‌ای این ماده مرتبط است که طی متابولیسم آسپارتام در داخل دستگاه معده‌ای روده‌ای توسط استرازها و پپتیدازها، این ماده به فنیل‌آلانین، اسیدآسپارتیک و متانول هیدرولیز می‌شود [5 ،4]. متانول برای اکثر بافت‌های بدن مخرب بوده و نیز متابولیت‌های حاصل از آن یعنی فرم‌آلدئید و اسیدفرمیک نیز موجب سمیت در بیشتر سلول‌ها و بافت‌های بدن می‌شوند [5]. متانول از طریق سیاهرگ باب وارد کبد شده و توسط آنزیم الکل‌دهیدروژناز به فرم‌آلدئید اکسید می‌شود که این ماده موجب سمیت در اکثر سلول‌ها و بافت‌های بدن می‌شود [5]. مقدار نسبتاً کمی آسپارتام قادر است به طور قابل توجهی باعث افزایش سطح متانول در خون شود که گفته می‌شود متابولیسم متانول به فرم‌آلدئید و اسیدفرمیک، با تشکیل آنیون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن همراه است [6]. آنیون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن باعث آسیب به غشای میتوکندریایی شده و با بیش‌تولید گونه‌های فعال اکسیژن موجب ایجاد استرس اکسیداتیو و القای آپوپتوز می‌شود [7 ،6].
مشخص شده است که مصرف آسپارتام به روش خوراکی بر کاهش وزن در انسان تأثیر دارد و این کاهش وزن به این دلیل است که آسپارتام باعث کاهش نوروپپتید Y مغزی می‌شود که نقش بسیار حیاتی در متابولیسم و سوخت و ساز بدن دارد [18]. همچنین در بررسی دیگری مشخص شده است که مصرف خوراکی آسپارتام روزانه به میزان 14 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن در طی دوره ارگانوژنز موش صحرایی، باعث کاهش وزن بدن جنین و نیز کاهش وزن جفت می‌شود [19]. در برخی دیگر از مطالعات بیان شده است که آسپارتام یک آنزیم روده‌ای بنام آلکالین‌فسفاتاز روده‌ای (IAP) را مهار می‌کند که این آنزیم می‌تواند از بروز چاقی، دیابت نوع 2 و سندرم متابولیک جلوگیری کند. یافته‌های این آزمایشات نشان داد موش‌هایی که از آب حاوی آسپارتام استفاده می‌کردند در مقایسه با موش‌هایی که از آب بدون آسپارتام استفاده می‌کردند، دچار اضافه‌وزن بیشتری شدند [20]. همچنین در تحقیق دیگری بیان شده است که آسپارتام مسیر تشخیص مصرف ماده غذایی را در مغز غیرفعال می‌کند که در این راستا با انجام ام‌آر‌آی‌های عملکردی مغز نشان داده شده که سرکوب اشتها به دلیل مصرف آسپارتام اتفاق نمی‌افتد و به همین دلیل به دنبال آن پیغام سیری به مغز ارسال نشده و درنتیجه فرد همچنان به خوردن غذا ادامه میدهد [21]. در این مطالعه مشخص شد که آسپارتام موجب تغییرات وزن بدن در گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام نمی‌شود که با نتایج تحقیقات اشاره‌شده هم‌خوانی ندارد.
به منظور دست‌یابی به بینشی جهت درک بهتر تعادل بین اکسیدان / آنتی‌اکسیدان در محیط داخلی بدن، اندازه‌گیری میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام و مالون‌دی‌آلدئید می‌تواند بسیار کاربردی باشد [15]. ارتباط بین آنزیم‌های دخیل در پاکسازی گونه‌های فعال اکسیژن با یکدیگر باعث حفاظت از بافت‌ها و سلول‌های بدن در برابر اثرات مخرب اکسیدان‌ها می‌شود. بنابراین حتی تغییرات بسیار اندک در میزان طبیعی آنزیم‌های ذکرشده می‌تواند منجر به تخریب مولکول‌های زیستی در برابر آسیب‌های اکسیداتیو و همچنین اختلال در سیستم‌های دفاعی بدن شود [15]. طی این مطالعه آسپارتام ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام را در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن کاهش داده بود که این نتایج توسط گزارشات مختلف قبلی حمایت می‌شوند [15 ،10 ،7]. در این مطالعه آسپارتام میزان مالون‌دی‌آلدئید را در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن افزایش داد. گزارشات پیشین افزایش سطح مالون‌دی‌آلدئید را در موش‌های دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 80 و 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نشان داده‌اند [15 ،10] که با نتایج حاصل از گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن در این مطالعه همسو بوده، ولی با سایر گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام همسو نیست.
افزایش مقادیر تستوسترون خون در بسیاری از بیماری‌های تخمدانی مانند سندرم تخمدان پلی‌سیستیک اتفاق می‌افتد. در ضمن افزایش تستوسترون باعث کاهش فعالیت آنتی‌اکسیدانت‌های آنزیمی و غیرآنزیمی می‌شود. مطالعه بالینی در زنان دچار سندرم تخمدان پلی‌سیستیک نشان داده که در زنان با تستوسترون بالا، استرس اکسیداتیو نیز افزایش یافته است [22]. به نظر می‌رسد گنادوتروپین و استروژن، فاکتورهای بقا برای سلول‌های فولیکولی هستند. در حالی که تستوسترون آپوپتوز فولیکول‌ها را در موش افزایش میدهد. بر اساس شواهد موجود، فولیکول‌هایی که نسبت آندروژن به استروژن بالایی دارند، در مقایسه با فولیکول‌هایی که این نسبت در آن‌ها پایین‌تر است، به آپوپتوز حساس‌تر هستند. استروژن موجب رشد فولیکول‌ها می‌شود، ولی تستوسترون آترزی فولیکول‌ها را القا می‌کند [23]. در این مطالعه، سطح هورمون تستوسترون در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نسبت به گروه کنترل افزایش یافته بود، ولی این افزایش از نظر آماری معنی‌دار نبود.
مشاهدات هیستومورفولوژی توسط میکروسکوپ الکترونی و نوری در پژوهش‌های پیشین نشان می‌دهند که قرار گرفتن در معرض آسپارتام و متابولیت‌های حاصل از آن مانند فرم‌آلدئید موجب تغییر ساختار بافتی تخمدان از قبیل به‌هم‌ریختگی سلول‌های بینابینی بین فولیکول‌های در حال رشد، دژنراسیون اووسیت، ریزش و پیکنوزه شدن هسته سلول‌های گرانولوزا می‌شود [25 ،24]. همچنین در مطالعه دیگری بیان شده است که فرم‌آلدئید موجب احتقان عروقی و ادم بینابینی در تخمدان می‌شود که این نتایج با یافته‌های این مطالعه در موش‌های دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن کاملاً مطابقت دارد [26]. مطالعات هیستومورفومتریک پیشین اثبات کرده‌اند که قرار گرفتن در معرض فرم‌آلدئید موجب کاهش اندازه و تعداد انواع فولیکول‌های در حال رشد (فولیکول‌های بدوی، اولیه، ثانویه، ثالث و گراف) و جسم زرد نسبت به گروه کنترل شده است، در حالی که تعداد فولیکول‌های آترزی‌شده نسبت به گروه کنترل به وضوح افزایش یافته بود که با نتایج گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن در مطالعه حاضر هم‌خوانی دارد [27-25].
در شرایطی که چرخه متابولیکی دچار اختلال می‌شود متعاقباً متابولیسم سلولی نیز تغییر می‌کند. در این شرایط، سلول‌ها از دیگر منابع غذایی موجود در محیط برای سوخت و ساز استفاده می‌کنند. نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی پریودیک اسید شیف در این مطالعه نشان داد در بافت تخمدان موش‌های دریافت‌کننده آسپارتام، واکنش پریودیک اسید شیف (ذرات کربوهیدرات) در سلول‌های اووسیت و ضخامت منطقه شفاف تفاوتی با گروه کنترل نداشت. این نتایج حاکی از عدم اختلال در سوخت و ساز سلول‌های بافت تخمدان تحت تأثیر دریافت آسپارتام بود که با پژوهش‌های دیگری در این زمینه که در آن فرم‌آلدئید موجب افزایش واکنش پریودیک اسید شیف در منطقه شفاف شده بود، همسو نیست [27]. همچنین رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون در مطالعه حاضر نشان داد میزان رشته‌های کلاژن در اووسیت و ضخامت تونیکا آلبوژینا در گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام تغییر قابل مشاهده‌ای در مقایسه با گروه کنترل نشان نداد. این در حالی است که یافته‌های مطالعات قبلی نیز نشان می‌دهند مصرف آسپارتام موجب تغییر در میزان رشته‌های کلاژن در بافت‌های موش سفید کوچک آزمایشگاهی نشده است [15].
استرس اکسیداتیو نقشی کلیدی در ایجاد و توسعه آپوپتوز بافتی ایفا می‌کند. بر اساس وضعیت سرکوب آنتی‌اکسیدانی در حیوانات مواجهه‌یافته با آسپارتام و در نظر گرفتن آپوپتوز حاصل از استرس اکسیداتیو می‌توان استنباط کرد که افزایش آپوپتوز در گروه مواجهه‌یافته با آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، ممکن است مربوط به تولید استرس اکسیداتیو به دنبال اکسیداسیون متانول باشد [10 ،6]. در طول اکسیداسیون متانول رادیکال‌های آزاد تولید و منجر به آسیب به ساختار ماکرومولکول‌های سلول می‌شوند [10]. در راستای یافته‌های ما در کاهش بیان ژنی Bcl-2 و افزایش بیان ژنی P53 و Caspase-3 در تخمدان نشان داده شد این فاکتورها در روند آپوپتوز نقش دارند. P53 یکی از عوامل مهم در فرایند آپوپتوز بوده و به دنبال آسیب DNA باعث رونویسی پروتئین‌های پیش‌آپوپتوزی می‌شود [10]. Bcl-2 یک میانجی ضدآپوپتوزی است که مانع آزاد شدن سیتوکروم c از میتوکندری‌ها به سیتوزول شده و فعالیت پروتئازهای کاسپاز را کنترل می‌کند [10]. Caspase-3 اجرایی‌ترین آنزیم کلیدی است که تغییرات هیستومورفولوژیک سلولی را طی آپوپتوز تعدیل می‌نماید [10]. بنابراین مصرف طولانی‌مدت آسپارتام منجر به ایجاد آپوپتوز توسط کاهش بیان میانجی ضدآپوپتوزی و افزایش بیان میانجی‌های آپوپتوزی شده است. همسو با مطالعه ما، محققین دیگری نیز کاهش بیان میانجی‌های ضدآپوپتوزی و افزایش بیان میانجی‌های آپوپتوزی را در اندام‌های مختلف حیوانات تجربی مورد آزمایش، متعاقب مصرف طولانی‌مدت آسپارتام گزارش کرده‌اند [30-28 ،10 ،6].
نتیجه‌گیری
با جمع‌بندی یافته‌های مطالعه حاضر چنین برمی‌آید که مصرف آسپارتام در دوز بالا طی یک دوره طولانی، به واسطه افزایش تولید رادیکال‌های آزاد، پی‌ریزی تنش‌های اکسیداتیو و نیز تضعیف دستگاه دفاع آنتی‌اکسیدانی بدن، موجبات اختلالات مربوط به پارامترهای هیستومورفولوژی، هیستومورفومتری، بیوشیمیایی و تغییرات هیستوشیمیایی را در موش‌های دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن فراهم می‌آورد که به نوبه خود قادر هستند عملکرد فیزیولوژیک سیستم تولیدمثل ماده را دچار اختلال نمایند. مضافاً اینکه دریافت آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن قادر است به واسطه اعمال استرس اکسیداتیو موجب کاهش میزان بیان ژن‌های Bcl-2 و در عین حال افزایش میزان بیان ژن‌های P53 و Caspase-3 شود که از جمله ژن‌های دخیل در فرایند مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول بوده و سبب القای آپوپتوز می‌شوند. در حالی که نتایج گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 80 و 40 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن تفاوت قابل توجهی در مقایسه با نتایج گروه کنترل نداشت و آسیب‌های مشاهده‌شده در گروه مذکور دیگر را از خود نشان نداد. با این وجود، تأیید مضرات و توکسیک بودن آسپارتام در سایر بخش‌های دستگاه تولید‌مثلی ماده، نیازمند طرح‌ریزی مطالعات تجربی گسترده‌تر و نیز کارآزمایی‌های بالینی است.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کلیه ضوابط و شرایط نگهداری و انجام آزمایش‌ها روی حیوانات در این مطالعه طبق دستورالعمل‌های مصوب کمیته اخلاق دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران با کد اخلاق 21/6/30029 صورت پذیرفت.
حامی مالی
این تحقیق هیچ‌گونه کمک مالی از سازمان‌های تأمین مالی در بخش‌های عمومی، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
تمامی نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش تمام بخش‌های پژوهش حاضر مشارکت یکسان داشته‌اند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم می‌دانند مراتب تشکر و قدردانی خود را از معاونت پژوهشی دانشگاه تهران به سبب حمایت‌هایشان از این مطالعه اعلام دارند.
آسپارتام از جمله افزودنی‌های مواد غذایی و از گروه شیرین‌کننده‌ها بوده و پودری بی‌بو، شدیداً شیرین، سفیدرنگ و بلورین است که در ترکیب غذاهای رژیمی کم‌کالری و بدون قند به فراوانی وجود دارد [2 ،1]. آسپارتام در میان افراد مبتلا به دیابت و اضافه‌وزن طرفداران بسیاری دارد، از این‌رو معروف‌ترین و پرمصرف‌ترین شیرین‌کننده مصنوعی لقب گرفته است [2 ،1]. آسپارتام دی‌پپتیدی حاصل از ترکیب دو اسیدآمینه اسیدآسپارتیک و فنیل‌آلانین است که در مقادیر یکسان با ساکاروز (قند طبیعی)، میزان کالری مشابهی (4 کیلوکالری بر گرم) را تولید می‌کند، ولی شدت شیرین‌کنندگی آن حدود 200 برابر بیشتر از ساکارز است [3]. آسپارتام در داخل دستگاه معده‌ای روده‌ای توسط استرازها و پپتیدازها به تقریباً 50 درصد فنیل‌آلانین، 40 درصد اسیدآسپارتیک و 10 درصد متانول هیدرولیز می‌شود [4 ،2].
متانول و متابولیت‌های حاصل از آن یعنی فرم‌آلدئید و اسیدفرمیک که نتیجه متابولیسم اصلی متانول هستند با وارد شدن به گردش سیاهرگی باب و سپس اکسیده شدن متانول در کبد، موجب سمیت در اکثر سلول‌ها و بافت‌های بدن می‌شوند [5]. متابولیسم متانول به فرم‌آلدئید و اسیدفرمیک، به سلول‌های کبدی آسیب وارد کرده و با افزایش سطح NADH و تشکیل آنیون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن همراه است که ممکن است در پراکسیداسیون لیپیدی مؤثر باشد [6]. قرار گرفتن در معرض متانول به عنوان یک محصول جانبی آسپارتام، باعث آسیب به غشای میتوکندریایی شده و منجر به بیش‌تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و ایجاد استرس اکسیداتیو، القای شکستگی در DNA، غیرفعال شدن پروتئین‌ها و آپوپتوز می‌شود [7 ،2]. به تازگی، بسیاری از مطالعات تجربی تأیید کرده‌اند که آسپارتام موجب افزایش خطر ابتلا به لنفوم، لوسمی، آسیب دستگاه تناسلی و ادراری، آسیب دستگاه عصبی مرکزی و ایجاد فرایند آپوپتوز می‌شود [10-8].
آپوپتوز یا مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی، فرایند فیزیولوژیکی است که نقشی کلیدی در حفظ هومئوستاز بافت‌های بالغ و نیز تنظیم تکامل سیستم ایمنی در جریان رشد و تومورزایی ایفا می‌کند. آپوپتوز نوعی مرگ سلولی است که در آن سلول‌های میزبان، به دنبال فعالیت برنامه‌ریزی‌شده و به صورت آبشاری از وقایع، از بین می‌روند. این فعالیت توسط مجموعه‌ای از ژن‌ها کنترل می‌شود [11]. این پدیده در شرایط طبیعی باعث می‌شود سلول‌های پیر، آسیب‌دیده، اضافی و مضر حذف شوند که برای تکامل و ترمیم بافت ضروری است. هرگونه اختلال در روند آپوپتوز، کاهش یا افزایش نامتعارف مرگ سلولی و درنهایت بیماری را موجب می‌شود [12 ،11]. مسیرهای درگیر در تحریک فرایند آپوپتوز را به دو دسته مسیر درونی (میتوکندریایی) و مسیر بیرونی (رسپتورهای مرگ) تقسیم می‌کنند. در شرایط آسیب DNA و اختلالات فاکتورهای رشد، مسیر داخلی (مسیر تحت کنترل پروتئین Bcl2) فعال می‌شود. در صورت کاهش بیان پروتئین Bcl2 در غشای میتوکندری‌ها، تولید و سنتز سیتوکروم‌ها افزایش می‌یابد که به ایجاد تغییر در نفوذپذیری و فعالیت غشای میتوکندری‌ها انجامیده و سیتوکروم‌های c درون سیتوپلاسم آزاد می‌شوند. Caspase-3 به عنوان آخرین فاکتور در فرایند آپوپتوز به شمار می‌رود. این ژن در حقیقت مسئول تخریب پروتئین‌ها در سلول‌های در حال آپوپتوز، شکست DNA در سلول‌ها و حتی فشردگی کروماتین در سلول‌هاست که در ادامه منجر به مرگ سلول خواهد شد. پروتئین P53 یا به عبارتی پروتئین مهار‌کننده توموری به عنوان محافظ یکپارچگی ژنومی در سلول‌های ژرمینال شناخته می‌شود. از میان عملکردهای فراوان پروتئین P53، مهار رشد غیرطبیعی سلول‌ها و آپوپتوز در درجه اول اهمیت قرار دارد [13]. بررسی‌ها در گذشته ثابت کرده‌اند که آسپارتام از طریق افزایش گونه‌های اکسیژن فعال سبب آغاز فرایند آپوپتوز می‌شود [10 ،6].
از آنجایی که شیرین‌کننده‌های مصنوعی همانند آسپارتام، ساخارین و سیکلامات توانسته‌اند با افزایش رادیکال‌های آزاد موجب تغییراتی در دستگاه‌های مختلف بدن شوند و با توجه به گزارش‌های اخیر که اثبات نموده‌اند آسپارتام موجب آسیب‌های بافتی و ایجاد فرایند آپوپتوز در دستگاه تولید‌مثلی نر شده است [10 ،9 ،1]، احتمالاً آسپارتام می‌تواند در دستگاه تولید‌مثلی ماده نیز تغییراتی در ساختار بافتی و عملکردی و نیز بیان ژن‌های دخیل در آپوپتوز ایجاد کند. بنابراین هدف از این مطالعه، بررسی اثرات آسپارتام بر پارامترهای بیوشیمیایی، هیستومورفولوژی، هیستومورفومتری، هیستوشیمی و همچنین بیان ژن‌های P53 ،Bcl-2 و Caspase-3 در تخمدان موش‌های سفید کوچک آزمایشگاهی ماده تیمارشده طی یک دوره 91 روزه بود که تا به حال مورد بررسی قرار نگرفته‌اند.
روش بررسی
حیوانات آزمایشگاهی
برای انجام این پژوهش که به صورت یک کارآزمایی تجربی تصادفی‌شده شاهد‌دار طرح‌ریزی شده بود، 36 سر موش سفید کوچک آزمایشگاهی ماده بالغ از نژاد NMRI با وزن 30-25 گرم از مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران تهیه شد. حیوانات در شرایط استاندارد 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی با دمای 2±25 درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی 10±50 درصد در قفس‌های پلی‌اتیلنی مخصوص نگهداری موش با دسترسی آزاد به آب آشامیدنی نگهداری شدند. تمامی حیوانات به صورت برابر از پلیت‌های مخصوص موش تغذیه می‌کردند. کلیه ضوابط و شرایط نگهداری و انجام آزمایش‌ها روی حیوانات در این مطالعه طبق دستورالعمل‌های مصوب کمیته اخلاق دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران با کد اخلاق 21/6/30029 صورت پذیرفت. قبل از شروع دوره تیمار، به منظور سازگاری با شرایط جدید محیط، حیوانات به مدت دو هفته نگهداری شدند و بعد از نشان‌دار کردن، موش‌های ماده به طور تصادفی به چهار گروه 9 تایی تقسیم شدند و به مدت 91 روز متوالی آسپارتام (A5139-5G, Sigma-Aldrich, Cas No: 22839-47-0) را به صورت خوراکی از طریق گاواژ دریافت کردند.
گروه‌بندی حیوانات
36 سر موش سفید کوچک آزمایشگاهی ماده به صورت تصادفی به چهار گروه 9 تایی به‌ترتیب زیر تقسیم شدند. البته قبل از گروه‌بندی موش‌ها، در ابتدای دوره، برای حصول اطمینان از سالم بودن سیکل جنسی، اسمیر واژینال به مدت چهار روز تهیه و با میکروسکوپ بررسی شد و سپس در صورت سالم بودن موش‌ها توانستند به صورت تصادفی در گروه‌ها قرار بگیرند. در ادامه، موش‌های ماده پس از تعیین وزن اولیه، با محلول ثبوت بوئن نشان‌دار شده و گروه‌بندی انجام شد.
گروه اول) کنترل: حیوانات این گروه به مقدار 5/0 میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی به صورت خوراکی از طریق گاواژ روزانه دریافت کردند.
گروه دوم) آسپارتام 40 میلی‌گرم بر کیلوگرم یا دوز پایین آسپارتام: این گروه آسپارتام را به میزان 40 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به صورت خوراکی از طریق گاواژ روزانه دریافت کردند.
گروه سوم) آسپارتام 80 میلی‌گرم بر کیلوگرم یا دوز متوسط آسپارتام: این گروه آسپارتام را به میزان 80 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به صورت خوراکی از طریق گاواژ روزانه دریافت کردند.
گروه چهارم) آسپارتام 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم یا دوز بالای آسپارتام: این گروه آسپارتام را به میزان 160 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به صورت خوراکی از طریق گاواژ روزانه دریافت کردند.
سرم فیزیولوژی و آسپارتام در همه گروه‌ها به روش خوراکی از طریق گاواژ و به مدت 91 روز و هر 24 ساعت تجویز شد. میزان و دوزهای انتخاب‌شده برای آسپارتام بر اساس مطالعات و پژوهش‌های جدیدی که به تازگی چاپ شده بودند، برگزیده شد [14 ،10].
نمونه‌برداری
یک روز پس از پایان دوره تیمار 91 روزه، موش‌ها دوباره توسط ترازوی دقیق آزمایشگاهی در حد میلی‌گرم توزین شده و کلیه حیوانات موجود در چهار گروه ذکرشده با مخلوط کتامین و زایلازین بیهوش شدند. سپس نمونه‌های خون با وارد کردن سرنگ‌های استریل از خلف زائده مانوبریوم جناغ و از قسمت بطن راست قلب موش‌ها جمع‌آوری و آسان‌کشی شد. نمونه‌های خونی در یخ نگهداری شده با میانگین 5/0 میلی‌لیتری از هر موش، در لوله‌های اپندورف 2 میلی‌لیتری ریخته شده و پس از لخته شدن خون، جهت استحصال سرم، نمونه‌ها با سانتریفوژ یخچال‌دار در 3000 دور به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. نمونه‌های سرم جداشده به لوله‌های اپندورف یک میلی‌لیتری منتقل و تا زمان انجام آزمایش‌های هورمونی و سرمی در دمای 70- درجه نگهداری شدند [9]. در مورد تخمدان‌ها نیز تخمدان راست برای کارهای هیستوشیمی و اکسیدانی و تخمدان چپ برای مطالعات هیستومورفولوژی و هیستومورفومتری به کار گرفته شد. برای مشخص کردن تغییرات وزن بدن، اختلاف میانگین وزن نهایی از میانگین وزن ابتدایی به دست آمد.
ارزیابی‌های بیوشیمیایی هورمونی
اندازه‌گیری سطح هورمون تستوسترون با استفاده از کیت اندازه‌گیری تستوسترون به روش الایزا و ایمونواسی، بر اساس اتصال رقابتی تستوسترون نمونه با تستوسترون کونژوگه طراحی و اجرا شد. نمونه‌های سرمی جهت تعیین ظرفیت آنتی‌اکسیدانت تام سرم (TAC)، با استفاده از روش توانایی پلاسما در احیای یون‌های فریک به فرو (FRAP) که براساس توان احیا‌کنندگی آهن سه‌ظرفیتی است، مورد اندازه‌گیری قرار گرفتند [9]. جهت تعیین پراکسیداسیون چربی‌ها (MAD)، سطح تولید مالون‌دی‌آلدئید (MDA) به عنوان شاخص ارزیابی این فرایند بر اساس واکنش با اسیدتیوباربیتوریک (TBA) ارزیابی شد [9].
بررسی‌های هیستومورفولوژی، هیستومورفومتری و هیستوشیمی
پس از پایان دوره تیمار، اقدام به نمونه‌برداری از موش‌ها شد که بدین منظور بعد از آسان‌کشی موش‌ها و بازکردن محوطه شکمی، تخمدان سمت چپ برای برش‌های پارافینی به مدت 72-48 ساعت در داخل محلول ثبوتی بوئن قرار داده شد و تخمدان سمت راست برای بررسی‌های بیوشیمیایی و هیستوشیمی در داخل ازت مایع قرار گرفت. به منظور تهیه برش‌های پارافینی سریالی، تخمدان‌ها پس از تثبیت، به ترتیب وارد مراحل آبگیری، شفاف‌سازی، آغشتگی با پارافین، قالب‌گیری، برش بافت به صورت سریالی با ضخامت 7-5 میکرومتر و ثابت‌کردن مقاطع بافتی روی لام شده و سپس مراحل رنگ‌آمیزی انجام شد. برای مطالعات هیستولوژی شامل هیستومورفولوژی و هیستومورفومتری، رنگ‌آمیزی معمولی هماتوکسیلین ائوزین مورد استفاده قرار گرفت. در همین راستا جهت مطالعات هیستوشیمی نیز از رنگ‌آمیزی‌های تری‌کروم ماسون و پریودیک اسید شیف (PAS) استفاده شد. مطالعات هیستومورفولوژی شامل بررسی پیوستگی ساختار بافتی از نظر ظاهری، پراکندگی، وسعت، ادم، ازهم‌پاشیدگی و حالات غیر‌نرمال بود. مطالعات هیستومورفومتری نیز بر اساس انواع فولیکول‌های در حال رشد و آترزی‌شده صورت گرفت. بدین‌منظور فولیکول‌ها به دسته‌های آغازین (بدوی)، اولیه، ثانویه، ثالث، گراف، آترزی‌شده و جسم زرد تقسیم‌بندی شدند. رنگ‌آمیزی با پریودیک اسید شیف جهت مشخص‌کردن مواد کربوهیدرات در سیتوپلاسم سلول‌ها استفاده شد و رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون جهت تعیین تراکم رشته‌های همبندی و کلاژن و در راستای آن میزان فیبروزی‌شدن بافت تخمدان مورد مطالعه قرار گرفت [15].
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بی‌درنگ یا کمی (Real-Time PCR)
برای بررسی بیان ژن‌های آپوپتوتیک، ابتدا مقداری از بافت تخمدان به وسیله تیغ جراحی جدا و خرد شد و سپس توسط محلول RNX-Plus شرکت سیناژن، استخراج RNA انجام گرفت. همچنین از کیت RevertAid First Strand cDNA Synthesis شرکت فرمنتاز برای سنتز cDNA استفاده شد. ابتدا مقدار معینی از RNA ژن مربوطه با یک میکرولیتر Oligo dT و یک میکرولیتر پرایمر Random Hexamer ترکیب شده و به حجم ۱۲ میکرولیتر رسید و پس از سانتریفوژ به مدت ۵ دقیقه در دمای ۶۵ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد و محلولی شامل ۴ میکرولیتر 5x Reaction Buffer، یک میکرولیتر Ribolock RNase Inhibitor، 2 میکرولیتر 10Mm dNTP Mix و یک میکرولیتر Reverse M-Mulv به آن اضافه شد و پس از سانتریفوژ به مدت ۵ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد و ۱۲۰ دقیقه در دمای ۴۲ درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. در انتها یک گرمای ۷۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه به محلول وارد شد. برای انجام Real-time PCR از ژن‌های P53، Bcl-2 و Caspase-3 و ژن کنترل داخلی GAPDH استفاده شد. حجم نهایی PCR برای هر ژن ۱۵ میکرولیتر شامل 5/7 میکرولیتر SYBR Green Master Mix، 4/0 میکرولیتر پرایمر F، 4/0 میکرولیتر پرایمر R، ۵ میکرولیتر cDNA و 7/1 میکرولیتر آب عاری از نوکلئاز بود. پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه از شرکت سیناژن تهیه شد که توالی پرایمرهای مورد استفاده در جدول شماره 1 ارائه شده است [17 ،16 ،6]. هر سه ژن بایستی هم‌زمان در دستگاه تکثیر شود، از این جهت بایستی پرایمرها را طوری طراحی کرد که در یک شرایط دمایی و زمانی تکثیر شوند. دستورالعمل حرارتی برای انجام این Real-time PCR به شرح زیر بهینه شد:
دناتوراسیون اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه، ۴۰ سیکل تکثیری شامل مرحله دناتوراسیون در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۵ ثانیه، دمای اتصال برای پرایمرهای P53 ،Bcl-2 ،Caspase-3 و GAPDH به ترتیب 62، 68، 58 و 61 درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۰ ثانیه و درنهایت تکثیر نهایی در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه انجام شد. برای پرایمر Bcl-2 37 سیکل و برای پرایمرهای P53 ،Caspase-3 و GAPDH به ترتیب ۳۵، ۴۰ و ۳۳ سیکل انجام شد. پس از اتمام واکنش تکثیر، برای هر واکنش PCR یک نمودار رسم و سپس بر این اساس CT تعیین شد. بیان نسبی ژن‌های P53 ،Bcl-2 و Caspase-3 در موش‌های گروه‌ها با استفاده از فرمول 2-ΔΔct محاسبه شد.
با توجه به کمی و پیوسته بودن داده‌ها، تعداد گروه‌های مستقل مورد ارزیابی و نیز متعاقب اطمینان از نرمال بودن توزیع داده‌ها توسط آزمون کولموگروف اسمیرنوف، ارزیابی آماری داده‌های این مطالعه با استفاده از بسته نرم‌افزاری SPSS نسخه 19 (SPSS Inc, version 19.00, California, USA) انجام پذیرفت و تمامی نتایج بر اساس میانگین±انحراف‌معیار بیان شدند. جهت مقایسه بین گروه‌ها آنالیز واریانس یک‌طرفه و به دنبال آن تست‌های مقایسه‌ای چندگانه توکی مورد استفاده قرار گرفت. مقدار 05/0>P برای تعیین سطح معنی‌داری بین گروه‌ها در نظر گرفته شد [14].
یافته‌ها
ارزیابی تغییرات وزن بدن
بررسی میانگین تغییرات وزن بدن در گروه‌های مختلف آزمایشی نشان داد در هر سه گروه دریافت‌کننده آسپارتام نسبت به گروه کنترل تغییرات وزنی معنی‌داری (05/0>P) نشد (جدول شماره 2).
بررسی‌های بیوشیمیایی
ارزیابی حاصل از سنجش هورمون تستوسترون
بررسی میزان هورمون تستوسترون در گروه‌های مختلف نشان داد در گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام تغییرات معنی‌داری (05/0>P) در سطح هورمون تستوسترون در مقایسه با گروه کنترل رخ نداده است (جدول شماره 2).
سنجش میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام سرم (TAC)
سنجش میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام سرم در گروه‌های مختلف نشان داد سطح TAC در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نسبت به گروه کنترل دارای کاهش معنی‌داری (05/0>P) بوده است (جدول شماره 2).
سنجش میزان مالون‌دی‌آلدئید (MDA)
بررسی میزان پراکسیداسیون چربی‌ها در حیوانات نشان داد تجویز آسپارتام در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن باعث افزایش معنی‌داری در میزان MDA (05/0>P) در مقایسه با گروه کنترل شده است (جدول شماره 2).
بررسی‌های هیستومورفولوژی
مشاهدات هیستومورفولوژی توسط میکروسکوپ نوری از برش‌های سریالی بافت تخمدان نشان داد دریافت آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن موجب ایجاد نشانه‌هایی از تخریب بافت تخمدان و ایجاد به‌هم‌ریختگی و ازهم‌گسستگی سلول‌های تخمدانی نسبت به گروه‌های دیگر به خصوص گروه کنترل و گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 40 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن شده است. همچنین در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، آسیب‌های هیستومورفولوژی و ظاهری تخمدان مانند دژنراسیون اووسیت، مهاجرت هسته اووسیت و واکوئله شدن در فولیکول‌های ثانویه آترزی‌شده به صورت شدیدتری مشاهده شد. این در حالی است که آسیب‌های هیستومورفولوژی تخمدان در فولیکول‌های ثالث و گراف آترزی‌شده همانند ریزش سلول‌های گرانولوزا، احتقان عروقی و درنهایت پاره شدن دیواره فولیکولی نیز در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نیز نسبت به سایر گروه‌ها بیشتر بود (تصویر شماره 1، رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین ائوزین).
بررسی‌های هیستوشیمیایی
با توجه به نتایج هیستوشیمی رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون در تمامی گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام، مشخص شد که هیچ تفاوتی بین این گروه‌ها و گروه کنترل از نظر میزان رشته‌های کلاژن و در راستای آن فیبروزی شدن بافت تخمدان به‌ویژه در اووسیت‌ها و ضخامت تونیکا آلبوژینا (سپید پرده) وجود ندارد و مقاطع رنگ‌آمیزی‌شده با تری‌کروم ماسون تفاوت چندانی با یکدیگر نشان ندادند (تصویر شماره 1، رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون). بر اساس تحلیل هیستوشیمیایی نمونه‌های بافتی رنگ‌آمیزی‌شده توسط پریودیک اسید شیف، در گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام نیز تفاوتی در واکنش PAS و میزان مواد کربوهیدراته در داخل سیتوپلاسم سلول‌ها به خصوص در سلول اووسیت و ضخامت زونا پلوسیدا (منطقه شفاف) در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نشد (تصویر شماره 1، رنگ‌آمیزی پریودیک اسید شیف).
بررسی‌های هیستومورفومتری
بررسی هیستومورفومتری بافت تخمدان بین گروه‌های آزمایشی دریافت‌کننده آسپارتام و کنترل نشان داد میانگین تعداد فولیکول‌های بدوی، اولیه، ثانویه، ثالث و گراف در گروه دریافت آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نسبت به گروه کنترل دارای کاهش معنی‌داری (05/0>P) بوده است. همچنین این گروه از نظر میانگین تعداد جسم زرد نیز کاهش معنی‌داری (05/0>P) نسبت به گروه کنترل از خود نشان داد. در همین راستا در گروه دریافت آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، پارامتر مربوط به میانگین تعداد فولیکول‌های آترزی‌شده ثانویه، ثالث و گراف دارای افزایش معنی‌داری (05/0>P) از نظر میانگین فولیکول‌های آترزی نسبت به گروه کنترل بود (جدول شماره 3).
ارزیابی سطح بیان ژن
به منظور ارزیابی سطح بیان ژن‌های P53 ،Bcl-2 و Caspase-3 فرایند Real-time PCR برای این ژن‌ها انجام شد. این بررسی نشان داد دریافت طولانی‌مدت آسپارتام در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن موجب افزایش معنی‌داری (05/0>P) در سطح بیان ژن P53 در مقایسه با گروه کنترل شده است (تصویر شماره 2). سطح بیان ژن Caspase-3 تنها در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن دارای افزایش معنی‌داری (05/0>P) در مقایسه با گروه کنترل بود و گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 40 و 80 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن با گروه کنترل فاقد اختلاف معنی‌داری (05/0>P) بودند (تصویر شماره 2). از سوی دیگر در گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام، سطح بیان ژن Bcl-2 تنها در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‌داری (05/0>P) نشان داد (تصویر شماره 2).
بحث
می‌توان چنین بیان کرد که نتایج به‌دست‌آمده در مورد تأثیرات مصرف آسپارتام بر پارامترهای موجود در این مطالعه می‌تواند پیامد متابولیت‌های حاصل از هیدرولیز آسپارتام طی فرایند گوارش و جذب این متابولیت‌ها در بدن باشد [5 ،4]. سمیت ناشی از مصرف خوراکی آسپارتام عمدتاً به متابولیت‌های حاصل از گوارش و جذب روده‌ای این ماده مرتبط است که طی متابولیسم آسپارتام در داخل دستگاه معده‌ای روده‌ای توسط استرازها و پپتیدازها، این ماده به فنیل‌آلانین، اسیدآسپارتیک و متانول هیدرولیز می‌شود [5 ،4]. متانول برای اکثر بافت‌های بدن مخرب بوده و نیز متابولیت‌های حاصل از آن یعنی فرم‌آلدئید و اسیدفرمیک نیز موجب سمیت در بیشتر سلول‌ها و بافت‌های بدن می‌شوند [5]. متانول از طریق سیاهرگ باب وارد کبد شده و توسط آنزیم الکل‌دهیدروژناز به فرم‌آلدئید اکسید می‌شود که این ماده موجب سمیت در اکثر سلول‌ها و بافت‌های بدن می‌شود [5]. مقدار نسبتاً کمی آسپارتام قادر است به طور قابل توجهی باعث افزایش سطح متانول در خون شود که گفته می‌شود متابولیسم متانول به فرم‌آلدئید و اسیدفرمیک، با تشکیل آنیون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن همراه است [6]. آنیون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن باعث آسیب به غشای میتوکندریایی شده و با بیش‌تولید گونه‌های فعال اکسیژن موجب ایجاد استرس اکسیداتیو و القای آپوپتوز می‌شود [7 ،6].
مشخص شده است که مصرف آسپارتام به روش خوراکی بر کاهش وزن در انسان تأثیر دارد و این کاهش وزن به این دلیل است که آسپارتام باعث کاهش نوروپپتید Y مغزی می‌شود که نقش بسیار حیاتی در متابولیسم و سوخت و ساز بدن دارد [18]. همچنین در بررسی دیگری مشخص شده است که مصرف خوراکی آسپارتام روزانه به میزان 14 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن در طی دوره ارگانوژنز موش صحرایی، باعث کاهش وزن بدن جنین و نیز کاهش وزن جفت می‌شود [19]. در برخی دیگر از مطالعات بیان شده است که آسپارتام یک آنزیم روده‌ای بنام آلکالین‌فسفاتاز روده‌ای (IAP) را مهار می‌کند که این آنزیم می‌تواند از بروز چاقی، دیابت نوع 2 و سندرم متابولیک جلوگیری کند. یافته‌های این آزمایشات نشان داد موش‌هایی که از آب حاوی آسپارتام استفاده می‌کردند در مقایسه با موش‌هایی که از آب بدون آسپارتام استفاده می‌کردند، دچار اضافه‌وزن بیشتری شدند [20]. همچنین در تحقیق دیگری بیان شده است که آسپارتام مسیر تشخیص مصرف ماده غذایی را در مغز غیرفعال می‌کند که در این راستا با انجام ام‌آر‌آی‌های عملکردی مغز نشان داده شده که سرکوب اشتها به دلیل مصرف آسپارتام اتفاق نمی‌افتد و به همین دلیل به دنبال آن پیغام سیری به مغز ارسال نشده و درنتیجه فرد همچنان به خوردن غذا ادامه میدهد [21]. در این مطالعه مشخص شد که آسپارتام موجب تغییرات وزن بدن در گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام نمی‌شود که با نتایج تحقیقات اشاره‌شده هم‌خوانی ندارد.
به منظور دست‌یابی به بینشی جهت درک بهتر تعادل بین اکسیدان / آنتی‌اکسیدان در محیط داخلی بدن، اندازه‌گیری میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام و مالون‌دی‌آلدئید می‌تواند بسیار کاربردی باشد [15]. ارتباط بین آنزیم‌های دخیل در پاکسازی گونه‌های فعال اکسیژن با یکدیگر باعث حفاظت از بافت‌ها و سلول‌های بدن در برابر اثرات مخرب اکسیدان‌ها می‌شود. بنابراین حتی تغییرات بسیار اندک در میزان طبیعی آنزیم‌های ذکرشده می‌تواند منجر به تخریب مولکول‌های زیستی در برابر آسیب‌های اکسیداتیو و همچنین اختلال در سیستم‌های دفاعی بدن شود [15]. طی این مطالعه آسپارتام ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام را در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن کاهش داده بود که این نتایج توسط گزارشات مختلف قبلی حمایت می‌شوند [15 ،10 ،7]. در این مطالعه آسپارتام میزان مالون‌دی‌آلدئید را در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن افزایش داد. گزارشات پیشین افزایش سطح مالون‌دی‌آلدئید را در موش‌های دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 80 و 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نشان داده‌اند [15 ،10] که با نتایج حاصل از گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن در این مطالعه همسو بوده، ولی با سایر گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام همسو نیست.
افزایش مقادیر تستوسترون خون در بسیاری از بیماری‌های تخمدانی مانند سندرم تخمدان پلی‌سیستیک اتفاق می‌افتد. در ضمن افزایش تستوسترون باعث کاهش فعالیت آنتی‌اکسیدانت‌های آنزیمی و غیرآنزیمی می‌شود. مطالعه بالینی در زنان دچار سندرم تخمدان پلی‌سیستیک نشان داده که در زنان با تستوسترون بالا، استرس اکسیداتیو نیز افزایش یافته است [22]. به نظر می‌رسد گنادوتروپین و استروژن، فاکتورهای بقا برای سلول‌های فولیکولی هستند. در حالی که تستوسترون آپوپتوز فولیکول‌ها را در موش افزایش میدهد. بر اساس شواهد موجود، فولیکول‌هایی که نسبت آندروژن به استروژن بالایی دارند، در مقایسه با فولیکول‌هایی که این نسبت در آن‌ها پایین‌تر است، به آپوپتوز حساس‌تر هستند. استروژن موجب رشد فولیکول‌ها می‌شود، ولی تستوسترون آترزی فولیکول‌ها را القا می‌کند [23]. در این مطالعه، سطح هورمون تستوسترون در گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن نسبت به گروه کنترل افزایش یافته بود، ولی این افزایش از نظر آماری معنی‌دار نبود.
مشاهدات هیستومورفولوژی توسط میکروسکوپ الکترونی و نوری در پژوهش‌های پیشین نشان می‌دهند که قرار گرفتن در معرض آسپارتام و متابولیت‌های حاصل از آن مانند فرم‌آلدئید موجب تغییر ساختار بافتی تخمدان از قبیل به‌هم‌ریختگی سلول‌های بینابینی بین فولیکول‌های در حال رشد، دژنراسیون اووسیت، ریزش و پیکنوزه شدن هسته سلول‌های گرانولوزا می‌شود [25 ،24]. همچنین در مطالعه دیگری بیان شده است که فرم‌آلدئید موجب احتقان عروقی و ادم بینابینی در تخمدان می‌شود که این نتایج با یافته‌های این مطالعه در موش‌های دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن کاملاً مطابقت دارد [26]. مطالعات هیستومورفومتریک پیشین اثبات کرده‌اند که قرار گرفتن در معرض فرم‌آلدئید موجب کاهش اندازه و تعداد انواع فولیکول‌های در حال رشد (فولیکول‌های بدوی، اولیه، ثانویه، ثالث و گراف) و جسم زرد نسبت به گروه کنترل شده است، در حالی که تعداد فولیکول‌های آترزی‌شده نسبت به گروه کنترل به وضوح افزایش یافته بود که با نتایج گروه دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن در مطالعه حاضر هم‌خوانی دارد [27-25].
در شرایطی که چرخه متابولیکی دچار اختلال می‌شود متعاقباً متابولیسم سلولی نیز تغییر می‌کند. در این شرایط، سلول‌ها از دیگر منابع غذایی موجود در محیط برای سوخت و ساز استفاده می‌کنند. نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی پریودیک اسید شیف در این مطالعه نشان داد در بافت تخمدان موش‌های دریافت‌کننده آسپارتام، واکنش پریودیک اسید شیف (ذرات کربوهیدرات) در سلول‌های اووسیت و ضخامت منطقه شفاف تفاوتی با گروه کنترل نداشت. این نتایج حاکی از عدم اختلال در سوخت و ساز سلول‌های بافت تخمدان تحت تأثیر دریافت آسپارتام بود که با پژوهش‌های دیگری در این زمینه که در آن فرم‌آلدئید موجب افزایش واکنش پریودیک اسید شیف در منطقه شفاف شده بود، همسو نیست [27]. همچنین رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون در مطالعه حاضر نشان داد میزان رشته‌های کلاژن در اووسیت و ضخامت تونیکا آلبوژینا در گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام تغییر قابل مشاهده‌ای در مقایسه با گروه کنترل نشان نداد. این در حالی است که یافته‌های مطالعات قبلی نیز نشان می‌دهند مصرف آسپارتام موجب تغییر در میزان رشته‌های کلاژن در بافت‌های موش سفید کوچک آزمایشگاهی نشده است [15].
استرس اکسیداتیو نقشی کلیدی در ایجاد و توسعه آپوپتوز بافتی ایفا می‌کند. بر اساس وضعیت سرکوب آنتی‌اکسیدانی در حیوانات مواجهه‌یافته با آسپارتام و در نظر گرفتن آپوپتوز حاصل از استرس اکسیداتیو می‌توان استنباط کرد که افزایش آپوپتوز در گروه مواجهه‌یافته با آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، ممکن است مربوط به تولید استرس اکسیداتیو به دنبال اکسیداسیون متانول باشد [10 ،6]. در طول اکسیداسیون متانول رادیکال‌های آزاد تولید و منجر به آسیب به ساختار ماکرومولکول‌های سلول می‌شوند [10]. در راستای یافته‌های ما در کاهش بیان ژنی Bcl-2 و افزایش بیان ژنی P53 و Caspase-3 در تخمدان نشان داده شد این فاکتورها در روند آپوپتوز نقش دارند. P53 یکی از عوامل مهم در فرایند آپوپتوز بوده و به دنبال آسیب DNA باعث رونویسی پروتئین‌های پیش‌آپوپتوزی می‌شود [10]. Bcl-2 یک میانجی ضدآپوپتوزی است که مانع آزاد شدن سیتوکروم c از میتوکندری‌ها به سیتوزول شده و فعالیت پروتئازهای کاسپاز را کنترل می‌کند [10]. Caspase-3 اجرایی‌ترین آنزیم کلیدی است که تغییرات هیستومورفولوژیک سلولی را طی آپوپتوز تعدیل می‌نماید [10]. بنابراین مصرف طولانی‌مدت آسپارتام منجر به ایجاد آپوپتوز توسط کاهش بیان میانجی ضدآپوپتوزی و افزایش بیان میانجی‌های آپوپتوزی شده است. همسو با مطالعه ما، محققین دیگری نیز کاهش بیان میانجی‌های ضدآپوپتوزی و افزایش بیان میانجی‌های آپوپتوزی را در اندام‌های مختلف حیوانات تجربی مورد آزمایش، متعاقب مصرف طولانی‌مدت آسپارتام گزارش کرده‌اند [30-28 ،10 ،6].
نتیجه‌گیری
با جمع‌بندی یافته‌های مطالعه حاضر چنین برمی‌آید که مصرف آسپارتام در دوز بالا طی یک دوره طولانی، به واسطه افزایش تولید رادیکال‌های آزاد، پی‌ریزی تنش‌های اکسیداتیو و نیز تضعیف دستگاه دفاع آنتی‌اکسیدانی بدن، موجبات اختلالات مربوط به پارامترهای هیستومورفولوژی، هیستومورفومتری، بیوشیمیایی و تغییرات هیستوشیمیایی را در موش‌های دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن فراهم می‌آورد که به نوبه خود قادر هستند عملکرد فیزیولوژیک سیستم تولیدمثل ماده را دچار اختلال نمایند. مضافاً اینکه دریافت آسپارتام به میزان 160 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن قادر است به واسطه اعمال استرس اکسیداتیو موجب کاهش میزان بیان ژن‌های Bcl-2 و در عین حال افزایش میزان بیان ژن‌های P53 و Caspase-3 شود که از جمله ژن‌های دخیل در فرایند مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول بوده و سبب القای آپوپتوز می‌شوند. در حالی که نتایج گروه‌های دریافت‌کننده آسپارتام به میزان 80 و 40 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن تفاوت قابل توجهی در مقایسه با نتایج گروه کنترل نداشت و آسیب‌های مشاهده‌شده در گروه مذکور دیگر را از خود نشان نداد. با این وجود، تأیید مضرات و توکسیک بودن آسپارتام در سایر بخش‌های دستگاه تولید‌مثلی ماده، نیازمند طرح‌ریزی مطالعات تجربی گسترده‌تر و نیز کارآزمایی‌های بالینی است.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کلیه ضوابط و شرایط نگهداری و انجام آزمایش‌ها روی حیوانات در این مطالعه طبق دستورالعمل‌های مصوب کمیته اخلاق دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران با کد اخلاق 21/6/30029 صورت پذیرفت.
حامی مالی
این تحقیق هیچ‌گونه کمک مالی از سازمان‌های تأمین مالی در بخش‌های عمومی، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
تمامی نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش تمام بخش‌های پژوهش حاضر مشارکت یکسان داشته‌اند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم می‌دانند مراتب تشکر و قدردانی خود را از معاونت پژوهشی دانشگاه تهران به سبب حمایت‌هایشان از این مطالعه اعلام دارند.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
بافت شناسی و جنین شناسی
دریافت: 1400/2/26 | پذیرش: 1400/6/9 | انتشار: 1400/6/10
دریافت: 1400/2/26 | پذیرش: 1400/6/9 | انتشار: 1400/6/10
فهرست منابع
1. Morovvati H, Khaksar Z, Sheibani M, Anbara H, Amini Kafiabad M, Moradi H R. [Effect of aspartame on histological and histometrical structure of prostate gland in adult mice (Persian)]. Qom Univ Med Sci J. 2019; 12(12):14-27. [DOI:10.29252/qums.12.12.14] [DOI:10.29252/qums.12.12.14]
2. Morovvati H, Anbara H, Sheibani MT, Koohi MK, Hasanzadeh A. [The effect of long-term exposure to aspartame on histomorphometric and histochemical adrenal gland in adult NMRI mice (Persian)]. Armaghane-Danesh. 2019; 24(2):150-69. http://armaghanj.yums.ac.ir/article-1-2430-en.html
3. Magnuson BA, Burdock GA, Doull J, Kroes RM, Marsh GM, Pariza MW, et al. Aspartame: A safety evaluation based on current use levels, regulations, and toxicological and epidemiological studies. Crit Rev Toxicol. 2007; 37(8):629-727. [PMID] [DOI:10.1080/10408440701516184]
4. Humphries P, Pretorius E, Naudé H. Direct and indirect cellular effects of aspartame on the brain. Eur J Clin Nutr. 2008; 62(4):451-62. [DOI:10.1038/sj.ejcn.1602866] [PMID] [DOI:10.1038/sj.ejcn.1602866]
5. Oyama Y, Sakai H, Arata T, Okano Y, Akaike N, Sakai K, et al. Cytotoxic effects of methanol, formaldehyde, and formate on dissociated rat thymocytes: A possibility of aspartame toxicity. Cell Biol Toxicol. 2002; 18(1):43-50. [DOI:10.1023/A:1014419229301] [PMID] [DOI:10.1023/A:1014419229301]
6. Ashok I, Sheeladevi R. Biochemical responses and mitochondrial mediated activation of apoptosis on long-term effect of aspartame in rat brain. Redox Biol. 2014; 2:820-31. [PMID] [PMCID] [DOI:10.1016/j.redox.2014.04.011]
7. Ashok I, Sheeladevi R, Wankhar D. Long term effect of aspartame (Artificial sweetener) on membrane homeostatic imbalance and histopathology in the rat brain. Free Radic Antioxid. 2013; 3(2):42-9. [DOI:10.1016/j.fra.2013.09.003] [DOI:10.1016/j.fra.2013.09.003]
8. Okasha EF. Effect of long term-administration of aspartame on the ultrastructure of sciatic nerve. J Microsc Ultrastruct. 2016; 4(4):175-83. [DOI:10.1016/j.jmau.2016.02.001] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1016/j.jmau.2016.02.001]
9. Sheibani M T, Anbara H, Morovvati H, Razi M, SalarAmoli J. [Effect of long term-administration of aspartame on sperm quality, testosterone and oxidant parameters in mice (Persian)]. J Ilam Univ. 2019; 27(3):150-61. [DOI:10.29252/sjimu.27.3.150] [DOI:10.29252/sjimu.27.3.150]
10. Anbara H, Sheibani MT, Razi M, Kian M. Insight into the mechanism of aspartame-induced toxicity in male reproductive system following long-term consumption in mice model. Environ Toxicol. 2021; 36(2):223-37. [DOI:10.1002/tox.23028] [PMID] [DOI:10.1002/tox.23028]
11. Lowe SW, Lin AW. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 2000; 21(3):485-95. [DOI:10.1093/carcin/21.3.485] [PMID] [DOI:10.1093/carcin/21.3.485]
12. Favaloro B, Allocati N, Graziano V, Di Ilio C, De Laurenzi V. Role of apoptosis in disease. Aging. 2012; 4(5):330-49. [DOI:10.18632/aging.100459] [PMID] [PMCID] [DOI:10.18632/aging.100459]
13. Amaral JD, Xavier JM, Steer CJ, Rodrigues CM. The role of p53 in apoptosis. Discov Med. 2010; 9(45):145-52. [PMID]
14. Onaolapo AY, Abdusalam SZ, Onaolapo OJ. Silymarin attenuates aspartame-induced variation in mouse behaviour, cerebrocortical morphology and oxidative stress markers. Pathophysiology. 2017; 24(2):51-62. [PMID] [DOI:10.1016/j.pathophys.2017.01.002]
15. Anbara H, Sheibani MT, Razi M. Long-term effect of aspartame on male reproductive system: Evidence for testicular histomorphometrics, Hsp70-2 protein expression and biochemical status. Int J Fertil Steril. 2020; 14(2):91-101. [PMID]
16. Tamatani M, Mitsuda N, Matsuzaki H, Okado H, Miyake S, Vitek MP, et al. A pathway of neuronal apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation: Roles of nuclear factor-kappaB and Bcl-2. J Neurochem. 2000; 75(2):683-93. [DOI:10.1046/j.1471-4159.2000.0750683.x] [PMID] [DOI:10.1046/j.1471-4159.2000.0750683.x]
17. Harrison DC, Davis RP, Bond BC, Campbell CA, James MF, Parsons AA, et al. Caspase mRNA expression in a rat model of focal cerebral ischemia. Brain Res Mol Brain Res. 2001; 89(1-2):133-46. [PMID] [DOI:10.1016/S0169-328X(01)00058-4]
18. Beck B, Burlet A, Max JP, Stricker-Krongrad A. Effects of long-term ingestion of aspartame on hypothalamic neuropeptide Y, plasma leptin and body weight gain and composition. Physiol Behav. 2002; 75(1-2):41-7. [PMID] [DOI:10.1016/S0031-9384(01)00654-0]
19. Leme FAGdL, Azoubel R. Effects of aspartame on exocrine pancreas of rat fetuses. Int J Morphol. 2006; 24(4):679-84. [DOI:10.4067/S0717-95022006000500027] [DOI:10.4067/S0717-95022006000500027]
20. Gul SS, Hamilton AR, Munoz AR, Phupitakphol T, Liu W, Hyoju SK, et al. Inhibition of the gut enzyme intestinal alkaline phosphatase may explain how aspartame promotes glucose intolerance and obesity in mice. Appl Physiol Nutr Metab. 2017; 42(1):77-83. [DOI:10.1139/apnm-2016-0346] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1139/apnm-2016-0346]
21. Yang Q. Gain weight by "going diet?" Artificial sweeteners and the neurobiology of sugar cravings: Neuroscience 2010. Yale J Biol Med. 2010; 83(2):101-8. [PMID]
22. Hilali N, Vural M, Camuzcuoglu H, Camuzcuoglu A, Aksoy N. Increased prolidase activity and oxidative stress in PCOS. Clin Endocrinol. 2013; 79(1):105-10. [DOI:10.1111/cen.12110] [PMID] [DOI:10.1111/cen.12110]
23. Mason HD, Willis DS, Beard RW, Winston RM, Margara R, Franks S. Estradiol production by granulosa cells of normal and polycystic ovaries: relationship to menstrual cycle history and concentrations of gonadotropins and sex steroids in follicular fluid. J Clin Endocrinol Metab1. 994; 79(5):1355-60. [DOI:10.1210/jcem.79.5.7962330] [PMID] [DOI:10.1210/jcem.79.5.7962330]
24. Guo-qing P, Yan T, Ou J. [The effects of formaldehyde on ovarian histopathology structure, oocyte ultrastructure and apoptosis of female rats (Chinese)]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2010; 26(9):865-7. [PMID]
25. Treesh SA, Aburawi SM, Elghedamsi MT, Jaafari HA, Alzowam R, Shibani N, et al. Protective role of vitamin C on histopathological effect of formaldehyde on reproductive system in female albino mice (histological study). Int J Adv Res. 2019; 7(2):529-40. [DOI:10.21474/IJAR01/8516] [DOI:10.21474/IJAR01/8516]
26. Wang HX, Wang XY, Zhou DX, Zheng LR, Zhang J, Huo YW, et al. Effects of low-dose, long-term formaldehyde exposure on the structure and functions of the ovary in rats. Toxicol Ind Health. 2013; 29(7):609-15. [DOI:10.1177/0748233711430983] [PMID] [DOI:10.1177/0748233711430983]
27. Kareem LA, Banna HB, Naoom KM. Effects of Toluene and Formaldehyde on Oogenesis in Adult Female Mice. Diyala J Med. 2014; 6(1):33-40. https://djm.uodiyala.edu.iq/index.php/djm/article/view/361
28. Ashok I, wankhar D, wankhar W, Sheeladevi R. Neurobehavioral changes and activation of neurodegenerative apoptosis on long-term consumption of aspartame in the rat brain. J Nutr Intermed Metab. 2015; 2(3-4):76-85. [DOI:10.1016/j.jnim.2015.09.001] [DOI:10.1016/j.jnim.2015.09.001]
29. Iyaswamy A, Wankhar D, Loganathan S, Shanmugam S, Rajan R, Rathinasamy S. Disruption of redox homeostasis in liver function and activation of apoptosis on consumption of aspartame in folate deficient rat model. J Nutr Intermed Metab. 2017; 8:41-50. [DOI:10.1016/j.jnim.2017.06.002] [DOI:10.1016/j.jnim.2017.06.002]
30. Gombos K, Varjas T, Orsós Z, Polyák E, Peredi J, Varga Z, et al. The effect of aspartame administration on oncogene and suppressor gene expressions. In vivo. 2007; 21(1):89-92. https://iv.iiarjournals.org/content/invivo/21/1/89.full.pdf
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
