دوره 15، شماره 6 - ( شهریور 1400 )
جلد 15 شماره 6 صفحات 433-426 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Zamani-Garmsiri F, Najafi M, Mohammadi A, Shaikhnia F, Ghasempour G. Evaluation of the toxicity effects of polyethyleneimine (PEI) on cell viability and morphology of VSMC cells. Qom Univ Med Sci J 2021; 15 (6) :426-433
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3145-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3145-fa.html
زمانی گرمسیری فهیمه، نجفی محمد، محمدی اصغر، شیخ نیا فرهاد، قاسم پور قاسم. بررسی اثر نانوذره پلیاتیلن ایمین بر زندهمانی و مورفولوژی سلولهای عضله صاف عروق. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1400; 15 (6) :426-433
فهیمه زمانی گرمسیری1 
، محمد نجفی2 ، اصغر محمدی3 ، فرهاد شیخ نیا2 ، قاسم قاسم پور* 4
، محمد نجفی2 ، اصغر محمدی3 ، فرهاد شیخ نیا2 ، قاسم قاسم پور* 4
1- گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علومپزشکی تهران، تهران، ایران.
2- گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علومپزشکی ایران، تهران، ایران.
3- گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده پزشکی، دانشگاه تربیتمدرس، تهران، ایران
4- گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علومپزشکی ایران، تهران، ایران. ،ghasempourghasem66@gmail.com
2- گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علومپزشکی ایران، تهران، ایران.
3- گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده پزشکی، دانشگاه تربیتمدرس، تهران، ایران
4- گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علومپزشکی ایران، تهران، ایران. ،
متن کامل [PDF 6104 kb]
(559 دریافت)
| چکیده (HTML) (1553 مشاهده)
متن کامل: (321 مشاهده)
مقدمه
امروزه جهت انتقال ژن به درون سلول از روشهای گوناگونی از قبیل وکتورهای ویروسی و غیرویروسی میتوان استفاده کرد [1]. وکتورهای ویروسی دارای بهترین کارایی و نتیجه در انتقال ژن هستند، اما معایبی مثل سمیت سلولی، القای پاسخ ایمنی، هزینه تولید بالا و محدودیت در اندازه ژن مورد انتقال را نیز دارند [2 ،1]. وکتورهای غیرویروسی شامل لیپیدهای کاتیونی (مانند لیپوفکتامین) و پلیمرهای کاتیونی، لیپوزومها و نانوپارتیکلها هستند. لیپوزومها به دلیل داشتن معایبی از جمله پایداری پایین، کارایی پایین و پاک شدن سریع از جریان خون، کاربردشان محدود شده است. در مقابل، پلیمرهای کاتیونی در مقایسه با وکتورهای ویروسی کمهزینهتر، دردسترستر و غیرپاتوژنیک بوده و از ایمنی بالاتری برخوردار هستند [4 ،3 ،1].
PEI یک پلیمر کاتیونی ارگانیک است که به واسطه داشتن تعداد زیاد گروههای آمین قابلیت پروتونه شدن دارد [3]. از دلایلی که از PEI به عنوان یکی از بهترین عوامل انتقال ژن استفاده میشود میتوان به موارد ذیل اشاره کرد: توانایی بالای آن در انتقال ژن به بسیاری از سلولها، سهولت ایجاد کمپلکس PEI/DNA، پایداری بالای آن حتی در 4 درجه سانتیگراد، ارزان و دسترس بودن طیف وسیعی از PEI با وزنهای مولکولی متفاوت، سازگاری بیولوژیکی خوب، ایمیونوژسیتی پایین و به واسطه داشتن گروههای آمین فعال تغییراتی از قبیل کونژوگاسیون یا کونژوگاسیون با پلی اتیلن گلیول روی آن به آسانی صورت میپذیرد. پلیمرهای PEI دارای وزنهای مولکولی متنوعی هستند که در برداشت و سمیت سلولی نقش مهمی دارند. مشتقات PEI با وزن مولکولی بالا علیرغم کارایی بالا در انتقال ژن، سمیت بالاتری نیز ایجاد میکنند [5].
پلیمرهای PEI شامل دو نوع شاخهدار (B) و خطی (L) هستند و وزن مولکولی ایدهآل PEI برای انتقال ژن بین 5 تا 25 کیلودالتون است. از میان این وزنهای مولکولی، PEI شاخهدار با وزن مولکولی 25 کیلودالتون بیشتر مورد استفاده قرار میگیرد [2]. سمیت سلولی PEI، علاوه بر وزن مولکولی، به درجه شاخهدار بودن، قدرت یونی محلول، پتانسیل زتا و اندازه پلیپلکس بستگی دارد [6]. سمیت سلولی PEI عموماً به دو فاز تقسیمبندی میشود: فاز I شامل ناپایداری غشا و تغییر موقعیت فسفاتیدیلسرین است و فاز II شامل آپوپتوز است که طی آن سیتوکروم c از میتوکندری آزاد شده و با فعالسازی کاسپاز3 فرایند آپوپتوز آغاز میشود [7 ،1]. همچنین مشخص شده است که این نانوذره باعث القای سمیت سلولی در سلولهای Neuro2A میشود، به صورتی که میزان بیان ژنهای Grp78 (Bip) ،Atf4 و Chop را افزایش میدهد [8]. PEI این قابلیت را دارد که با برهمکنشهای الکترواستاتیک به DNA متصل شود و تشکیل کمپلکس DNA/PEI را بدهد. اتصال این پلیپلکسها به سلول به دو روش وابسته و غیروابسته به گیرنده صورت میگیرد. در حالت بدون رسپتور، پلیمرهای کاتیونی به پروتئوگلیکانهای آنیونی متصل شده و سپس به داخل سلول وارد میشوند. مدیفیکاسیون وکتورها با لیگاندها یا آنتیبادیهای اختصاصی از قبیل ترانسفرین سبب ورود به سلول از طریق اندوسیتوز به واسطه گیرنده میشود. از جمله سایر لیگاندها میتوان به انسولین، فاکتور رشد مبدل، فولات و فاکتور رشد فیبروبلاستی اشاره کرد. ورود به سلول عمدتاً از دو طریق اندوسیتوز وابسته به کلاترین یا کاوئول (Caveola) صورت میپذیرد. پس از ورود به اندوزوم و پمپ شدن پروتون به آن، به خاطر خاصیت PEI در بافر کردن pH، سبب تجمع پروتون در اندوزوم شده که باعث تورم اسموتیک و پارگی اندوزوم میشود که به آن «اثر اسفنجی پروتون» گفته میشود [5 ،4]. سمیت سلولی ایجادشده در اثر PEI به لحاظ زمانی نیز به دو نوع سریع و کند تقسیمبندی میشود. نوع سریع آن در رابطه با PEI آزاد است که در این حالت PEI با پروتئینهای سرم دارای بار منفی مثل آلبومین واکنش داده و تشکیل رسوب میدهد که به سطح سلولها متصل شده و باعث ناپایداری غشا میشود. PEGylation یکی از راهکارهای مقابله با این وضعیت است. نوع کند به آزاد شدن DNA از PEI مرتبط است. در این حالت PEI با اجزای سلولی برهمکنش داده و مانع از انجام پروسههای طبیعی سلول میشود. چروکیدگی سلول، کاهش تعداد میتوز و واکوئولیزاسیون سیتوپلاسم از وقایع این مرحله است [6]. در این مطالعه اثر سمیت نانوذره PEI بر سلولهای عضله صاف مورد مطالعه قرار گرفت.
روش بررسی
سلولهای عضله صاف عروق (VSMC C591) از مؤسسه پاستور (ایران، تهران) تهیه و در محیط کشت DMEM F-12 حاوی FBS 10% (Gibco) و pen-strp 1% (Sigma-Aldrich, USA) کشت شدند. سلولهای کشتشده در شرایط نرمال (دمای 37 درجه سانتیگراد، دیاکسیدکربن 5 درصد و رطوبت 95 درصد) در انکوباتور نگهداری شدند.
ترانسفکشن با نانوذره
ابتدا سلولهای کشتشده به دو گروه تقسیم شدند، به طوری که گروه اول با نانوذره (25kDa) PEI خالی و گروه دوم با نانوذره PEI حاوی یک توالی نوکلئوتیدی بیمعنا ترانسفکت شدند. برای انجام ترانسفکت، ابتدا نانوذره PEI به دو صورت محلول خالی و محلول همراه با توالی الیگونوکلئوتیدی آماده شد. در گروه نانوذره حاوی توالی الیگونوکلئوتیدی از نسبت نیتروژن به فسفر 20 (20=N/P) استفاده شد. نیتروژن و فسفر به ترتیب اشاره به گروههای آمین موجود در نانوذره و گروههای فسفات توالی الیگونوکلئوتیدی دارند. سپس سلولها به مدت 4 ساعت در محیط کشت حاوی نانوذره خالی یا نانوذره حاوی الیگونوکلئوتید در انکوباتور نگهداری شدند. آنگاه، محیط کشت سلولها با محیط تازه تعویض و به مدت 24 ساعت در شرایط نرمال در انکوباتور حفظ شدند [10 ،9].
میکروسکوپ فلورسنت
برای مشاهده میکروسکوپی کارایی PEI در ترانسفکشن، از الیگونوکلئوتید متصلشده به فلوئورسین ایزوتیوسیانات به عنوان انتشاردهنده فلورسانس سبز استفاده شد. پس از ترانسفکشن سلولی توسط PEI حاوی الیگونوکلئوتید متصل به FITC، سلولها در شرایط طبیعی به مدت 4 ساعت در دستگاه انکوباتور نگهداری شدند. سپس توسط بافر فسفات سالین شسته و توسط میکروسکوپ Olympus IX71 تصویربرداری شدند.
میکروسکوپ الکترونی
سلولهای ترانسفکتشده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (LEO 906; Zeiss) مورد بررسی قرار گرفتند. برای این کار ابتدا سلولهای ترانسفکتشده با PBS شسته و تثبیت اولیه در گلوتارآلدئید 5/2 درصد به مدت 2 ساعت انجام شد. سپس، سلولها سه بار با استفاده از PBS شستوشو داده شدند تا گلوتارآلدئید اضافی از بین برود. پس از آن، سلولها به مدت 5/1 ساعت در 1 درصد اسمیم غوطهور شدند. سپس دهیدراسیون کردن سلولها در غلظتهای متفاوت استون (50، 70، 90 و 100 درصد) صورت گرفت و سلولها در رزین خالص ثابت شدند. سرانجام، برشهای نازک (50 نانومتر) برای میکروسکوپ الکترونی تهیه شد و گریدهای بدون پوشش 200 مش استفاده شد. نانوذرات منفرد همچنین با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روی شبکههای مسی با پوشش کربن مورد بررسی قرار گرفتند [11].
تست MTT
در یک پلیت 96 خانه، 5000 سلول VSMC به ازای هر چاهک کشت شدند و بعد از آمادهسازی محلول نانوذره چه به صورت تنها و چه همراه با توالی الیگونوکلئوتیدی، سلولها به مدت 4 ساعت در معرض این محلولها قرار گرفتند. سپس محیط کشت سلولها با محیط کشت تازه جایگزین شد و سلولها 24 ساعت در انکوباتور نگهداری شدند [9]. پس از 24 ساعت نگهداری در انکوباتور، سلولها به مدت 2 ساعت در محلول MTT 5/0 میلیگرم بر میلیلیتر انکوبه شدند، سپس محیط رویی برداشته و به هر چاهک 100 میکرولیتر DMSO (دیمتیل سولفوکسید) اضافه شد که سبب حل شدن کریستالهای تشکیلشده فورمازان میشود. پس از 15 دقیقه شیک ملایم، میزان جذب نوری رنگ تشکیلشده، در طول موج 570 نانومتر اندازهگیری شد [12].
آنالیز آماری
در این مطالعه برای آنالیز دادهها از نرمافزار گراف پدپریزم (نسخه 8) و آزمونهای آنالیز واریانس یکطرفه و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. دادههای با p کمتر از 05/0 معنیدار در نظر گرفته شدند. شاخصها به صورت میانگین همراه با انحرافمعیار گزارش شدند.
یافتهها
ارزیابی کارایی ترانسفکشن سلولی با میکروسکوپ فلورسنت
تصاویر میکروسکوپی فلورسنت نشان داد PEI با کارایی بالایی سبب انتقال توالی الیگونوکلئوتید به سلولهای VSMC میشود (تصویر شماره 1).
میزان زندهمانی سلول
همانطور که تصویر شماره 2 نشان میدهد، نانوذره خالی (PEI) در مقایسه با گروه کنترل به صورت معنیداری میزان زندهمانی سلول را کاهش داده است (0001/p<0). اما زندهمانی سلول در گروه نانوذره حاوی الیگونوکلئوتید بیمعنا (PEI + Scramble) نسبت به گروه کنترل دستخوش تغییر معنیداری نشده است (7414/0=p). از طرفی نشان داده شده است که میزان زندهمانی سلولها در گروه نانوذره حاوی الیگونوکلئوتید به میزان معنیداری بالاتر از گروه نانوذره خالی است (0002/0=p). میانگین همراه با انحرافمعیار زندهمانی سلولها در گروه کنترل برابر با 6/8±2/98، در گروه نانوذره برابر با 5/6±9/62 و در گروه PEI + scramble برابر با 4/2±42/98 درصد بود.
تصاویر میکروسکوپ الکترونی
تصاویر حاصل از میکروسکوپ الکترونی نشان میدهد که سلولهای ترانسفکتشده با نانوذره خالی واکوئله شده و نشاندهنده القای مسیر آپوپتوز در سلولهای تیمارشده با نانوذره پلیاتیلن ایمین است (تصویر شماره 3 ج). در حالی که سلولهای ترانسفکتشده با نانوذره حاوی الیگونوکلئوتید بیمعنا دچار آپوپتوز نشده و ظاهری نرمال دارند (تصویر شماره 3 د).
بحث
انتقال ژنها به داخل سلول به دو روش ویروسی و غیرویروسی انجام میشود. روش غیرویروسی مزایای خاصی نسبت به وکتورهای ویروسی دارد، چون در روش ویروسی امکان ایجاد سمیت سلولی، محدودیت در اندازه ژن، ایجاد پاسخهای ایمنی، هزینه بالا و پتانسیل ایجاد پاسخهای ایمنی وجود دارد. علاوه بر این، وکتورهای ویروسی امکان ایجاد جهش و تبدیل سلولها به حالت سرطانی را دارند [13]. وکتورهای غیرویروسی از قبیل لیپیدهای کاتیونی (مانند لیپوفکتامین) و پلیمرهای کاتیونی همانند PEI جایگزین امیدوارکنندهای بوده و مزایایی از جمله آمادهسازی، تولید، تخلیص و تغییرات شیمیایی آسان، پاسخ ایمنی کمتر در مقابل وکتور ویروسی و پایداری بالاتری دارند [4 ،3 ،1]. PEI به واسطه داشتن تعداد زیاد بار مثبت در گروههای آمین خود با بارهای منفی اسیدهای نوکلوئیک واکنش الکتروستاتیک برقرار کرده و بدینترتیب سبب سهولت انتقال ژنها میشود. از ویژگیهای اصلی PEI که موجب انتقال ژن با کارایی بالا شده است میتوان به مواردی از قبیل انتقال ژنها در طیف وسیعی از سلولها و سهولت در ایجاد کمپلکس PEI/DNA اشاره کرد [5].
تا کنون مطالعات مختلفی به بررسی اثر سمیت و زندهمانی سلول توسط PEI پرداختهاند. بورچارد و همکاران زندهمانی سلول و کارایی انتقال ژن توسط PEI را در ردههای سلولی مختلف مورد مطالعه قرار دادند. آنها نشان دادند کارایی PEI در انتقال ژن و سمیت آن در ردههای سلولی مختلف، متفاوت است [14]. وانگ و همکاران نشان دادند میزان زندهمانی سلول و کارایی انتقال ژن توسط PEI (تغییریافته) با وزن مولکولی پایین افزایش مییابد [15]. رضایی و همکاران جهت انتقال ژن توسط PEI با کارایی بالا و سمیت سلولی پایین، از PEI با وزن مولکولی بالا و تغییریافته توسط یک زنجیره کربنی استفاده کردند و ثابت نمودند که بهترین نتیجه در PEI تغییریافته با زنجیره کربنی (10C) حاصل میشود [16]. همراستا با گزارش توماس و کلیبانو [17]، ما نیز در این مطالعه نشان دادیم که سمیت PEI سبب از بین رفتن 35 درصد سلولها شده است. تصاویر میکروسکوپ الکترونی نشان داد این سمیت از طریق واکوئله شدن سلول و درنهایت آپوپتوز ایجاد میشود. احتمالاً اثرگذاری نانوذره PEI بر القای مسیر آپوپتوز به صورتی است که ابتدا با ناپایداری غشا و سپس با آزادسازی سیتوکروم c از میتوکندری و متعاقباً فعالسازی کاسپاز3 منجر به فعالسازی آپوپتوز میشود [7 ،1]. همچنین این نانوذره به واسطه افزایش بیان ژنهایی همانند Atf4 و Chop در القای آپوپتوز میتواند نقش مهمی ایفا کند [8]. از طرف دیگر، ما مشاهده کردیم که نانوذره PEI متصلشده به الیگونوکلئوتیدی که هدف خاصی را دنبال نمیکند سمیت سلولی نداشته و درصد زندهمانی سلول تغییر نکرده است. این عدم سمیت توسط تصاویر میکروسکوپی نیز تأیید شد. نانوذره PEI به خاطر بار مثبت گروههای آمین که واکنشپذیر هستند منجر به آسیب سلولی میشود [17]. خنثی شدن بارهای مثبت گروههای آمین به واسطه برهمکنش توالی نوکلئوتیدی، قدرت واکنشپذیری PEI و درنتیجه سمیت آن را مهار میکند. به عبارت دیگر، ما نشان دادیم که سمیت PEI در فرایند انتقال ژن به واسطه اتصال توالی نوکلئوتیدی مهار شده و مشکلی ایجاد نمیکند.
نتیجهگیری
درمجموع، این مطالعه نشان داد اثر سمیت PEI بر سلولهای VSMC احتمالاً با اتصال توالی اولیگونوکلئوتید و درنتیجه خنثیسازی بارهای مثبت گروه آمین، مهار میشود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مقاله مورد تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی ایران قرار گرفته است (کد : IR.IUMS.FMD.REC.1397.067).
حامی مالی
این مقاله مرتبط با طرحی است که حامی مالی آن دانشگاه علومپزشکی ایران بوده است (کد طرح: 97-02-30-32997).
مشارکت نویسندگان
طراحی پروژه: فهیمه زمانی و قاسم قاسمپور؛ انجام پروژه: اصغر محمدی و فرهاد شیخنیا؛ آنالیز دادهها: محمد نجفی و فهیمه زمانی؛ نگارش مقاله: قاسم قاسمپور و فرهاد شیخنیا.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
امروزه جهت انتقال ژن به درون سلول از روشهای گوناگونی از قبیل وکتورهای ویروسی و غیرویروسی میتوان استفاده کرد [1]. وکتورهای ویروسی دارای بهترین کارایی و نتیجه در انتقال ژن هستند، اما معایبی مثل سمیت سلولی، القای پاسخ ایمنی، هزینه تولید بالا و محدودیت در اندازه ژن مورد انتقال را نیز دارند [2 ،1]. وکتورهای غیرویروسی شامل لیپیدهای کاتیونی (مانند لیپوفکتامین) و پلیمرهای کاتیونی، لیپوزومها و نانوپارتیکلها هستند. لیپوزومها به دلیل داشتن معایبی از جمله پایداری پایین، کارایی پایین و پاک شدن سریع از جریان خون، کاربردشان محدود شده است. در مقابل، پلیمرهای کاتیونی در مقایسه با وکتورهای ویروسی کمهزینهتر، دردسترستر و غیرپاتوژنیک بوده و از ایمنی بالاتری برخوردار هستند [4 ،3 ،1].
PEI یک پلیمر کاتیونی ارگانیک است که به واسطه داشتن تعداد زیاد گروههای آمین قابلیت پروتونه شدن دارد [3]. از دلایلی که از PEI به عنوان یکی از بهترین عوامل انتقال ژن استفاده میشود میتوان به موارد ذیل اشاره کرد: توانایی بالای آن در انتقال ژن به بسیاری از سلولها، سهولت ایجاد کمپلکس PEI/DNA، پایداری بالای آن حتی در 4 درجه سانتیگراد، ارزان و دسترس بودن طیف وسیعی از PEI با وزنهای مولکولی متفاوت، سازگاری بیولوژیکی خوب، ایمیونوژسیتی پایین و به واسطه داشتن گروههای آمین فعال تغییراتی از قبیل کونژوگاسیون یا کونژوگاسیون با پلی اتیلن گلیول روی آن به آسانی صورت میپذیرد. پلیمرهای PEI دارای وزنهای مولکولی متنوعی هستند که در برداشت و سمیت سلولی نقش مهمی دارند. مشتقات PEI با وزن مولکولی بالا علیرغم کارایی بالا در انتقال ژن، سمیت بالاتری نیز ایجاد میکنند [5].
پلیمرهای PEI شامل دو نوع شاخهدار (B) و خطی (L) هستند و وزن مولکولی ایدهآل PEI برای انتقال ژن بین 5 تا 25 کیلودالتون است. از میان این وزنهای مولکولی، PEI شاخهدار با وزن مولکولی 25 کیلودالتون بیشتر مورد استفاده قرار میگیرد [2]. سمیت سلولی PEI، علاوه بر وزن مولکولی، به درجه شاخهدار بودن، قدرت یونی محلول، پتانسیل زتا و اندازه پلیپلکس بستگی دارد [6]. سمیت سلولی PEI عموماً به دو فاز تقسیمبندی میشود: فاز I شامل ناپایداری غشا و تغییر موقعیت فسفاتیدیلسرین است و فاز II شامل آپوپتوز است که طی آن سیتوکروم c از میتوکندری آزاد شده و با فعالسازی کاسپاز3 فرایند آپوپتوز آغاز میشود [7 ،1]. همچنین مشخص شده است که این نانوذره باعث القای سمیت سلولی در سلولهای Neuro2A میشود، به صورتی که میزان بیان ژنهای Grp78 (Bip) ،Atf4 و Chop را افزایش میدهد [8]. PEI این قابلیت را دارد که با برهمکنشهای الکترواستاتیک به DNA متصل شود و تشکیل کمپلکس DNA/PEI را بدهد. اتصال این پلیپلکسها به سلول به دو روش وابسته و غیروابسته به گیرنده صورت میگیرد. در حالت بدون رسپتور، پلیمرهای کاتیونی به پروتئوگلیکانهای آنیونی متصل شده و سپس به داخل سلول وارد میشوند. مدیفیکاسیون وکتورها با لیگاندها یا آنتیبادیهای اختصاصی از قبیل ترانسفرین سبب ورود به سلول از طریق اندوسیتوز به واسطه گیرنده میشود. از جمله سایر لیگاندها میتوان به انسولین، فاکتور رشد مبدل، فولات و فاکتور رشد فیبروبلاستی اشاره کرد. ورود به سلول عمدتاً از دو طریق اندوسیتوز وابسته به کلاترین یا کاوئول (Caveola) صورت میپذیرد. پس از ورود به اندوزوم و پمپ شدن پروتون به آن، به خاطر خاصیت PEI در بافر کردن pH، سبب تجمع پروتون در اندوزوم شده که باعث تورم اسموتیک و پارگی اندوزوم میشود که به آن «اثر اسفنجی پروتون» گفته میشود [5 ،4]. سمیت سلولی ایجادشده در اثر PEI به لحاظ زمانی نیز به دو نوع سریع و کند تقسیمبندی میشود. نوع سریع آن در رابطه با PEI آزاد است که در این حالت PEI با پروتئینهای سرم دارای بار منفی مثل آلبومین واکنش داده و تشکیل رسوب میدهد که به سطح سلولها متصل شده و باعث ناپایداری غشا میشود. PEGylation یکی از راهکارهای مقابله با این وضعیت است. نوع کند به آزاد شدن DNA از PEI مرتبط است. در این حالت PEI با اجزای سلولی برهمکنش داده و مانع از انجام پروسههای طبیعی سلول میشود. چروکیدگی سلول، کاهش تعداد میتوز و واکوئولیزاسیون سیتوپلاسم از وقایع این مرحله است [6]. در این مطالعه اثر سمیت نانوذره PEI بر سلولهای عضله صاف مورد مطالعه قرار گرفت.
روش بررسی
سلولهای عضله صاف عروق (VSMC C591) از مؤسسه پاستور (ایران، تهران) تهیه و در محیط کشت DMEM F-12 حاوی FBS 10% (Gibco) و pen-strp 1% (Sigma-Aldrich, USA) کشت شدند. سلولهای کشتشده در شرایط نرمال (دمای 37 درجه سانتیگراد، دیاکسیدکربن 5 درصد و رطوبت 95 درصد) در انکوباتور نگهداری شدند.
ترانسفکشن با نانوذره
ابتدا سلولهای کشتشده به دو گروه تقسیم شدند، به طوری که گروه اول با نانوذره (25kDa) PEI خالی و گروه دوم با نانوذره PEI حاوی یک توالی نوکلئوتیدی بیمعنا ترانسفکت شدند. برای انجام ترانسفکت، ابتدا نانوذره PEI به دو صورت محلول خالی و محلول همراه با توالی الیگونوکلئوتیدی آماده شد. در گروه نانوذره حاوی توالی الیگونوکلئوتیدی از نسبت نیتروژن به فسفر 20 (20=N/P) استفاده شد. نیتروژن و فسفر به ترتیب اشاره به گروههای آمین موجود در نانوذره و گروههای فسفات توالی الیگونوکلئوتیدی دارند. سپس سلولها به مدت 4 ساعت در محیط کشت حاوی نانوذره خالی یا نانوذره حاوی الیگونوکلئوتید در انکوباتور نگهداری شدند. آنگاه، محیط کشت سلولها با محیط تازه تعویض و به مدت 24 ساعت در شرایط نرمال در انکوباتور حفظ شدند [10 ،9].
میکروسکوپ فلورسنت
برای مشاهده میکروسکوپی کارایی PEI در ترانسفکشن، از الیگونوکلئوتید متصلشده به فلوئورسین ایزوتیوسیانات به عنوان انتشاردهنده فلورسانس سبز استفاده شد. پس از ترانسفکشن سلولی توسط PEI حاوی الیگونوکلئوتید متصل به FITC، سلولها در شرایط طبیعی به مدت 4 ساعت در دستگاه انکوباتور نگهداری شدند. سپس توسط بافر فسفات سالین شسته و توسط میکروسکوپ Olympus IX71 تصویربرداری شدند.
میکروسکوپ الکترونی
سلولهای ترانسفکتشده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (LEO 906; Zeiss) مورد بررسی قرار گرفتند. برای این کار ابتدا سلولهای ترانسفکتشده با PBS شسته و تثبیت اولیه در گلوتارآلدئید 5/2 درصد به مدت 2 ساعت انجام شد. سپس، سلولها سه بار با استفاده از PBS شستوشو داده شدند تا گلوتارآلدئید اضافی از بین برود. پس از آن، سلولها به مدت 5/1 ساعت در 1 درصد اسمیم غوطهور شدند. سپس دهیدراسیون کردن سلولها در غلظتهای متفاوت استون (50، 70، 90 و 100 درصد) صورت گرفت و سلولها در رزین خالص ثابت شدند. سرانجام، برشهای نازک (50 نانومتر) برای میکروسکوپ الکترونی تهیه شد و گریدهای بدون پوشش 200 مش استفاده شد. نانوذرات منفرد همچنین با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روی شبکههای مسی با پوشش کربن مورد بررسی قرار گرفتند [11].
تست MTT
در یک پلیت 96 خانه، 5000 سلول VSMC به ازای هر چاهک کشت شدند و بعد از آمادهسازی محلول نانوذره چه به صورت تنها و چه همراه با توالی الیگونوکلئوتیدی، سلولها به مدت 4 ساعت در معرض این محلولها قرار گرفتند. سپس محیط کشت سلولها با محیط کشت تازه جایگزین شد و سلولها 24 ساعت در انکوباتور نگهداری شدند [9]. پس از 24 ساعت نگهداری در انکوباتور، سلولها به مدت 2 ساعت در محلول MTT 5/0 میلیگرم بر میلیلیتر انکوبه شدند، سپس محیط رویی برداشته و به هر چاهک 100 میکرولیتر DMSO (دیمتیل سولفوکسید) اضافه شد که سبب حل شدن کریستالهای تشکیلشده فورمازان میشود. پس از 15 دقیقه شیک ملایم، میزان جذب نوری رنگ تشکیلشده، در طول موج 570 نانومتر اندازهگیری شد [12].
آنالیز آماری
در این مطالعه برای آنالیز دادهها از نرمافزار گراف پدپریزم (نسخه 8) و آزمونهای آنالیز واریانس یکطرفه و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. دادههای با p کمتر از 05/0 معنیدار در نظر گرفته شدند. شاخصها به صورت میانگین همراه با انحرافمعیار گزارش شدند.
یافتهها
ارزیابی کارایی ترانسفکشن سلولی با میکروسکوپ فلورسنت
تصاویر میکروسکوپی فلورسنت نشان داد PEI با کارایی بالایی سبب انتقال توالی الیگونوکلئوتید به سلولهای VSMC میشود (تصویر شماره 1).
میزان زندهمانی سلول
همانطور که تصویر شماره 2 نشان میدهد، نانوذره خالی (PEI) در مقایسه با گروه کنترل به صورت معنیداری میزان زندهمانی سلول را کاهش داده است (0001/p<0). اما زندهمانی سلول در گروه نانوذره حاوی الیگونوکلئوتید بیمعنا (PEI + Scramble) نسبت به گروه کنترل دستخوش تغییر معنیداری نشده است (7414/0=p). از طرفی نشان داده شده است که میزان زندهمانی سلولها در گروه نانوذره حاوی الیگونوکلئوتید به میزان معنیداری بالاتر از گروه نانوذره خالی است (0002/0=p). میانگین همراه با انحرافمعیار زندهمانی سلولها در گروه کنترل برابر با 6/8±2/98، در گروه نانوذره برابر با 5/6±9/62 و در گروه PEI + scramble برابر با 4/2±42/98 درصد بود.
تصاویر میکروسکوپ الکترونی
تصاویر حاصل از میکروسکوپ الکترونی نشان میدهد که سلولهای ترانسفکتشده با نانوذره خالی واکوئله شده و نشاندهنده القای مسیر آپوپتوز در سلولهای تیمارشده با نانوذره پلیاتیلن ایمین است (تصویر شماره 3 ج). در حالی که سلولهای ترانسفکتشده با نانوذره حاوی الیگونوکلئوتید بیمعنا دچار آپوپتوز نشده و ظاهری نرمال دارند (تصویر شماره 3 د).
بحث
انتقال ژنها به داخل سلول به دو روش ویروسی و غیرویروسی انجام میشود. روش غیرویروسی مزایای خاصی نسبت به وکتورهای ویروسی دارد، چون در روش ویروسی امکان ایجاد سمیت سلولی، محدودیت در اندازه ژن، ایجاد پاسخهای ایمنی، هزینه بالا و پتانسیل ایجاد پاسخهای ایمنی وجود دارد. علاوه بر این، وکتورهای ویروسی امکان ایجاد جهش و تبدیل سلولها به حالت سرطانی را دارند [13]. وکتورهای غیرویروسی از قبیل لیپیدهای کاتیونی (مانند لیپوفکتامین) و پلیمرهای کاتیونی همانند PEI جایگزین امیدوارکنندهای بوده و مزایایی از جمله آمادهسازی، تولید، تخلیص و تغییرات شیمیایی آسان، پاسخ ایمنی کمتر در مقابل وکتور ویروسی و پایداری بالاتری دارند [4 ،3 ،1]. PEI به واسطه داشتن تعداد زیاد بار مثبت در گروههای آمین خود با بارهای منفی اسیدهای نوکلوئیک واکنش الکتروستاتیک برقرار کرده و بدینترتیب سبب سهولت انتقال ژنها میشود. از ویژگیهای اصلی PEI که موجب انتقال ژن با کارایی بالا شده است میتوان به مواردی از قبیل انتقال ژنها در طیف وسیعی از سلولها و سهولت در ایجاد کمپلکس PEI/DNA اشاره کرد [5].
تا کنون مطالعات مختلفی به بررسی اثر سمیت و زندهمانی سلول توسط PEI پرداختهاند. بورچارد و همکاران زندهمانی سلول و کارایی انتقال ژن توسط PEI را در ردههای سلولی مختلف مورد مطالعه قرار دادند. آنها نشان دادند کارایی PEI در انتقال ژن و سمیت آن در ردههای سلولی مختلف، متفاوت است [14]. وانگ و همکاران نشان دادند میزان زندهمانی سلول و کارایی انتقال ژن توسط PEI (تغییریافته) با وزن مولکولی پایین افزایش مییابد [15]. رضایی و همکاران جهت انتقال ژن توسط PEI با کارایی بالا و سمیت سلولی پایین، از PEI با وزن مولکولی بالا و تغییریافته توسط یک زنجیره کربنی استفاده کردند و ثابت نمودند که بهترین نتیجه در PEI تغییریافته با زنجیره کربنی (10C) حاصل میشود [16]. همراستا با گزارش توماس و کلیبانو [17]، ما نیز در این مطالعه نشان دادیم که سمیت PEI سبب از بین رفتن 35 درصد سلولها شده است. تصاویر میکروسکوپ الکترونی نشان داد این سمیت از طریق واکوئله شدن سلول و درنهایت آپوپتوز ایجاد میشود. احتمالاً اثرگذاری نانوذره PEI بر القای مسیر آپوپتوز به صورتی است که ابتدا با ناپایداری غشا و سپس با آزادسازی سیتوکروم c از میتوکندری و متعاقباً فعالسازی کاسپاز3 منجر به فعالسازی آپوپتوز میشود [7 ،1]. همچنین این نانوذره به واسطه افزایش بیان ژنهایی همانند Atf4 و Chop در القای آپوپتوز میتواند نقش مهمی ایفا کند [8]. از طرف دیگر، ما مشاهده کردیم که نانوذره PEI متصلشده به الیگونوکلئوتیدی که هدف خاصی را دنبال نمیکند سمیت سلولی نداشته و درصد زندهمانی سلول تغییر نکرده است. این عدم سمیت توسط تصاویر میکروسکوپی نیز تأیید شد. نانوذره PEI به خاطر بار مثبت گروههای آمین که واکنشپذیر هستند منجر به آسیب سلولی میشود [17]. خنثی شدن بارهای مثبت گروههای آمین به واسطه برهمکنش توالی نوکلئوتیدی، قدرت واکنشپذیری PEI و درنتیجه سمیت آن را مهار میکند. به عبارت دیگر، ما نشان دادیم که سمیت PEI در فرایند انتقال ژن به واسطه اتصال توالی نوکلئوتیدی مهار شده و مشکلی ایجاد نمیکند.
نتیجهگیری
درمجموع، این مطالعه نشان داد اثر سمیت PEI بر سلولهای VSMC احتمالاً با اتصال توالی اولیگونوکلئوتید و درنتیجه خنثیسازی بارهای مثبت گروه آمین، مهار میشود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مقاله مورد تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی ایران قرار گرفته است (کد : IR.IUMS.FMD.REC.1397.067).
حامی مالی
این مقاله مرتبط با طرحی است که حامی مالی آن دانشگاه علومپزشکی ایران بوده است (کد طرح: 97-02-30-32997).
مشارکت نویسندگان
طراحی پروژه: فهیمه زمانی و قاسم قاسمپور؛ انجام پروژه: اصغر محمدی و فرهاد شیخنیا؛ آنالیز دادهها: محمد نجفی و فهیمه زمانی؛ نگارش مقاله: قاسم قاسمپور و فرهاد شیخنیا.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
علوم پایه
دریافت: 1400/2/30 | پذیرش: 1400/6/10 | انتشار: 1400/6/10
دریافت: 1400/2/30 | پذیرش: 1400/6/10 | انتشار: 1400/6/10
فهرست منابع
1. Pishavar E, Shafiei M, Mehri S, Ramezani M, Abnous K. The effects of polyethylenimine/DNA nanoparticle on transcript levels of apoptosis-related genes. Drug Chem Toxicol. 2017; 40(4):406-9. [PMID] [DOI:10.1080/01480545.2016.1245318]
2. Craciun BF, Gavril G, Peptanariu D, Ursu LE, Clima L, Pinteala M. Synergistic effect of low molecular weight polyethylenimine and polyethylene glycol components in dynamic nonviral vector structure, toxicity, and transfection efficiency. Molecules. 2019; 24(8):1460. [DOI:10.3390/molecules24081460] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/molecules24081460]
3. Vancha AR, Govindaraju S, Parsa KV, Jasti M, González-García M, Ballestero RP. Use of polyethyleneimine polymer in cell culture as attachment factor and lipofection enhancer. BMC Biotechnol. 2004; 4:23. [DOI:10.1186/1472-6750-4-23] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/1472-6750-4-23]
4. Kuo WT, Huang HY, Huang YY. Intracellular trafficking, metabolism and toxicity of current gene carriers. Curr Drug Metab. 2009; 10(8):885-94. [PMID] [DOI:10.2174/138920009790274504]
5. Neuberg P, Kichler A. Recent developments in nucleic acid delivery with polyethylenimines. Adv Genet. 2014; 88:263-88. [DOI:10.1016/B978-0-12-800148-6.00009-2] [PMID] [DOI:10.1016/B978-0-12-800148-6.00009-2]
6. Lv H, Zhang S, Wang B, Cui S, Yan J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. J Control Release. 2006; 114(1):100-9. [DOI:10.1016/j.jconrel.2006.04.014] [PMID] [DOI:10.1016/j.jconrel.2006.04.014]
7. Godbey WT, Wu KK, Mikos AG. Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery. J Control Release. 1999; 60(2-3):149-60. [DOI:10.1016/S0168-3659(99)00090-5] [DOI:10.1016/S0168-3659(99)00090-5]
8. Dabbaghi M, Kazemi Oskuee R, Hashemi K, Afkhami Goli A. Evaluating polyethyleneimine/DNA nanoparticles-mediated damage to cellular organelles using endoplasmic reticulum stress profile. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2018; 46(1):192-9. [PMID] [DOI:10.1080/21691401.2017.1304406]
9. Valente JFA, Pereira P, Sousa A, Queiroz JA, Sousa F. Effect of plasmid DNA size on chitosan or polyethyleneimine polyplexes formulation. Polymers. 2021; 13(5):793. [DOI:10.3390/polym13050793] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/polym13050793]
10. Ghasempour G, Mohammadi A, Zamani-Garmsiri F, Najafi M. miRNAs through β-ARR2/p-ERK1/2 pathway regulate the VSMC proliferation and migration. Life Sci. 2021; 279:119703. [DOI:10.1016/j.lfs.2021.119703] [PMID] [DOI:10.1016/j.lfs.2021.119703]
11. Ghasempour G, Mahabadi VP, Shabani M, Mohammadi A, Zamani-Garmsiri F, Amirfarhangi A, et al. miR-181b and miR-204 suppress the VSMC proliferation and migration by downregulation of HCK. Microvasc Res. 2021; 136:104172. [DOI:10.1016/j.mvr.2021.104172] [PMID] [DOI:10.1016/j.mvr.2021.104172]
12. Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018; 2018(6). [DOI:10.1101/pdb.prot095505] [PMID] [DOI:10.1101/pdb.prot095505]
13. Hao F, Li Y, Zhu J, Sun J, Marshall B, Lee RJ, et al. Polyethylenimine-based formulations for delivery of oligonucleotides. Curr Med Chem. 2019; 26(13):2264-84. [PMID] [DOI:10.2174/0929867325666181031094759]
14. Florea BI, Meaney C, Junginger HE, Borchard G. Transfection efficiency and toxicity of polyethylenimine in differentiated Calu-3 and nondifferentiated COS-1 cell cultures. AAPS PharmSci. 2002; 4(3):E12. [DOI:10.1208/ps040312] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1208/ps040312]
15. Wang M, Lu P, Wu B, Tucker JD, Cloer C, Lu Q. High efficiency and low toxicity of polyethyleneimine modified pluronics (PEI-pluronic) as gene delivery carriers in cell culture and dystrophic mdx mice. J Mater Chem. 2012; 22(13):6038-46. [DOI:10.1039/c2jm15625c] [DOI:10.1039/c2jm15625c]
16. Rezaee M, Gholami L, Gildeh MS, Ramezani M, Oskuee RK. Charge reduction: An efficient strategy to reduce toxicity and increase the transfection efficiency of high molecular weight polyethylenimine. J Pharm Investig. 2019; 49(1):105-14. [DOI:10.1007/s40005-018-0388-2] [DOI:10.1007/s40005-018-0388-2]
17. Thomas M, Klibanov AM. Enhancing polyethylenimine's delivery of plasmid DNA into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99(23):14640-5. [DOI:10.1073/pnas.192581499] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1073/pnas.192581499]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
