دوره 15، شماره 9 - ( آذر 1400 )
جلد 15 شماره 9 صفحات 617-606 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Borhani S S, Heidarieh N, Hayati Roodbari N, Roshanaei K. Effects of Levofloxacin on Expression of Apoptosis Genes of Ovarian Follicles in NMRI Mouse in Vitro and in Vivo. Qom Univ Med Sci J 2021; 15 (9) :606-617
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3207-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3207-fa.html
برهانی صدیقه سادات، حیدریه نسرین، حیاتی رودباری نسیم، روشنایی کامبیز. بررسی اثرات آنتیبیوتیک لووفلوکساسین بر میزان بیان ژنهای آپوپتوز در فولیکولهای تخمدان موش نژاد NMRI در شرایط برونتنی و درونتنی. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1400; 15 (9) :606-617
1- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه ، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه ، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران
2- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه ، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران
واژههای کلیدی: لووفلوکساسین، آپوپتوز، تخمدان، سرطان تخمدان، ژن Bax، ژن Bcl-2
متن کامل [PDF 6463 kb]
(487 دریافت)
| چکیده (HTML) (2089 مشاهده)
متن کامل: (323 مشاهده)
مقدمه
از میان بسیاری از اندامها که در دوران جنینی در معرض آپوپتوز قرار میگیرند، گنادهای ماده بهطور ممتد بیشترین آپوپتوز را داشته که همراه با تکمیل و بلوغ جرم لاین صورت میگیرد. جرم سلهای ماده اووسیت به شدت آسیبپذیر هستند، بهخصوص در شرایط پاتولوژیک، مانند درمانهای ضدسرطان که درنهایت باعث نارسایی زودرس تخمدان و ناباروری ناشی از مرگ تسریعشده اووسیتها میشود. تلاشها برای درک وقوع و تنظیم آپوپتوز در تخمدان، هم از نظر بیولوژیک و هم کلینیکال اهمیت دارد [1].
فلوروکینولونها به عنوان آنتیبیوتیکهای پراستفاده در دهههای اخیر، بسیار مورد توجه محققین قرار گرفتهاند. اگرچه استفاده از آنتیبیوتیکها رو به افزایش است، اما آسیبهای احتمالی آنها نیز باید در نظر گرفته شود. فلوروکینولونها به علت تواناییشان در مهار همانندسازی و رونویسی دیاِناِی باکتریها از طریق هدفگیری دیاِناِی ژیراز یا توپوایزومراز نوع 2 بسیار شناختهشده هستند.
حضور هر دو آنزیم برای رشد باکتری ضروری است. از آنجا که هر دو آنزیم از همتایشان در پستانداران بسیار متفاوت هستند، فلوروکینولونها نسبت به باکتریها هزاران بار حساستر هستند [2]. آنتیبیوتیک لووفلوکساسین از انواع فلوروکینولونها است. سیپروفلوکساسین، لووفلوکساسین، موکسیفلوکساسین و جمیفلوکساسین قادرند عفونتهای ادراری را در دوران بارداری کاملاً موفقیتآمیز درمان کنند، اما استفاده از آنتیبیوتیکها در دوران بارداری، اثرات تراتوژنیک بر جنین دارد [3].
اثرات تخریبی برخی از فلوروکینولونها مانند سیپروفلوکساسین بر دستگاه تناسلی نر و ماده اثبات شده است [4]. آنتیبیوتیکهای فلوروکینولون، ازجمله لووفلوکساسین، اثرات ضدتکثیر سلولی، بهخصوص در انواع سل لاینهای سرطانی از خود نشان دادهاند [7-5]. یکی از سازوکارهای ضدتکثیر سلولی فلوروکینولونها اثر بر عوامل مسیر آپوپتوز است. پروتئین Bcl-2 به عنوان یک پروتواونکوژن در سلولهای ژرمینال در تنظیم فرایند آپوپتوز سلولی دخالت میکند. دو خانواده بزرگ ژنی Bcl-2 و Caspases در مسیر آپوپتوز درگیر هستند. خانواده Bcl-2 دو گروه پروتئینی پیشبرنده آپوپتوز و مهارکننده آپوپتوز دارد. نسبت متوسط این پروتئینها سرنوشت یک سلول را تعیین میکند [8].
پروتئین Bcl-2 یک مولکول Prosurvival است. این پروتئین غشایی در پوشش هسته و میتوکندری قرار گرفته است و از طریق اتصال به BAX وظیفه خود را انجام میدهد [9]. پروتئین BAG1 از اعضای آنتیآپوپتوز خانواده Bcl-2 بوده و آپوپتوز را مهار میکند. پروتئین BAX از نظر ساختاری هومولوگ Bcl-2 بوده و پیشبرنده آپوپتوز است که در سیتوپلاسم یا غشای سلولی قرار میگیرد؛ بنابراین از نظر عملکردی این پروتئین آنتاگونسیت نقش حفاظتی Bcl-2 است [10].
سیگنالهای مرگ، سبب راهاندازی پروتئینهای آپوپتوزی خانواده Bcl-2، بهویژه BAX میشوند [11]. این پروتئینها موجب تراوش سیتوکروم C از میتوکندری به بیرون میشوند. سیتوکرومC آزاد شده و فاکتور فعالکننده پروتئاز آپوپتوزی Apaf-1 به کاسپاز 9 متصل شده و آبشار کاسپازی را فعال میکند که منجر به مرگ سلولی خواهد شد [12].
از آنجا که تاکنون اثرات احتمالی آنتیبیوتیک لووفلوکساسین بر آپوپتوز فولیکولهای تخمدان بررسی نشده است و با توجه به اهمیت و مصرف زیاد آنتیبیوتیکها، ازجمله لووفلوکساسین، در مطالعه حاضر به تعیین اثرات احتمالی این دارو بر آپوپتوز فولیکولهای تخمدان پرداخته شد.
روش بررسی
این پژوهش در حیوانخانه دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم انجام شد. تعداد شصت سر موش سوری ماده 8-6 هفته نژاد NMRI با محدوده وزنی 30-25 گرم از انستیتو پاستور ایران خریداری شد. موشها در شرایط استاندارد دمایی 2±29 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 48-45 درصد و سیکل دوازده ساعت تاریکی و دوازده ساعت روشنایی با دسترسی آزاد به پلت و آب شیرین قرار گرفتند. حیوانات بهطور تصادفی به دو گروه سی تایی درونتنی و برونتنی تقسیم شدند. گروه درونتنی به پنج گروه شش تایی تقسیم شدند، که شامل:
گروه کنترل
بدون دریافت آنتیبیوتیک لووفلوکساسین و گروههای آزمایش صد، دویست، چهارصد و هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن که روزانه آنتیبیوتیک را به صورت گاواژ به مدت 24 روز دریافت کردند. تخمدانها جدا شد. سپس مطالعات بافتشناسی و آنالیز آزمایش پی سی آر کرونا Real Time PCR به منظور تعیین بیان ژنی BAX و Bcl-2 بر آنها انجام گرفت. گروه برونتنی نیز به پنج گروه شش تایی تقسیم شده و سپس حیوانات تشریح شدند که بلافاصله تخمدانها جدا شده و به صورت گروههای زیر کشت شدند. در گروه کنترل بدون اضافه کردن آنتیبیوتیک لووفلوکساسین به محیط کشت و در گروههای آزمایش یک، دو، پنج و ده میکروگرم در میلیلیتر به ترتیب همین میزان از آنتیبیوتیک به محیط کشت پایه تخمدانها افزوده شد. سپس مطالعات بافتشناسی و آنالیز Real Time PCR به منظور تعیین بیان ژنی BAX و Bcl-2 بر آنها انجام گرفت. آنتی بیوتیک لووفلوکساسین از از شرکت سیگما و آلدریچ آمریکا تهیه شده است.
کشت تخمدان
همه محلولها و وسایل مورد استفاده در کشت، استریل شدند. تخمدانها از موشهای ماده جدا و پس از جدا کردن چربی از آنها و دو بار شستوشو در محلول نمکی بالانسشده هنکس به ظروف مخصوص کشت اندام، منتقل شد. محیط کشت مصرفی شامل DMEM F12 و α-MEM به نسبت مساوی که به آن سه میلیگرم بر میلیلیتر BSA، 23/0 میلیمولار اسید پیرویک و۱ درصد پنیسیلسن-استرپتومایسین اضافه و توسط فیلتر سر سرنگی استریل شد. pH محیط کشت نیز در حد 4/7 تنظیم شد. تخمدانها درون انکوباتور دیاکسیدکربن 5 درصد و 95 درصد هوا در دمای 5/0±37 درجه سانتیگراد به مدت شش روز انکوبه شدند. محیط کشت به صورت روزانه تعویض شد.
مطالعه بافتشناسی
پس از خارج کردن تخمدانهای گروه کنترل و تیمار تحت کشت در گروه برونتنی و همچنین تخمدانهای گروه درونی پس از تشریح حیوان، در محلول بوئن فیکس شدند، سپس مراحل آبگیری و قالبگیری با پارافین و برشگیری انجام شد. برشها به صورت سریالی روی لام فیکس شدند. با توجه به اینکه اندازه هر فولیکول بالغ 25 میکرومتر است، از طرفی ضخامت برش هر نمونه پنج میکرومتر در نظر گرفته شد؛ بنابراین هر پنج مقطع به صورت متناوب روی لام قرار گرفت و بعد از آمادهسازی آن، نمونهها به روش رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین انجام شدند. از مقاطع میکروسکوپی عکسبرداری شد و ارزیابی میکروسکوپی اندازه سلولهای تکا و گرانولوزا، طول و عرض تخمدان و شمارش فولیکولهای سالم و آسیبدیده تخمدان، تحت رنگآمیزی هماتوکسیلین ـ ائوزین، توسط نرمافزار Image J انجام شد.
مطالعات مولکولی
جهت بررسی بیان ژنهای BAX و Bcl-2 از روش Real Time PCR استفاده شد. در این روش ابتدا استخراج RNA از بافت تخمدانها توسط کیت شرکت GeneAll انجام شد. تعیین کمیت و خلوص RNA با استفاده از دستگاه نانودراپ که به مقدار بسیار کمی از RNA در حد نانوگرم نیاز دارد، انجام شد. برای تعیین کیفیت RNA استخراجشده از روش الکتروفورز استفاده شد. به منظور بررسی RNA ژنومیک استخراجشده، نمونه حاصل روی ژل آگارز 1 درصد، الکتروفورز شد. بعد از انجام استخراج، سنتز دیانای مکمل با استفاده از کیت HyperScriptTM RT premix (with Random hexamer) شرکت GeneAll انجام شد. با استفاده از پرایمرهای طراحیشده واکنش زنجیرهای پلیمراز انجام گرفت. پس از اتمام تست و به دست آوردن CTهای ژن رفرنس و ژن مورد نظر از روش ΔΔCT برای محاسبه میزان بیان ژن استفاده شد. میزان بیان هرکدام از ژنها با ژن کنترل داخلی GAPDH مقایسه شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده در زیر آورده شده است:
BAX (F) TTCACAGGTTGGCATTAGG
(R) TCAGCCCATCTTCTTCCAG
Bcl-2 (F) CCCTTCGGAGTTTAATCAGA
(R) CCTTCTTCTCGGCAATTTAC
GAPDH (F) AAGGTCATCCCAGAGCTGAA
(R) CTGCTTCACCACCTTCTTGA
ارزیابی آماری دادهها
دادههای این مطالعه به صورت میانگین و انحراف معیار بیان شد. برای آنالیز آماری و مقایسه بین گروههای مختلف از روش آنالیز واریانس یکطرفه و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. در تمام محاسبات 05/P<0 از لحاظ آماری، معنادار در نظر گرفته شد.
یافتهها
نتایج تغییرات هیستولوژیکی القاشده توسط غلظتهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین بر بافت تخمدان سوری، گروه برونتنی
فوتومیکروگراف بافت تخمدان در گروههای برونتنی تحت تیمار با دُزهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین نشان داد که تعداد فولیکولهای اولیه و ثانویه کاهش پیدا کرده، در حالی که با افزایش فولیکولهای بالغ مواجه شدیم (تصویر شماره 1 الف و ب). در دُز دو میکروگرم بر میلیلیتر، تعداد فولیکولهای اولیه بیشترین کاهش را داشت. میان گروه دارویی با غلظت دو میکروگرم بر میلیلیتر و گروه کنترل، اختلاف معناداری در سطح 01/0 و نیز میان همین گروه و گروه ده میکروگرم بر میلیلیتر اختلاف معناداری در سطح 05/0 وجود دارد و تعداد سلولها کاهش یافته است (تصویر شماره 1 الف).
همچنین در دُز پنج میکروگرم بر میلیلیتر ، هم فولیکول اولیه و هم ثانویه بیشترین کاهش تعداد را نشان دادند، در حالی که دُز ده میکروگرم بر میلیلیتر بیشترین افزایش تعداد فولیکولهای بالغ را داشت (تصویر شماره 1 ج). اندازه لایه تکا تغییر معناداری نداشت (تصویر شماره 1 د)، ولی اندازه لایه گرانولوزا در غلظت پنج میکروگرم بر میلیلیتر کاهش معنادار را نشان داد که این نتایج نشاندهنده آسیب بافتی تخمدان به صورت کاهش تعداد فولیکولهای اولیه و ثانویه و همچنین کاهش اندازه لایه گرانولوزا است (تصویر شماره 2).
نتایج تغییرات هیستولوژیکی القاشده توسط غلظتهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین بر بافت تخمدان سوری، گروه درونتنی
فوتومیکروگراف بافت تخمدان در گروههای درونتنی تحت تیمار با غلظتهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین نشان داد که تعداد فولیکولهای اولیه و ثانویه و بالغ و همچنین تعداد جسم زرد در گروه هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم بیشترین کاهش را نشان داد (تصویر شماره 3 الف، ب و ج - تصویر شماره 4 الف).
این در حالی بود که در دُز هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم با بیشترین افزایش فولیکولهای آترتیک روبهرو شدیم (تصویر شماره 3 د). اندازه لایه تکا و گرانولوزا بهطور معناداری کاهش پیدا کرد (تصویر شماره 4 ب و ج). طول تخمدان نیز بهطور وابسته به دُز کاهش معناداری نسبت به گروه کنترل داشت (تصویرشماره 4 د). در پارانشیم تخمدان در گروه دویست میلیگرم بر کیلوگرم کاملاً افزایش رگهای خونی مشاهده شد (تصویر شماره 5 ب) که این اثرگذاری لووفلوکساسین در گروههای چهارصد و هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم به صورت افزایش فولیکولهای آترتیک مشاهده شد (تصویر شماره 5 ج و د) که این نتایج نشاندهنده آسیبپذیری قابل توجه بافت تخمدان در دُز هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم از آنتیبیوتیک لووفلوکساسین است (تصویر شماره 5).
تغییرات بیان ژنهای BAX و Bcl-2 در گروه برونتنی
نتایج تجربیات حاضر نشان داد که سطح بیان ژن BAX در سلولهای تخمدان تحت تیمار با دُزهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین، با افزایش غلظت آنتیبیوتیک،کاهش معناداری دارد، در حالی که سطح بیان ژن Bcl-2، با افزایش غلظت آنتیبیوتیک لووفلوکساسین، افزایش معنادار را نشان داد (تصویر شماره 6 الف).
تغییرات بیان ژنهای BAX و Bcl-2 در گروه درونتنی
نتایج تغییرات بیان ژنهای BAX و Bcl-2 در گروه درونتنی در سلولهای تخمدان به این صورت است که با افزایش غلظت آنتیبیوتیک لووفلوکساسین میزان بیان ژنهای BAX و Bcl-2 افزایش معنادار را نشان داد (تصویر شماره 6 ب).
بحث
آپوپتوز نقش مهمی در برخی فرایندهای فیزیولوژیک و همچنین شرایط پاتولوژیک دارد [13]. یکی از این فرایندها آترزی فولیکولی در تخمدان است که دخالت آپوپتوز در این فرایند به اثبات رسیده است. آترزی فولیکولی یک فرایند وابسته به مراحل تکوینی است که قسمت عمده آن در مرحله انتقالی بین فولیکولهای پره آنترال و شروع تشکیل آنتروم و در طول تکوین فولیکولهای تخمدانی اتفاق میافتد. آترزی فولیکولی با آپوپتوز سلولهای گرانولوزای فولیکولی آغاز شده و سپس دیگر ترکیبات فولیکولی دچار مرگ میشوند [15 ،14].
نشانههایی از القای آپوپتوز توسط آنتیبیوتیکهای فلوروکینولون در مطالعات مختلف یافت شده است. همچنین مطالعاتی در سالهای 2001 و 1997 ابراز کرده بودند که داروهای سیتوتوکسیک احتمالاً سیگنالهای القاکننده آپوپتوز را فعال میکنند، زیرا هم بیان BAX و هم آپوپتوز را از طریق گیرنده هیدروکربنی آروماتیکی در اووسیتهای موش افزایش میدهند [17 ،16].
ثابت شده است که در موشهای ترانسژنیک که Bcl-2 در تخمدان آنها بیش بیان شده بود، مهار آپوپتوز سلول فولیکولار و افزایش فولیکولوژنزیس دیده شد که نشاندهنده این است که سیستم Bcl-2 در تخمدان عمل میکند [18]. در این راستا نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در تخمدانهای گروه برونتنی سطح بیان ژن BAX در سلولهای تخمدان تحت تیمار با دُزهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین (غلظتهای یک، دو، پنج و ده میکروگرم بر میلیلیتر)، با افزایش غلظت آنتیبیوتیک، کاهش معناداری دارد، در حالی که سطح بیان ژن Bcl-2 افزایش معنادار را نشان داد که میتواند بیانکننده نقش Bcl-2 در سرکوب آپوپتوز در سلولها و افزایش بقای سلولها در حضور آنتیبیوتیک لووفلوکساسین باشد.
از سویی در مطالعه حاضر، تغییرات بیان ژنهایBAX و Bcl2 در تخمدانهای گروه درونتنی با افزایش دُز آنتیبیوتیک لووفلوکساسین (غلظتهای صد، دویست، چهارصد و هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم) افزایش معنادار هر دو ژن را نشان داد. در این پژوهش مشاهده شد که با افزایش غلظت آنتیبیوتیک لووفلوکساسین، بیان BAX در گروه برونتنی کاهش پیدا میکند، در حالی که در گروه درونتنی افزایش معنادار داشت که نشاندهنده احتمال اثر آپوپتوزی این آنتیبیوتیک در شرایط درونتنی است.
در تأیید نتایج سیتوتوکسیک آنتیبیوتیکها، بروک و همکارانش بر سلولهای ملانومای COLO829 نشان دادند که تیمار با لومفلوکساسین بقای سلولی را از طریق شکست غشای میتوکندریایی در روشی وابسته به دُز و زمان در فاز S و G2/M با مهار توپوایزومرازاز نوع ۲ کاهش میدهد [19].
همراستا با مطالعه حاضر در فعال شدن مسیر میتوکندریایی آپوپتوز، یانگ و همکاران نشان دادند که لووفلوکساسین با کاهش کلاژن نوع 2 در سلولهای هسته پالپوسوس موش صحرایی در شرایط آزمایشگاهی از طریق فعالسازی مسیر BAX/Bcl-2/caspase3، اثرات محرومیت از سرم را بر Anoikis افزایش میدهد [20]. همچنین گزارشهای زیادی در سالهای اخیر نشاندهنده خاصیت ضدسرطانی فلوروکینولونها بوده که در آنها نیز افزایش بیان BAX دیده شده است، به طوری که ثابت کردند که فلوروکینولونها از خاصیت آنتیبیوتیکی به خاصیت ضدسرطانی تغییر مسیر دادهاند [13].
همچنین مطالعه سایکوفسکی و همکاران نشان داد که سیپروفلوکساسین تکثیر سلولهای Jurkat را در فاز G2/M چرخه سلولی با تأثیر منفی بر تشکیل دوکهای میتوزی و القای آنیوپلوئیدی مهار میکند و میتواند باعث بروز آپوپتوز شود [21].
بنابراین با وجود افزایش پروتئین BAX در گروه درونتنی میتوان این گونه اثبات کرد که از آنجا که افزایش سطوح Bcl2 چه در شرایط برون و درونتنی دیده میشود، میتوان احتمال داد اثرات سیتوتوکسیک این آنتیبیوتیک در دُزهای یادشده بر تخمدان مؤثر واقع نشده است.
از سوی دیگر، بررسیهای بافتی در شرایط درونتنی در مطالعه حاضر نشان داد که اندازه لایه گرانولوزا، تعداد جسم زرد و طول تخمدان بهطور وابسته به دُز نسبت به گروه کنترل کاهش معناداری داشت که تخریب این لایه را ثابت میکند. همچنین در همه گروههای تحت تیمار با دُزهای مختلف لووفلوکساسین نسبت به گروه کنترل بهطور معناداری اندازه لایه تکا کاهش پیدا کرده بود و بیشترین میزان کاهش در دُز دویست میلیگرم بر کیلوگرم مشاهده شد.
همچنین در این دُز بالاترین میزان فولیکول بالغ مشاهده شده است، به طوری که میتوان گفت دُز دویست میلیگرم بر کیلوگرم تعداد این فولیکولهای بالغ را در حد گروه کنترل حفظ کرده بود و به بیان دیگر، تغییر معناداری نسبت به گروه کنترل نداشت. همچنین کاهش فولیکول اولیه و ثانویه به ترتیب با افزایش غلظت دارو مشاهده شد، به طوری که در گروه تحت تیمار با دُز هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم کمترین تعداد این فولیکولها وجود داشت، ولی بالعکس آن با افزایش غلظت لووفلوکساسین افزایش غلظت فولیکول آترتیک قابل مشاهده است. بیشترین اثر مخرب در پارانشیم تخمدان در گروه دویست میلیگرم بر کیلوگرم مشهود بود که افزایش رگهای خونی دیده شد.
اما در این مطالعه در شرایط برونتنی مشاهده شد که در روند تکوین فولیکول اولیه میان گروه دارویی با غلظت دو میکروگرم بر میلیلیتر و گروه کنترل، کاهش معناداری در سطح 01/0 و نیز میان همین گروه و گروه ده میکروگرم بر میلیلیتر افزایش معناداری در سطح 05/0 وجود دارد.
این نتایج حاکی از آن است که دُز دو میکروگرم بر میلیلیتر، احتمالاً آپوپتوز را در این مرحله فولیکولی القا کرده و جمعیت این سلولها را کاهش داده است. همچنین اگرچه تعداد فولیکولهای ثانویه بهطور وابسته به دُز کاهش یافته است، اما بیشترین کاهش در دُز پنج میکروگرم بر میلیلیتر مشاهده شد. نتایج این بررسی همچنین نشان داد که تعداد فولیکول بالغ بهطور وابسته به دُز افزایش یافته است، به طوری که در دُز ده میکروگرم بر میلیلیتر بیشترین تعداد این فولیکولها وجود دارد، اما در ساختار لایه تکا تفاوت معناداری مشاهده نشد؛ بنابراین میتوان اثرات تخریب بافتی را چه در شرایط برونتنی و چه درونتنی تأیید کرد.
در تأیید مطالعات بافتشناسی تحقیق حاضر و ارتباط مستقیم آنها با بیان پروتئینهای آپوپتوزی، واسکیوو و همکارانش نیز نشان دادند خانواده BAX وBcl-2 در سلولهای گرانولوزای فولیکولهای در حال رشد بیان میشوند، اما هیچیک از این پروتئینها در فولیکولهای نخستین وجود ندارند، اما بیان BAX از مرحله فولیکول اولیه به بعد مشهود است و بیان Bcl-2 در برخی از فولیکولهای ثانویه و در تمام فولیکولهای آنترال بیان میشود [22]. رابلِس و همکاران نیز ابراز کردند که فاکتور فعالکننده پروتئاز آپوپتوزی-1 نیز در سلولهای گرانولوزا بیان میشود و توسط خانواده Bcl-2 میانجیگریکننده رهاسازی سیتوکروم سی فعال میشود [23].
همچنین همراستا با این مطالعه، تزریق سیپروفلوکساسین به صورت هفتگی در دُز یک میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن خرگوشهای آلبینو به مدت چهار هفته، باعث کاهش معنادار وزن تخمدان خرگوشها و همچنین تغییرات هیستولوژیک واضح، ازجمله هموراژی و متلاشی شدن دیواره تخمدان و کاهش تعداد فولیکولها شد [4].
بنابراین میتوان گفت در مطالعه حاضر کاهش فولیکولهای اولیه و ثانویه و افرایش فولیکولهای بالغ ناشی از لووفلوکساسین شرایط پیش آپوپتوزی را فراهم میکند که البته از سوی دیگر، بیان بالای پروتئین Bcl-2 با آن مخالفت میکند.
نتیجهگیری
این مطالعه نشان داد که در معرض قرار گرفتن با آنتیبیوتیک لووفلوکساسین میتواند در دُزهای بالا منجر به آسیب به سیستم تولید مثل ماده شود، به طوری که در دُز هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم لووفلوکساسین، بیشترین کاهش در تعداد فولیکولهای اولیه و ثانویه و تعداد جسم زرد را نشان داد و در مقابل بهطور چشمگیری فولیکولهای آترتیک را افزایش داد. افزایش پروتئین ضدآپوپتوزی Bcl-2 در تخمدان، نشاندهنده عدم القای آپوپتوز در سلولهای سالم تخمدان در دُزهای بالا است که امید استفاده ایمنتر از آنتیبیوتیکهای فلوروکینولون، ازجمله لووفلوکساسین را تقویت میکند.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، این مقاله را تأیید کرده است (کد اخلاق: IR.IAU.SRB.REC.1398.012).
حامی مالی
این تحقیق هیچ کمک مالی از سازمانهای تأمین مالی در بخش های عمومی، تجاری یا غیر انتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان به یک اندازه در طراحی، تدوین و اجرای پژوهش مشارکت داشتند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
از میان بسیاری از اندامها که در دوران جنینی در معرض آپوپتوز قرار میگیرند، گنادهای ماده بهطور ممتد بیشترین آپوپتوز را داشته که همراه با تکمیل و بلوغ جرم لاین صورت میگیرد. جرم سلهای ماده اووسیت به شدت آسیبپذیر هستند، بهخصوص در شرایط پاتولوژیک، مانند درمانهای ضدسرطان که درنهایت باعث نارسایی زودرس تخمدان و ناباروری ناشی از مرگ تسریعشده اووسیتها میشود. تلاشها برای درک وقوع و تنظیم آپوپتوز در تخمدان، هم از نظر بیولوژیک و هم کلینیکال اهمیت دارد [1].
فلوروکینولونها به عنوان آنتیبیوتیکهای پراستفاده در دهههای اخیر، بسیار مورد توجه محققین قرار گرفتهاند. اگرچه استفاده از آنتیبیوتیکها رو به افزایش است، اما آسیبهای احتمالی آنها نیز باید در نظر گرفته شود. فلوروکینولونها به علت تواناییشان در مهار همانندسازی و رونویسی دیاِناِی باکتریها از طریق هدفگیری دیاِناِی ژیراز یا توپوایزومراز نوع 2 بسیار شناختهشده هستند.
حضور هر دو آنزیم برای رشد باکتری ضروری است. از آنجا که هر دو آنزیم از همتایشان در پستانداران بسیار متفاوت هستند، فلوروکینولونها نسبت به باکتریها هزاران بار حساستر هستند [2]. آنتیبیوتیک لووفلوکساسین از انواع فلوروکینولونها است. سیپروفلوکساسین، لووفلوکساسین، موکسیفلوکساسین و جمیفلوکساسین قادرند عفونتهای ادراری را در دوران بارداری کاملاً موفقیتآمیز درمان کنند، اما استفاده از آنتیبیوتیکها در دوران بارداری، اثرات تراتوژنیک بر جنین دارد [3].
اثرات تخریبی برخی از فلوروکینولونها مانند سیپروفلوکساسین بر دستگاه تناسلی نر و ماده اثبات شده است [4]. آنتیبیوتیکهای فلوروکینولون، ازجمله لووفلوکساسین، اثرات ضدتکثیر سلولی، بهخصوص در انواع سل لاینهای سرطانی از خود نشان دادهاند [7-5]. یکی از سازوکارهای ضدتکثیر سلولی فلوروکینولونها اثر بر عوامل مسیر آپوپتوز است. پروتئین Bcl-2 به عنوان یک پروتواونکوژن در سلولهای ژرمینال در تنظیم فرایند آپوپتوز سلولی دخالت میکند. دو خانواده بزرگ ژنی Bcl-2 و Caspases در مسیر آپوپتوز درگیر هستند. خانواده Bcl-2 دو گروه پروتئینی پیشبرنده آپوپتوز و مهارکننده آپوپتوز دارد. نسبت متوسط این پروتئینها سرنوشت یک سلول را تعیین میکند [8].
پروتئین Bcl-2 یک مولکول Prosurvival است. این پروتئین غشایی در پوشش هسته و میتوکندری قرار گرفته است و از طریق اتصال به BAX وظیفه خود را انجام میدهد [9]. پروتئین BAG1 از اعضای آنتیآپوپتوز خانواده Bcl-2 بوده و آپوپتوز را مهار میکند. پروتئین BAX از نظر ساختاری هومولوگ Bcl-2 بوده و پیشبرنده آپوپتوز است که در سیتوپلاسم یا غشای سلولی قرار میگیرد؛ بنابراین از نظر عملکردی این پروتئین آنتاگونسیت نقش حفاظتی Bcl-2 است [10].
سیگنالهای مرگ، سبب راهاندازی پروتئینهای آپوپتوزی خانواده Bcl-2، بهویژه BAX میشوند [11]. این پروتئینها موجب تراوش سیتوکروم C از میتوکندری به بیرون میشوند. سیتوکرومC آزاد شده و فاکتور فعالکننده پروتئاز آپوپتوزی Apaf-1 به کاسپاز 9 متصل شده و آبشار کاسپازی را فعال میکند که منجر به مرگ سلولی خواهد شد [12].
از آنجا که تاکنون اثرات احتمالی آنتیبیوتیک لووفلوکساسین بر آپوپتوز فولیکولهای تخمدان بررسی نشده است و با توجه به اهمیت و مصرف زیاد آنتیبیوتیکها، ازجمله لووفلوکساسین، در مطالعه حاضر به تعیین اثرات احتمالی این دارو بر آپوپتوز فولیکولهای تخمدان پرداخته شد.
روش بررسی
این پژوهش در حیوانخانه دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم انجام شد. تعداد شصت سر موش سوری ماده 8-6 هفته نژاد NMRI با محدوده وزنی 30-25 گرم از انستیتو پاستور ایران خریداری شد. موشها در شرایط استاندارد دمایی 2±29 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 48-45 درصد و سیکل دوازده ساعت تاریکی و دوازده ساعت روشنایی با دسترسی آزاد به پلت و آب شیرین قرار گرفتند. حیوانات بهطور تصادفی به دو گروه سی تایی درونتنی و برونتنی تقسیم شدند. گروه درونتنی به پنج گروه شش تایی تقسیم شدند، که شامل:
گروه کنترل
بدون دریافت آنتیبیوتیک لووفلوکساسین و گروههای آزمایش صد، دویست، چهارصد و هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن که روزانه آنتیبیوتیک را به صورت گاواژ به مدت 24 روز دریافت کردند. تخمدانها جدا شد. سپس مطالعات بافتشناسی و آنالیز آزمایش پی سی آر کرونا Real Time PCR به منظور تعیین بیان ژنی BAX و Bcl-2 بر آنها انجام گرفت. گروه برونتنی نیز به پنج گروه شش تایی تقسیم شده و سپس حیوانات تشریح شدند که بلافاصله تخمدانها جدا شده و به صورت گروههای زیر کشت شدند. در گروه کنترل بدون اضافه کردن آنتیبیوتیک لووفلوکساسین به محیط کشت و در گروههای آزمایش یک، دو، پنج و ده میکروگرم در میلیلیتر به ترتیب همین میزان از آنتیبیوتیک به محیط کشت پایه تخمدانها افزوده شد. سپس مطالعات بافتشناسی و آنالیز Real Time PCR به منظور تعیین بیان ژنی BAX و Bcl-2 بر آنها انجام گرفت. آنتی بیوتیک لووفلوکساسین از از شرکت سیگما و آلدریچ آمریکا تهیه شده است.
کشت تخمدان
همه محلولها و وسایل مورد استفاده در کشت، استریل شدند. تخمدانها از موشهای ماده جدا و پس از جدا کردن چربی از آنها و دو بار شستوشو در محلول نمکی بالانسشده هنکس به ظروف مخصوص کشت اندام، منتقل شد. محیط کشت مصرفی شامل DMEM F12 و α-MEM به نسبت مساوی که به آن سه میلیگرم بر میلیلیتر BSA، 23/0 میلیمولار اسید پیرویک و۱ درصد پنیسیلسن-استرپتومایسین اضافه و توسط فیلتر سر سرنگی استریل شد. pH محیط کشت نیز در حد 4/7 تنظیم شد. تخمدانها درون انکوباتور دیاکسیدکربن 5 درصد و 95 درصد هوا در دمای 5/0±37 درجه سانتیگراد به مدت شش روز انکوبه شدند. محیط کشت به صورت روزانه تعویض شد.
مطالعه بافتشناسی
پس از خارج کردن تخمدانهای گروه کنترل و تیمار تحت کشت در گروه برونتنی و همچنین تخمدانهای گروه درونی پس از تشریح حیوان، در محلول بوئن فیکس شدند، سپس مراحل آبگیری و قالبگیری با پارافین و برشگیری انجام شد. برشها به صورت سریالی روی لام فیکس شدند. با توجه به اینکه اندازه هر فولیکول بالغ 25 میکرومتر است، از طرفی ضخامت برش هر نمونه پنج میکرومتر در نظر گرفته شد؛ بنابراین هر پنج مقطع به صورت متناوب روی لام قرار گرفت و بعد از آمادهسازی آن، نمونهها به روش رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین انجام شدند. از مقاطع میکروسکوپی عکسبرداری شد و ارزیابی میکروسکوپی اندازه سلولهای تکا و گرانولوزا، طول و عرض تخمدان و شمارش فولیکولهای سالم و آسیبدیده تخمدان، تحت رنگآمیزی هماتوکسیلین ـ ائوزین، توسط نرمافزار Image J انجام شد.
مطالعات مولکولی
جهت بررسی بیان ژنهای BAX و Bcl-2 از روش Real Time PCR استفاده شد. در این روش ابتدا استخراج RNA از بافت تخمدانها توسط کیت شرکت GeneAll انجام شد. تعیین کمیت و خلوص RNA با استفاده از دستگاه نانودراپ که به مقدار بسیار کمی از RNA در حد نانوگرم نیاز دارد، انجام شد. برای تعیین کیفیت RNA استخراجشده از روش الکتروفورز استفاده شد. به منظور بررسی RNA ژنومیک استخراجشده، نمونه حاصل روی ژل آگارز 1 درصد، الکتروفورز شد. بعد از انجام استخراج، سنتز دیانای مکمل با استفاده از کیت HyperScriptTM RT premix (with Random hexamer) شرکت GeneAll انجام شد. با استفاده از پرایمرهای طراحیشده واکنش زنجیرهای پلیمراز انجام گرفت. پس از اتمام تست و به دست آوردن CTهای ژن رفرنس و ژن مورد نظر از روش ΔΔCT برای محاسبه میزان بیان ژن استفاده شد. میزان بیان هرکدام از ژنها با ژن کنترل داخلی GAPDH مقایسه شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده در زیر آورده شده است:
BAX (F) TTCACAGGTTGGCATTAGG
(R) TCAGCCCATCTTCTTCCAG
Bcl-2 (F) CCCTTCGGAGTTTAATCAGA
(R) CCTTCTTCTCGGCAATTTAC
GAPDH (F) AAGGTCATCCCAGAGCTGAA
(R) CTGCTTCACCACCTTCTTGA
ارزیابی آماری دادهها
دادههای این مطالعه به صورت میانگین و انحراف معیار بیان شد. برای آنالیز آماری و مقایسه بین گروههای مختلف از روش آنالیز واریانس یکطرفه و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. در تمام محاسبات 05/P<0 از لحاظ آماری، معنادار در نظر گرفته شد.
یافتهها
نتایج تغییرات هیستولوژیکی القاشده توسط غلظتهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین بر بافت تخمدان سوری، گروه برونتنی
فوتومیکروگراف بافت تخمدان در گروههای برونتنی تحت تیمار با دُزهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین نشان داد که تعداد فولیکولهای اولیه و ثانویه کاهش پیدا کرده، در حالی که با افزایش فولیکولهای بالغ مواجه شدیم (تصویر شماره 1 الف و ب). در دُز دو میکروگرم بر میلیلیتر، تعداد فولیکولهای اولیه بیشترین کاهش را داشت. میان گروه دارویی با غلظت دو میکروگرم بر میلیلیتر و گروه کنترل، اختلاف معناداری در سطح 01/0 و نیز میان همین گروه و گروه ده میکروگرم بر میلیلیتر اختلاف معناداری در سطح 05/0 وجود دارد و تعداد سلولها کاهش یافته است (تصویر شماره 1 الف).
همچنین در دُز پنج میکروگرم بر میلیلیتر ، هم فولیکول اولیه و هم ثانویه بیشترین کاهش تعداد را نشان دادند، در حالی که دُز ده میکروگرم بر میلیلیتر بیشترین افزایش تعداد فولیکولهای بالغ را داشت (تصویر شماره 1 ج). اندازه لایه تکا تغییر معناداری نداشت (تصویر شماره 1 د)، ولی اندازه لایه گرانولوزا در غلظت پنج میکروگرم بر میلیلیتر کاهش معنادار را نشان داد که این نتایج نشاندهنده آسیب بافتی تخمدان به صورت کاهش تعداد فولیکولهای اولیه و ثانویه و همچنین کاهش اندازه لایه گرانولوزا است (تصویر شماره 2).
نتایج تغییرات هیستولوژیکی القاشده توسط غلظتهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین بر بافت تخمدان سوری، گروه درونتنی
فوتومیکروگراف بافت تخمدان در گروههای درونتنی تحت تیمار با غلظتهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین نشان داد که تعداد فولیکولهای اولیه و ثانویه و بالغ و همچنین تعداد جسم زرد در گروه هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم بیشترین کاهش را نشان داد (تصویر شماره 3 الف، ب و ج - تصویر شماره 4 الف).
این در حالی بود که در دُز هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم با بیشترین افزایش فولیکولهای آترتیک روبهرو شدیم (تصویر شماره 3 د). اندازه لایه تکا و گرانولوزا بهطور معناداری کاهش پیدا کرد (تصویر شماره 4 ب و ج). طول تخمدان نیز بهطور وابسته به دُز کاهش معناداری نسبت به گروه کنترل داشت (تصویرشماره 4 د). در پارانشیم تخمدان در گروه دویست میلیگرم بر کیلوگرم کاملاً افزایش رگهای خونی مشاهده شد (تصویر شماره 5 ب) که این اثرگذاری لووفلوکساسین در گروههای چهارصد و هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم به صورت افزایش فولیکولهای آترتیک مشاهده شد (تصویر شماره 5 ج و د) که این نتایج نشاندهنده آسیبپذیری قابل توجه بافت تخمدان در دُز هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم از آنتیبیوتیک لووفلوکساسین است (تصویر شماره 5).
تغییرات بیان ژنهای BAX و Bcl-2 در گروه برونتنی
نتایج تجربیات حاضر نشان داد که سطح بیان ژن BAX در سلولهای تخمدان تحت تیمار با دُزهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین، با افزایش غلظت آنتیبیوتیک،کاهش معناداری دارد، در حالی که سطح بیان ژن Bcl-2، با افزایش غلظت آنتیبیوتیک لووفلوکساسین، افزایش معنادار را نشان داد (تصویر شماره 6 الف).
تغییرات بیان ژنهای BAX و Bcl-2 در گروه درونتنی
نتایج تغییرات بیان ژنهای BAX و Bcl-2 در گروه درونتنی در سلولهای تخمدان به این صورت است که با افزایش غلظت آنتیبیوتیک لووفلوکساسین میزان بیان ژنهای BAX و Bcl-2 افزایش معنادار را نشان داد (تصویر شماره 6 ب).
بحث
آپوپتوز نقش مهمی در برخی فرایندهای فیزیولوژیک و همچنین شرایط پاتولوژیک دارد [13]. یکی از این فرایندها آترزی فولیکولی در تخمدان است که دخالت آپوپتوز در این فرایند به اثبات رسیده است. آترزی فولیکولی یک فرایند وابسته به مراحل تکوینی است که قسمت عمده آن در مرحله انتقالی بین فولیکولهای پره آنترال و شروع تشکیل آنتروم و در طول تکوین فولیکولهای تخمدانی اتفاق میافتد. آترزی فولیکولی با آپوپتوز سلولهای گرانولوزای فولیکولی آغاز شده و سپس دیگر ترکیبات فولیکولی دچار مرگ میشوند [15 ،14].
نشانههایی از القای آپوپتوز توسط آنتیبیوتیکهای فلوروکینولون در مطالعات مختلف یافت شده است. همچنین مطالعاتی در سالهای 2001 و 1997 ابراز کرده بودند که داروهای سیتوتوکسیک احتمالاً سیگنالهای القاکننده آپوپتوز را فعال میکنند، زیرا هم بیان BAX و هم آپوپتوز را از طریق گیرنده هیدروکربنی آروماتیکی در اووسیتهای موش افزایش میدهند [17 ،16].
ثابت شده است که در موشهای ترانسژنیک که Bcl-2 در تخمدان آنها بیش بیان شده بود، مهار آپوپتوز سلول فولیکولار و افزایش فولیکولوژنزیس دیده شد که نشاندهنده این است که سیستم Bcl-2 در تخمدان عمل میکند [18]. در این راستا نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در تخمدانهای گروه برونتنی سطح بیان ژن BAX در سلولهای تخمدان تحت تیمار با دُزهای مختلف آنتیبیوتیک لووفلوکساسین (غلظتهای یک، دو، پنج و ده میکروگرم بر میلیلیتر)، با افزایش غلظت آنتیبیوتیک، کاهش معناداری دارد، در حالی که سطح بیان ژن Bcl-2 افزایش معنادار را نشان داد که میتواند بیانکننده نقش Bcl-2 در سرکوب آپوپتوز در سلولها و افزایش بقای سلولها در حضور آنتیبیوتیک لووفلوکساسین باشد.
از سویی در مطالعه حاضر، تغییرات بیان ژنهایBAX و Bcl2 در تخمدانهای گروه درونتنی با افزایش دُز آنتیبیوتیک لووفلوکساسین (غلظتهای صد، دویست، چهارصد و هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم) افزایش معنادار هر دو ژن را نشان داد. در این پژوهش مشاهده شد که با افزایش غلظت آنتیبیوتیک لووفلوکساسین، بیان BAX در گروه برونتنی کاهش پیدا میکند، در حالی که در گروه درونتنی افزایش معنادار داشت که نشاندهنده احتمال اثر آپوپتوزی این آنتیبیوتیک در شرایط درونتنی است.
در تأیید نتایج سیتوتوکسیک آنتیبیوتیکها، بروک و همکارانش بر سلولهای ملانومای COLO829 نشان دادند که تیمار با لومفلوکساسین بقای سلولی را از طریق شکست غشای میتوکندریایی در روشی وابسته به دُز و زمان در فاز S و G2/M با مهار توپوایزومرازاز نوع ۲ کاهش میدهد [19].
همراستا با مطالعه حاضر در فعال شدن مسیر میتوکندریایی آپوپتوز، یانگ و همکاران نشان دادند که لووفلوکساسین با کاهش کلاژن نوع 2 در سلولهای هسته پالپوسوس موش صحرایی در شرایط آزمایشگاهی از طریق فعالسازی مسیر BAX/Bcl-2/caspase3، اثرات محرومیت از سرم را بر Anoikis افزایش میدهد [20]. همچنین گزارشهای زیادی در سالهای اخیر نشاندهنده خاصیت ضدسرطانی فلوروکینولونها بوده که در آنها نیز افزایش بیان BAX دیده شده است، به طوری که ثابت کردند که فلوروکینولونها از خاصیت آنتیبیوتیکی به خاصیت ضدسرطانی تغییر مسیر دادهاند [13].
همچنین مطالعه سایکوفسکی و همکاران نشان داد که سیپروفلوکساسین تکثیر سلولهای Jurkat را در فاز G2/M چرخه سلولی با تأثیر منفی بر تشکیل دوکهای میتوزی و القای آنیوپلوئیدی مهار میکند و میتواند باعث بروز آپوپتوز شود [21].
بنابراین با وجود افزایش پروتئین BAX در گروه درونتنی میتوان این گونه اثبات کرد که از آنجا که افزایش سطوح Bcl2 چه در شرایط برون و درونتنی دیده میشود، میتوان احتمال داد اثرات سیتوتوکسیک این آنتیبیوتیک در دُزهای یادشده بر تخمدان مؤثر واقع نشده است.
از سوی دیگر، بررسیهای بافتی در شرایط درونتنی در مطالعه حاضر نشان داد که اندازه لایه گرانولوزا، تعداد جسم زرد و طول تخمدان بهطور وابسته به دُز نسبت به گروه کنترل کاهش معناداری داشت که تخریب این لایه را ثابت میکند. همچنین در همه گروههای تحت تیمار با دُزهای مختلف لووفلوکساسین نسبت به گروه کنترل بهطور معناداری اندازه لایه تکا کاهش پیدا کرده بود و بیشترین میزان کاهش در دُز دویست میلیگرم بر کیلوگرم مشاهده شد.
همچنین در این دُز بالاترین میزان فولیکول بالغ مشاهده شده است، به طوری که میتوان گفت دُز دویست میلیگرم بر کیلوگرم تعداد این فولیکولهای بالغ را در حد گروه کنترل حفظ کرده بود و به بیان دیگر، تغییر معناداری نسبت به گروه کنترل نداشت. همچنین کاهش فولیکول اولیه و ثانویه به ترتیب با افزایش غلظت دارو مشاهده شد، به طوری که در گروه تحت تیمار با دُز هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم کمترین تعداد این فولیکولها وجود داشت، ولی بالعکس آن با افزایش غلظت لووفلوکساسین افزایش غلظت فولیکول آترتیک قابل مشاهده است. بیشترین اثر مخرب در پارانشیم تخمدان در گروه دویست میلیگرم بر کیلوگرم مشهود بود که افزایش رگهای خونی دیده شد.
اما در این مطالعه در شرایط برونتنی مشاهده شد که در روند تکوین فولیکول اولیه میان گروه دارویی با غلظت دو میکروگرم بر میلیلیتر و گروه کنترل، کاهش معناداری در سطح 01/0 و نیز میان همین گروه و گروه ده میکروگرم بر میلیلیتر افزایش معناداری در سطح 05/0 وجود دارد.
این نتایج حاکی از آن است که دُز دو میکروگرم بر میلیلیتر، احتمالاً آپوپتوز را در این مرحله فولیکولی القا کرده و جمعیت این سلولها را کاهش داده است. همچنین اگرچه تعداد فولیکولهای ثانویه بهطور وابسته به دُز کاهش یافته است، اما بیشترین کاهش در دُز پنج میکروگرم بر میلیلیتر مشاهده شد. نتایج این بررسی همچنین نشان داد که تعداد فولیکول بالغ بهطور وابسته به دُز افزایش یافته است، به طوری که در دُز ده میکروگرم بر میلیلیتر بیشترین تعداد این فولیکولها وجود دارد، اما در ساختار لایه تکا تفاوت معناداری مشاهده نشد؛ بنابراین میتوان اثرات تخریب بافتی را چه در شرایط برونتنی و چه درونتنی تأیید کرد.
در تأیید مطالعات بافتشناسی تحقیق حاضر و ارتباط مستقیم آنها با بیان پروتئینهای آپوپتوزی، واسکیوو و همکارانش نیز نشان دادند خانواده BAX وBcl-2 در سلولهای گرانولوزای فولیکولهای در حال رشد بیان میشوند، اما هیچیک از این پروتئینها در فولیکولهای نخستین وجود ندارند، اما بیان BAX از مرحله فولیکول اولیه به بعد مشهود است و بیان Bcl-2 در برخی از فولیکولهای ثانویه و در تمام فولیکولهای آنترال بیان میشود [22]. رابلِس و همکاران نیز ابراز کردند که فاکتور فعالکننده پروتئاز آپوپتوزی-1 نیز در سلولهای گرانولوزا بیان میشود و توسط خانواده Bcl-2 میانجیگریکننده رهاسازی سیتوکروم سی فعال میشود [23].
همچنین همراستا با این مطالعه، تزریق سیپروفلوکساسین به صورت هفتگی در دُز یک میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن خرگوشهای آلبینو به مدت چهار هفته، باعث کاهش معنادار وزن تخمدان خرگوشها و همچنین تغییرات هیستولوژیک واضح، ازجمله هموراژی و متلاشی شدن دیواره تخمدان و کاهش تعداد فولیکولها شد [4].
بنابراین میتوان گفت در مطالعه حاضر کاهش فولیکولهای اولیه و ثانویه و افرایش فولیکولهای بالغ ناشی از لووفلوکساسین شرایط پیش آپوپتوزی را فراهم میکند که البته از سوی دیگر، بیان بالای پروتئین Bcl-2 با آن مخالفت میکند.
نتیجهگیری
این مطالعه نشان داد که در معرض قرار گرفتن با آنتیبیوتیک لووفلوکساسین میتواند در دُزهای بالا منجر به آسیب به سیستم تولید مثل ماده شود، به طوری که در دُز هشتصد میلیگرم بر کیلوگرم لووفلوکساسین، بیشترین کاهش در تعداد فولیکولهای اولیه و ثانویه و تعداد جسم زرد را نشان داد و در مقابل بهطور چشمگیری فولیکولهای آترتیک را افزایش داد. افزایش پروتئین ضدآپوپتوزی Bcl-2 در تخمدان، نشاندهنده عدم القای آپوپتوز در سلولهای سالم تخمدان در دُزهای بالا است که امید استفاده ایمنتر از آنتیبیوتیکهای فلوروکینولون، ازجمله لووفلوکساسین را تقویت میکند.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، این مقاله را تأیید کرده است (کد اخلاق: IR.IAU.SRB.REC.1398.012).
حامی مالی
این تحقیق هیچ کمک مالی از سازمانهای تأمین مالی در بخش های عمومی، تجاری یا غیر انتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان به یک اندازه در طراحی، تدوین و اجرای پژوهش مشارکت داشتند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
فیزیولوژی
دریافت: 1400/5/14 | پذیرش: 1400/6/30 | انتشار: 1400/6/10
دریافت: 1400/5/14 | پذیرش: 1400/6/30 | انتشار: 1400/6/10
فهرست منابع
1. Kim MR, Tilly JL. Current concepts in Bcl-2 family member regulation of female germ cell development and survival. Biochim Biophys Acta. 2004; 1644(2-3):205-10. [DOI:10.1016/j.bbamcr.2003.10.012] [DOI:10.1016/j.bbamcr.2003.10.012]
2. Zhao X, Xu C, Domagala J, Drlica K. DNA topoisomerase targets of the fluoroquinolones: A strategy for avoiding bacterial resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94(25):13991-6. [DOI:10.1073/pnas.94.25.13991] [DOI:10.1073/pnas.94.25.13991]
3. Dogan Z, Cetin A, Elibol E, Vardi N, Turkoz Y. Effects of ciprofloxacin and quercetin on fetal brain development: A biochemical and histopathological study. J Matern Fetal Neonatal Med. 2019; 32(11):1783-91. [DOI:10.1080/14767058.2017.1418222] [DOI:10.1080/14767058.2017.1418222]
4. Mohammad JE, Hasnawi NM. The effect of cirprofloxacin (CPX) on the histological structure of albino rabbit ovary. J Glob Pharma Technol. 2018; 10(03):498-508. https://www.researchgate.net/publication/331024699_The_Effect_of_Cirprofloxacin_CPX_on_the_Histological_Structure_of_Albino_Rabbit_Ovary
5. Yu M, Li R, Zhang J. Repositioning of antibiotic levofloxacin as a mitochondrial biogenesis inhibitor to target breast cancer. Biochem Biophys Res Commun. 2016; 471(4):639-45. [DOI:10.1016/j.bbrc.2016.02.072] [DOI:10.1016/j.bbrc.2016.02.072]
6. Song M, Wu H, Wu S, Ge T, Wang G, Zhou Y, et al. Antibiotic drug levofloxacin inhibits proliferation and induces apoptosis of lung cancer cells through inducing mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Biomed Pharmacother. 2016; 84:1137-43. [DOI:10.1016/j.biopha.2016.10.034] [DOI:10.1016/j.biopha.2016.10.034]
7. Phiboonchaiyanan PP, Kiratipaiboon C, Chanvorachote P. Ciprofloxacin mediates cancer stem cell phenotypes in lung cancer cells through caveolin-1-dependent mechanism. Chem Biol Interact. 2016; 250:1-11. [DOI:10.1016/j.cbi.2016.03.005] [DOI:10.1016/j.cbi.2016.03.005]
8. Avery B, Hay-Schmidt A, Hyttel P, Greve T. Embryo development, oocyte morphology, and kinetics of meiotic maturation in bovine oocytes exposed to 6-dimethylaminopurine prior to in vitro maturation. Mol Reprod Dev. 1998; 50(3):334-44. [DOI:10.1002/(SICI)1098-2795(199807)50:3<334::AID-MRD10>3.0.CO;2-4]
https://doi.org/10.1002/(SICI)1098-2795(199807)50:3<334::AID-MRD10>3.0.CO;2-4 [DOI:10.1002/(SICI)1098-2795(199807)50:33.0.CO;2-4]
9. Amsterdam A, Sasson R, Keren-Tal I, Aharoni D, Dantes A, Rimon E, et al. Alternative pathways of ovarian apoptosis: Death for life. Biochem Pharmacol. 2003; 66(8):1355-62. [DOI:10.1016/S0006-2952(03)00485-4] [DOI:10.1016/S0006-2952(03)00485-4]
10. Bayir H, Kagan VE. Bench-to-bedside review: Mitochondrial injury, oxidative stress and apoptosis-there is nothing more practical than a good theory. Crit Care. 2008; 12(1):206. [DOI:10.1186/cc6779] [DOI:10.1186/cc6779]
11. Broadhead ML, Dass CR, Choong PFM. Cancer cell apoptotic pathways mediated by PEDF: Prospects for therapy. Trends Mol Med. 2009; 15(10):461-7. [DOI:10.1016/j.molmed.2009.08.003] [DOI:10.1016/j.molmed.2009.08.003]
12. Asgharzadeh S, Mirshokraei P, Hassanpour H, Ahmadi E, Nazari H. The effect of mesenchymal stem cells as co-culture in in vitro nuclear maturation of ovine oocytes. Animal Science Papers and Reports. 2015; 33(3):223-32. http://eprints.skums.ac.ir/6527/1/109.pdf
13. Yadav V, Talwar P. Repositioning of fluoroquinolones from antibiotic to anti-cancer agents: An underestimated truth. Biomed Pharmacother. 2019; 111:934-46. [DOI:10.1016/j.biopha.2018.12.119] [DOI:10.1016/j.biopha.2018.12.119]
14. Mazoochi T, Ehteram M. [Apoptosis in the ovary and follicular atresia (Persian)]. J Kashan Univ Med Scie. 2018; 22(1):112-9. http://eprints.kaums.ac.ir/3275/
15. Johnson AL. Intracellular mechanisms regulating cell survival in ovarian follicles. Anim Reprod Sci. 2003; 78(3-4):185-201. [DOI:10.1016/S0378-4320(03)00090-3] [DOI:10.1016/S0378-4320(03)00090-3]
16. Perez GI, Knudson CM, Leykin L, Korsmeyer SJ, Tilly JL. Apoptosis-associated signaling pathways are required for chemotherapy-mediated female germ cell destruction. Nat Med. 1997; 3(11):1228-32. [DOI:10.1038/nm1197-1228] [DOI:10.1038/nm1197-1228]
17. Matikainen T, Perez GI, Jurisicova A, Pru JK, Schlezinger JJ, Ryu HY, et al. Aromatic hydrocarbon receptor-driven Bax gene expression is required for premature ovarian failure caused by biohazardous environmental chemicals. Nat Genet. 2001; 28(4):355-60. [DOI:10.1038/ng575] [DOI:10.1038/ng575]
18. Leo CP, Hsu SY, Chun SY, Bae HW, Hsueh AJ. Characterization of the antiapoptotic Bcl-2 family member myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) and the stimulation of its message by gonadotropins in the rat ovary. Endocrinology. 1999; 140(12):5469-77. [DOI:10.1210/endo.140.12.7171] [DOI:10.1210/endo.140.12.7171]
19. Beberok A, Wrześniok D, Szlachta M, Rok J, Rzepka Z, Respondek M, et al. Lomefloxacin induces oxidative stress and apoptosis in COLO829 melanoma cells. Int J Mol Sci. 2017; 18(10):2194. [DOI:10.3390/ijms18102194] [DOI:10.3390/ijms18102194]
20. Yang SD, Bai ZL, Zhang F, Ma L, Yang DL, Ding WY. Levofloxacin increases the effect of serum deprivation on anoikis of rat nucleus pulposus cells via Bax/Bcl-2/caspase-3 pathway. Toxicol Mech Methods. 2014; 24(9):688-96. [DOI:10.3109/15376516.2014.963772] [DOI:10.3109/15376516.2014.963772]
21. Tsivkovskii R, Sabet M, Tarazi Z, Griffith DC, Lomovskaya O, Dudley MN. Levofloxacin reduces inflammatory cytokine levels in human bronchial epithelia cells: Implications for aerosol MP-376 (levofloxacin solutionfor inhalation) treatment of chronic pulmonary infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 2011; 61(2):141-6. [DOI:10.1111/j.1574-695x.2010.00755.x] [DOI:10.1111/j.1574-695X.2010.00755.x]
22. Vaskivuo TE, Anttonen M, Herva R, Billig H, Dorland M, te Velde ER, et al. Survival of human ovarian follicles from fetal to adult life: Apoptosis, apoptosis-related proteins, and transcription factor GATA-4. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 86(7):3421-9. [DOI:10.1210/jcem.86.7.7679] [DOI:10.1210/jcem.86.7.7679]
23. Robles R, Tao XJ, Trbovich AM, Maravei DV, Nahum R, Perez GI, et al. Localization, regulation and possible consequences of apoptotic protease-activating factor-1 (Apaf-1) expression in granulosa cells of the mouse ovary. Endocrinology. 1999; 140(6):2641-4. [DOI:10.1210/endo.140.6.6931] [DOI:10.1210/endo.140.6.6931]
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
