مقدمه
پوست بزرگترین اندام محافظ بدن انسان است و 15 درصد از کل وزن بدن افراد بزرگسال را تشکیل میدهد [1]. پوست بهعنوان خارجیترین عضو بدن انسان در مقایسه با دیگر بافتها در معرض بیشترین آسیب است. ترمیم طبیعی زخم یک فرایند چند فازی و پیچیده است که شامل تعاملات هماهنگ بین فاکتورهای رشد، سیتوکینها، کموکینها و سلولهای مختلف است. هرگونه آسیب در این مراحل ممکن است موجب مزمن شدن زخمها و ایجاد اسکار غیرطبیعی شود. زخمهای مزمن، به درمانهای مکرر نیاز دارند و شامل هزینههای پزشکی زیادی میشود؛ بنابراین تلاش زیادی بر ایجاد رویکردهای درمانی جدید برای درمان زخم متمرکز شده است [2، 3].
از میان روشهای گسترده ترمیم پوست در مهندسی بافت، استفاده از داربستهای نانوالیافی جایگزین بهمنظور ترمیم بافت آسیبدیده از مواردی است که امروزه بسیار مورد توجه است [4]. این داربستها میتوانند عملکرد بافت را بهبود بخشند و شامل ترکیباتی از پلیمرهای طبیعی و سنتتیک هستند [5]. یکی از این پلیمرهای زیست تخریبپذیر که بسیار به آن توجه شده است، پلیکاپرولاکتون است. این پلیمر آبگریز، فاقد خاصیت سمی و تخریب آن به آهستگی انجام میشود. پلیکاپرولاکتون
ازجمله پلیمرهایی است که درزمینه رهایش دارو و ساخت داربستهای مهندسی بافت مورد توجه قرار گرفته است [6].
از میان روشهای متعددی که برای تولید نانوالیافها اســتفاده شدهاند، تکنیک الکتروریسی یکی از کارآمدترین روشهاست [7]. مهمترین درمانهایی که درباره بیماران سوختگی میتوان انجام داد، سرعت بخشیدن به فرایند ترمیم زخم سوختگی است که خودبهخود میتواند باعث کاهش احتمال ابتلا به عوارض سوختگی، ازجمله عفونت شود [8]. یکی از عمدهترین عوارض بیماران سوختگی، عفونت است. شایعترین میکروارگانیسمهایی که باعث بروز عفونت بیمارستانی میشوند، باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بین پاتوژنهای گرم مثبت است [9].
استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین بهدلیل ایجاد عفونتهای شدید در جمعیت آسیبپذیر و محدودیت در انتخاب آنتیبیوتیکهای مؤثر و همچنین توانایی تشکیل بیوفیلم، درمان آنها دشوار است. این ارگانیسمها بهطور گسترده در جامعه و حتی در حیوانات وجود دارند و بهطور مداوم در حال تکامل هستند تا در برابر آنتیبیوتیکها مقاومت بیشتری ایجاد کنند. این امر موجب نیاز به آنتیبیوتیکهای مفید بالینی جدید میشود [10، 11]. گیاهان زیادی برای درمان سوختگی از گذشته تا به امروز استفاده شده، جایگزین مناسبی برای داروهایی با پایههای شیمیایی است. ضمن آنکه این مواد احتمال بروز عوارض جانبی را برای بیمار کاهش میدهد. گیاه مورد که متعلق به خانواده میرتاسه است، اثرات ضدالتهابی، ضدمیکروبی و ضدقارچی دارد. برگهای این گیاه حاوی اسیدهای فنولیک، فلاوونوئیدها، تاننها، آنتوسیانیدینها، اسانس (آلفاپینن، ترپینول و لیمونن) است. همچنین فعالیت آنتیاکسیدانی دارد که رادیکالهای آزاد را از بین میبرد [12، 13].
نانوذرات نقره خواص فیزیکی و شیمیایی ویژهای دارند که به افزایش خاصیت ضدمیکروبی آن کمک میکنند. با ظهور باکتریهای مقاوم به آنتیبیوتیک، به نانوذرات نقـره در مصارف ضدمیکروبی توجه خاصی شده است [14]. در سال 2008، خواص ضدباکتری نانوالیاف پلیمتیل متاکریلات حاوی نانوذرات نقره بررسی شده و برای کاربردهای مختلفی نظیر زخمبندها و روکش مواد زیستپزشکی پیشنهاد شده است [15].
باتوجهبه اینکه استافیلوکوکوس اورئوس دومین عامل شایع عفونتهای سوختگی است و سویههای مقاوم به متیسیلین، باکتریهای بیماریزای خطرناکی هستند که اغلب به آنتیبیوتیکهای رایج مقاومت نشان میدهند و درمان اختصاصی بیماری را به چالش میکشند. ازاینرو، باتوجهبه اثرات جانبی پایین گیاهان در درمانهای ضدمیکروبی، همراهی این عصاره با داربستهای زیستسازگار و غیرسمی مثل پلیکاپرولاکتون هم به جهت اثرات ضدمیکروبی مورد و هم خاصیت پوششدهی زخم توسط داربست میتواند به بهبود زخمهای عفونی ناشی از باکتریها کمک کند. ازاینرو، هدف این مطالعه بررسی اثر داربست پلیکاپرولاکتون و نانوذره نقره به تنهایی و همراه با عصاره مورد بر زخم عفونی القاشده با استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین در رَت بود.
روش بررسی
این پژوهش تجربی در دانشگاه علومپزشکی یاسوج بر روی 42 موش بزرگ آزمایـشگاهی نر نـژاد ویستار به وزن 30±220 گرم انجام شد.
تهیه عصاره متانولی مورد
برگهای مورد در تابستان از منطقه دره موردی استان کهگیلویه و بویراحمد جمعآوری شد و توسط مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی فارس تأیید شد و شماره هرباریوم 14824 به آن تعلق گرفت. پس از شستوشو در سایه خشک شد و 100 گرم از پودر برگ (آسیاب شده) در 1000 میلیلیتر متانول 70 درصد بهمدت 48 ساعت در دمای آزمایشگاه قرار داده شد. پس از 48 ساعت، محتویات بطری از کاغذ صافی عبور داده شد. عصاره را در ظرف استریل پیرکس ریخته و در دمای 40 درجه سانتیگراد خشک شد و سپس عصاره خشکشده تراشیده شده و درون لوله فالکونهای استریل نگهداری شد [16].
سنتز نانوذره نقره
برای سنتز نانوذرات از روش سبز با کاربرد عصاره گیاهی استفاده شد. در روش سبز از عصاره متانولی برگ مورد استفاده شد. با مخلوط کردن محلول نمکی نقره (نیترات نقره) با احیاکننده و گرماگذاری آن، نانوذرات فلزی همراه با تغییر رنگ محلول سنتز میشوند. برای این کار، 60 میلیگرم عصاره برگ مورد در 1 میلیلیتر آب دیونیزه حل شد. ابتدا 40 میلیلیتر نیترات نقره با غلظت 3 میلیمولار را بر روی دستگاه هیتر استریر با دور 1200 و دمای 80 درجه سانتیگراد قرار داده و بعد از رسیدن دستگاه به دمای موردنظر (80 درجه سلسیوس) 1 میلیلیتر عصاره به آن اضافه شد. بعد از 30 دقیقه هم خوردن محلول روی دستگاه، تغییر رنگ محلول نشان از سنتز نانوذرات نقره بود. با استفاده از این روش نانوذرات نقره سنتز و جهت انجام آزمایشهای تعیین ویژگی و کاربردی (نانوذرات نقره سنتزشده توسط جذب در محدوده طول موج 400 تا 500 نانومتر در روش UV تأیید شدند) در فالکون نگهداری شد. برای جداسازی نانوذرات سنتزشده از محلول رویی از سانتریفیوژ استفاده شد [17].
تهیه داربستهای نانوالیافی
برای ساخت داربست بهروش الکتروریسی، ابتدا 10 سیسی حلال استیک اسید خالص تهیه شد. سپس 2/1 گرم از گرانولهای پلیکاپرولاکتون را با ترازوی با دقت هزارم وزن کرده و به حلال اضافه شد و با استفاده از همزن مغناطیسی بهمدت 1 ساعت با سرعت ۴۰۰ دور بر دقیقه در دمای 50 درجه سانتیگراد قرار گرفت تا محلول یکنواخت و شفافی حاصل شود. سپس بهصورت جداگانه عصاره متانولی برگ مورد با غلظت 1 گرم و 5/0 گرم در اسید استیک 30 درصد حل شد.
همچنین بهصورت جداگانه 1/0 گرم نانوذره نقره در اسیداستیک 30 درصد حل شد. سپس به نسبت 3 به 1 پلیکاپرولاکتون و عصاره متانولی برگ مورد، پلیکاپرولاکتون و نانوذره نقره و همچنین به نسبت 3، 1 و 1 پلیکاپرولاکتون، عصاره متانولی برگ مورد و نانوذره نقره را هرکدام بهصورت جداگانه درون 3 بِشِر ریخته شدند و برای یکنواخت شدن ترکیبها دوباره با همزن مغناطیسی یکنواخت شدند. محلولهای حاصل برای انجام فرایند الکتروریسی بهصورت جداگانه داخل سرنگ کشیده شدند. فرایند الکتروریسی با پارامترهای فاصله نازل تا صفحه جمعکننده 14 سانتیمتر و سرعت تزریق 1 میلیلیتر بر ساعت و ولتاژ دستگاه 16 کیلو ولت بود، انجام شد. نمونهها پس از اتمام الکتروریسی بهمنظور خروج کامل حلال، مدتی زیر هود شیمیایی روشن باقی ماندند و بهمنظور استریل کردن داربستها 40 دقیقه (20 دقیقه هر طرف) با اشعه UV استریل شدند. سپس به داخل پلیت استریل منتقل شدند تا در معرض آلودگی نباشند [18].
آزمون میکروسکوپ الکترونی رویشی
برای انجام این آزمون از دستگاه SEM مدل HITACHI S4160 ساخت ژاپن استفاده شد. در این آزمون، همه نمونهها بهصورت الیاف بر روی سطح آلومینیم در معرض پوشش طلا و پلاتین بهمدت 20 دقیقه قرار گرفت و سپس نمونهها روی پروبهای دستگاهها قرار داده شد و تصاویر در بزرگنماییهای متفاوت ارزیابی و آزمون شد.
آزمون زاویه تماس
هدف از این آزمون بررسی میزان آبدوستی داربستهای نانوالیافی بود که با استفاده از دستگاه زاویه تماسی Kruss G10 (آلمان) انجام شد. بهطورکلی هرچقدر زاویه تماسی قطره آب با سطح کمتر باشد، آن سطح آبدوستتر است. برای هر نمونه 1 بار این آزمون اندازهگیری شد. مقدار حجم قطره آب توسط خود دستگاه بهصورت اتوماتیک تعیین می شود و زاویه تماس بلافاصله بعد از انداختن قطره آب اندازهگیری میشود.
ایجاد سوختگی
جهت ایجاد سوختگی درجه 2 براساس روشهای انجامشده در تحقیقات مشابه، ابتدا موشها با تزریق ترکیب 2 ماده کتامین به میزان 50 میلیگرم بر کیلوگرم (آلفاسان، هلند) و زایلازین 50 میلیگرم بر کیلوگرم (آلفاسان، هلند) بهصورت درون صفاقی بیهوش و سپس موهای پشت موشها تراشیده و سپس توسط هویه با دمای 100 درجه و 10 ثانیه سوختگی به قطر 2 سانتیمتر، درحالیکه حیوان در بیهوشی کامل قرار داشت، در پشت گردن آن ایجاد شد [19]. پس از گذشت 24 ساعت و تأیید سوختگی درجه2 در موشها، به محل سوختگی سوسپانسیون باکتری استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین و دارای SCCmec تایپ3، معادل نیم مکفارلند با حجم 1/0 سیسی در چند جهت و زیرجلدی تزریق شد و طی 1 روز عفونت ایجاد شد [20].
از محل سوختگی عفونیشده با سواپ استریل کشت مستقیم روی محیط مولر هینتون آگار تهیه شد (برای تأیید عفونت از کشت روی محیط مانیتول سالت آگار واکنشهای بیوشیمیایی، تست کاتالاز، کواگولاز، تست DNAse و رنگآمیزی گرم استفاده شد). سپس موشها بهصورت تصادفی به 7 گروه 6 تایی تقسیم شدند و هر موش در قفسهای جداگانه و با آب و غذای مخصوص، کافی و یکسان نگهداری شدند.
تیمارها
بعد از 24 ساعت از ایجاد عفونت (گروه 1: کنترل منفی بدون سوختگی و بدون تیمار)، (گروه 2: کنترل مثبت دچار سوختگی و تیمار با سرم فیزیولوژی)، (گروه 3: دچار سوختگی تیمار با داربست به تنهایی)، (گروه 4: دچار سوختگی تیمار با داربست+مورد 1 گرم)، (گروه 5: دچار سوختگی تیمار با داربست+مورد 5/0 گرم)، (گروه 6: دچار سوختگی تیمار با داربست+نانوذره 1/0 گرم)، (گروه 7: دچار سوختگی تیمار با داربست+مورد+نانوذره) بهمدت 14روز تیمار شدند. داربستهای تهیهشده با چسپ کاغذی پانسمان و در محل ثابت شد.
روش ارزیابی عفونت و زخمها
در روزهای 1، 5، 7، 9، 12 و 14 از محل سوختگی عفونیشده با سواپ استریل، کشت مستقیم تهیه شد. برای اندازهگیری سطح سوختگی از روز ایجاد سوختگی (روز صفر) و روز 7 و 14 شعاع زخم ایجادشده با خطکش اندازهگیری و مساحت زخم محاسبه شد. سپس برای درمان گروههایی که تیمار داشتند با هر روز آب، غذا و تمیزی قفس موشها بررسی میشد [21].
پس از تهیه تعدادی عکس از محل زخم جهت مقایسه میزان و کیفیت جمعشدگی و بهبود زخم ازنظر ماکروسکوپی، موشها پس از بیهوشی عمیق با اتر و سپس با جابهجایی مهره گردنی کشته شدند (نیمی از موشها در روز هفتم و نیمی دیگر از هر گروه در روز چهاردهم). سپس کل پوست ناحیه آسیبدیده همراه با مقداری از پوست سالم اطرافش بهطور عمیق بهتمامی برداشته شد و پس از شستوشو با سرم فیزیولوژی قسمتی از بافت را درون میکروتیوب اپندورف برای تستهای بیوشیمی (میزان مالوندی آلدئید، میزان متابولیتهای نیتریت آکساید و میزان پتانسیل آنتیاکسیدانی تام در سرم) در دمای 20- نگهداری و قسمت دیگر نمونه پوستی در محلول فرمالین 10 درصد بهمدت 24 ساعت نگهداری و سپس در 24 ساعت دوم به محلول جدید فرمالین 5 درصد منتقل شدند.
برای تعیین ضخامت درم و اپیدرم، از هر نمونه پوستی مقداری از آن به مساحت 5/0×5/0 میلیمتر مربع به نحوی تهیه شد که علاوه بر بستر زخم، قسمتهای سالم مجاور زخم نیز قابل مشاهده بود، جدا و از نمونهها بلوک بافتی تهیه شد و سپس با استفاده از میکروتوم، مقاطع 5 میکرون تهیه و با رنگ هماتوکسیلین ائوزین رنگآمیزی و برای بررسی از میکروسکوپ نوری نیکون و دوربین عکسبرداری آن استفاده شد [22].
اندازهگیری مالوندیآلدئید
با اندازهگیری میزان مالوندیآلدئید در نمونههای بیولوژیک مختلف میتوان به میزان پراکسیداسیون چربیها پی برد و از آن بهعنوان یک نشانگر برای اندازهگیری استرس اکسیداتیو در موجود زنده استفاده کرد. سطح
مالوندیآلدئید سرم بهوسیله روشی بر مبنای واکنش با تیوباربیتوریک اسید در دمای 96 تا 100 درجه سانتیگراد اندازهگیری شد. در این روش مالوندیآلدئید و تیوباربیتوریک اسید بر یکدیگر اثر گذاشته و حاصل آن کمپلکس صورتیرنگ است. به این منظور 100 میکرولیتر از نمونه سرم را با 900 میکرولیتر آب مقطر رقیق کرده، به آن900 میکرولیتر معرف تیوباربیتوریک اسید اضافه شد. برای تهیه معرف 100 میلیلیتر آب مقطر، 5/0 گرم NaOH، 67/0 گرم تیوباربیتوریک اسید و 100 میلیلیتر اسید استیک با هم مخلوط شد. نمونه حاوی معرف بهمدت 1 ساعت در دمای 90 درجه سانتیگراد حرارت داده شد و پس از سرد شدن نمونهها بهمدت10 دقیقه در دور 4000 سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی جدا و میزان جذب نوری نمونهها، با استفاده از اسپکتروفتومر در طول موج 535 نانومتر خوانده شد [23].
سنجش نیتریک اکساید
نیتریک اکساید یک مولکول پیامرسان ناپایدار است که در بسیاری از اعمال فیزیولوژیک بدن، ازجمله رشد سلولی، آپوپتوز نقش دارد [24]. هدف از اندازهگیری نیتریک اکساید، بررسی اثرات مهاری استرس اکسیداتیو و ترمیم زخم است. جهت پروتئینزدایی با حلال استونیتریل، 300 میکرولیتر از سرم با 300 میکرولیتر از حلال مذکور مخلوط شد. سنجش نیتریک اکساید توسط واکنش گریس بهروش میکروپلیتی انجام شد.
برای اندازهگیری غلظت نیتریت و نیترات (NOx) تام، در یک میکروپلیت الایزا ابتدا 100 میکرولیتر سرم پروتئینزدایی شده، و سپس100 میکرولیتر محلول کلرید وانادیوم (III) 8 میلیگرم در میلیلیتر اضافه شد تا نیترات به نیتریت تبدیل شوند. سپس 100 میکرولیتر مخلوط (1 به 1) سولفانامید و NEDD افزوده و بهمدت 30 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. بعد از انجام واکنش و تشکیل رنگ، جذب نور حاصل از تشکیل ماده رنگی در 540 نانومتر با دستگاه خوانشگر الایزا
قرائت و با استفاده از منحنی استاندارد غلظت نمونهها محاسبه شد [25].
اندازهگیری ظرفیت پتانسیل آنتیاکسیدانی تام
بهدلیل اینکه در آسیبها و التهابات وارد به بدن اثرات استرس اکسیداتیو و اکسیژن رادیکالی بهعنوان یک فاکتور اکسیدان افزایش مییابد، اندازهگیری ظرفیت پتانسیل آنتیاکسیدانی سرم میتواند پارامتر مناسبی برای ارزیابی کل آنتیاکسیدانی باشد. وضعیتی که حاصل مصرف آنتیاکسیدانها یا تولید و مصرف آنهاست که موجب استرس اکسیداتیو میشود.
برای اندازهگیری ظرفیت پتانسیل آنتیاکسیدانی تام از تست توان آنتیاکسیدانی احیای آهن استفاده شد. ابتدا برای تهیه محلول FRAP، 10 میلیمول TPTZ) 2,4,6-tripyridyl-s-triazine) (80 میلیگرم از TPTZ در 83 میکرولیتر هیدروکلریک اسید 37 درصد حل و سپس با آب مقطر به حجم 25 میلیلیتر رسانده شد. بعد بافراستات (استات سدیم 775 میلیگرم و اسید استیک 4 میلیلیتر در 250 میلیلیتر آب مقطر) تهیه و FeCl3 (81 میلیگرم در 25 میلیلیتر آب مقطر) آماده شد. در انتها 125 میلیلیتر از محلول بافراستات ، 5/12 میلیلیتر از TPTZ و 5/12 میلیلیتر کلریدفریک ترکیب شد. سپس 1000 میکرولیتر از محلول فوق و 37 میکرولیتر از نمونه در پلیتهای 96 خانهای ریخته شد و جذب آن در 539 نانومتر خوانده شد [26].
تحلیل آماری
برای تحلیل آماری از نرمافزار گراف پد و تستهای آماری تحلیل واریانس و مقایسه میانگین با روش تست توکی بررسی شدند. دادهها بعد از تعیین نرمالیتی با آزمون آنووای یکطرفهتجزیهوتحلیل آماری شدند و حد معنادار آزمونها (05/0>P) درنظر گرفته شد.
یافتهها
تحلیل SEM
نانوالیاف تهیهشده با استفاده از تحلیلSEM بررسی شدند و نتایج آن در تصاویر شماره 1، 2 و 3 نشان داده شد. این تصویر وجود عصاره و نانوذرات را روی نانوالیاف تهیهشده نشان میدهد. این ذرات قطری حدود 636 نانومتر دارند که بهدلیل تجمع نانوذرات نقره و عصاره گیاه بین نانوالیاف تشکیلشدهاند.
بررسی مقدار آبدوستی نمونهها
باتوجهبه نتایج، برای نمونههای تهیهشده در تصویر شماره 2، پس از افزودن عصاره مورد و نانوذره بر نانوالیاف پلی کاپرولاکتون زاویه تماسی کاهش یافت، درحدیکه قابل اندازهگیری نبود و نشاندهنده آبدوست شدن نانوالیاف حاوی عصاره مورد و نانوذره است، درحالیکه زاویه تماسی قبل از اصلاح سطحی 70 درجه بود.
تغییرات مساحت زخم در روز هفتم و چهاردهم در گروههای مطالعهشده
در روز هفتم پلیکاپرولاکتون نسبت به گروههای کنترل مثبت، داربست مورد نانوذره، داربست مورد 1 گرم و داربست مورد 5/0 گرم، مساحت زخم را بهطور معناداری افزایش داد
(05/0>P) (تصاویر شماره 1 و 4). گروههای داربست مورد نانوذره و داربست مورد 5/0گرم نسبت به داربست نانوذره مساحت زخم را بهطور معناداری کاهش دادند (05/0>P). در روز چهاردهم گروه تیماری داربست مورد 1 گرم و داربست مورد 5/0گرم در مقایسه با کنترل مثبت، پلیکاپرولاکتون، داربست نانوذره و داربست مورد نانوذره مساحت زخم را بهطور معناداری کاهش دادند و به ترمیم زخم کمک کردند (05/0>P) (تصویر شماره 4).
تغییرات ضخامت اپیدرم در روز چهاردهم گروههای موردمطالعه
در روز چهاردهم ضخامت اپیدرم در گروههای داربست مورد 1 گرم، داربست مورد 5/0 گرم و داربست مورد نانوذره نسبت به کنترل مثبت و پلیکاپرولاکتون افزایش معنادار و نسبت به کنترل منفی کاهش معنادار داشتند (05/0>P). ضخامت اپیدرم در داربست نانوذره نسبت به داربست مورد 1 گرم، داربست مورد 5/0 گرم و داربست مورد نانوذره کاهش معنادار داشت
(05/0>P) (تصویر شماره 5). در گروه کنترل مثبت در مقایسه با گروههای دیگر بافت گرانولاسیون (جوانه گوشتی) نامنظمتر، پرسلولتر و با آماس بیشتر وجود داشت. در پایان روند ترمیم، تشکیل اپیدرم در گروههای درمان با داربستهای نانوالیافی نسبت به گروه کنترل کیفیت و سرعت ترمیم بهتر با آرایش منظمتر، تراکم آماسی کمتری از خود نشان دادند.
تغییرات ضخامت درم روز هفتم و چهاردهم گروههای مطالعهشده
در روز هفتم ضخامت درم در گروه داربست نانوذره 1/0 گرم نسبت به گروه کنترل مثبت افزایش معناداری داشت
(05/0>P) (تصویر شماره 6). در روز چهاردهم ضخامت درم در گروههای داربست مورد 1 گرم، داربست مورد 5/0 گرم، داربست نانوذره 1/0 گرم و داربست مورد نانوذره نسبت به گروه کنترل مثبت افزایش معناداری داشت (05/0>P). بهعبارتی، تجویز داربست مورد 1 گرم، داربست مورد 5/0 گرم، داربست نانوذره 1/0 گرم و داربست مورد نانوذره باعث افزایش در ضخامت درم در موشها شد (تصویر شماره 6). روند ترمیم، تشکیل درم در گروههای درمان با داربستهای نانوالیافی نسبت به گروه کنترل کیفیت و سرعت ترمیم بهتر و منظمتری از خود نشان دادند.
نتایج ضدمیکروبی گروههای مطالعهشده
در روز صفر و سوم بین گروههای مختلف ازنظر تعداد کلنی اختلاف معنادار آماری وجود نداشت (05/0
P) (تصاویر شماره 7 و 8). در روز دوازدهم و چهاردهم گروه داربست مورد 1 گرم و داربست مورد نانوذره نسبت به سایر گروههای مطالعهشده رشد کلنی را بهطور معناداری کاهش داد (05/0>P) (تصویر شماره 7).
تغییرات میزان مالوندیآلدئید سرم
بررسیهای آماری تحلیل واریانس و مقایسه میانگین با روش تست توکی با (05/0>P) نشان داد سوختگی باعث افزایش میزان مالوندیآلدئید در سرم موش شد. میزان مالوندیآلدئید سرم در روز هفتم در گروه کنترل مثبت نسبت به کنترل منفی افزایش معنادار داشت. بهعبارتی، سوختگی باعث افزایش مالوندیآلدئید در سرم موش شد (تصویر شماره 8). در روز چهاردهم میزان مالوندیآلدئید سرم گروه داربست مورد 1 گرم و داربست مورد 5/0 گرم نسبت به کنترل مثبت کاهش معناداری داشتند (05/0>P) (تصویر شماره 8).
تغییرات میزان متابولیتهای نیتریت آکساید سرم
باتوجهبه بررسیهای آماری تحلیل واریانس و مقایسه میانگین با روش تست توکی نشان داد که سوختگی سبب افزایش معنادار نیتریک اکساید در سرم میشود (05/0>P). در روز هفتم موشهای تحت تیمار داربست مورد نانوذره، داربست نانوذره 1/0 گرم، داربست مورد 1 گرم و داربست مورد 5/0 گرم باعث کاهش معناداری نیتریک اکساید سرمی نسبت به گروه کنترل مثبت و پلیکاپرولاکتون شدند (05/0>P) (تصویر شماره 9). در روز چهاردهم نیتریک اکساید سرمی گروههای داربست مورد 1 درصد، داربست مورد 5/0 گرم، داربست نانوذره 1/0 گرم و داربست مورد نانوذره نسبت به کنترل مثبت کاهش معناداری داشت (05/0>P) (تصویر شماره 9).
تغییرات میزان پتانسیل آنتی اکسیدانی تام سرم
در روز هفتم و چهاردهم بین گروه های مختلف ازنظر میزان پتانسیل آنتیاکسیدانی تام سرم اختلاف معناداری مشاهده نشد (تصویر شماره 10).
بحث
یکی از چالشهایی که علم پزشکی از گذشته تاکنون با آن مواجه بوده، درمان بافتهای آسیبدیده بدن است. آسیبهای حرارتی فرایند پیچیدهای است که برای جلوگیری از عفونت سوختگی نیازمند روشهای پیشگیری مؤثر ضدمیکروبی است. استافیلوکوکوس اورئوس بهدلیل قدرت بیماریزایی بالقوه و مقاومت روزافزون در برابر داروهای ضدمیکروبی به یکی از مشکلات بهداشتی مهم در جهان تبدیل شده است؛ بنابراین جلوگیری از بروز عفونتهای ناشی از این باکتری از مسائل ضروری است. پیشرفتهای قابلتوجهی در سیستمهای پانسمان زخم و بهکارگیری عوامل ضدمیکروبی جدید بهدست آمده است. برخی از رویکردهای نوآورانه مانند نانوفیبرهای الکتروریسیشده، نتایج بسیار مثبتی در بهبود زخم از خود نشان دادهاند. این داربستهای نانوفیبری با شبیهسازی ساختار ماتریکس خارجسلولی محیط را برای رشد و اتصال سلول فراهم میکند [27- 29].
شریفی و همکاران فعالیت اثر داربستهای هیبریدی پلیکاپرولاکتون و پلیاسید لاکتیک حاوی سیاهدانه با استفاده از الکتروریسی برای کاربرد ترمیم زخم را بررسی و مشاهده کردند که نانوالیاف پلیکاپرولاکتون و پلیاسید لاکتیک آبگریز بودند و زاویه تماس آنها با افزودن عصاره سیاهدانه در غلظتهای مختلف کاهش و جذب آب نانوالیاف پلیکاپرولاکتون و پلیاسید لاکتیک افزایش مییابد. این امر میتواند بهدلیل وجود تیمول و گروههای هیدروکسیل باشد که میتوانند تا حدی جذب آب سطح را بهبود بخشند.
نتایج فعالیت ضدباکتریایی نانوالیاف علیه 2 نوع باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیاکلی نشان میدهد که ناحیه مهاری در اطراف نانوالیاف حاوی عصاره سیاهدانه در اطراف باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیاکلی تشکیل میشود؛ بنابراین بسته شدن زخم سریعتر از نمونههای شاهد اتفاق میافتد [30]. نتایج این مطالعه با نتایج مطالعه حاضر مطابقت دارد و آزمون زاویه تماس نشان داد عصاره مورد باعث شد ویژگی آبدوستی و ضدمیکروبی پلیکاپرولاکتون بهطور معناداری بهبود یابد.
طاهری و همکاران اثر ضدباکتریایی عصاره هیدروالکلی برگ مورد را بر برخی از باکتریهای بیماریزا، بهویژه استافیلوکوکوس اورئوس نشان دادند [31]. سالواگنینی و همکاران فعالیت ضدمیکروبی اسانس برگ مورد برزیلی را علیه استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و اشریشیاکلی مطالعه و مشاهده کردند که برای استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و اشریشیاکلی نتایج بهتری ارائه دادند [32].
زمردیان و همکاران فعالیت ضدمیکروبی اسانس مورد را نسبت به برخی از باکتریهای گرم مثبت (استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین، استافیلوکوکوس اورئوس حساس به متیسیلین، انتروکوکوس فکالیس مقاوم به وانکومایسین، انتروکوکوس فکالیس مقاوم به وانکومایسین، انتروکوکوس فکالیس حساس به وانکومایسین) و باکتریهای گرم منفی (اشریشیاکلی مقاوم به سفالوسپورین نسل سوم، اشریشیا کلی حساس به سفالوسپورین نسل سوم، سودوموناس آئروژینوزا مقاوم به چند دارو و سویه حساس سودوموناس آئروژینوزا) را بررسی و مشخص کردند اسانس مورد، قدرت بازدارندگی از رشد باکتریهای آزمایششده را دارد [33].
نیلدا وانسا و همکاران توانستند باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین را با استفاده از نانوذرات نقره مهار کنند. آنها نشان دادند فلز نقره در حالت نانو بودن میتواند خاصیت ضدمیکروبی داشته باشد [34]. این نتایج با بررسیهایی که ما بر روی خواص ضدمیکروبی پلیکاپرولاکتون حاوی عصاره مورد و نانوذره بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین در شرایط آزمایشکاهی و مدل حیوانی انجام دادیم، مطابقت دارد.
نتایج مطالعه حاضر نشان داد سوختگی در موشها با افزایش مالوندیآلدئید، نیتریک اکساید و کاهش ظرفیت پتانسیل اکسیدانی در سرم همراه بود که در روز چهاردهم گروه تیمارشده با داربستهای حاوی مورد و نانوذره نقره، باعث کاهش مالوندیآلدئید و سیاهدانه و افزایش ظرفیت پتانسیل اکسیدانی شد. مالوندیآلدئید بهعنوان محصول نهایی پراکسیداسیون لیپیدها، یکی از شاخصهای آسیب اکسیداتیو است [35]. نیتریک اکساید، رادیکال فعالی است که مقادیر بالای آن باعث آسیب بافتی میشود؛ بنابراین گیاهانی که بتوانند با تشکیل نیتریک اکساید مقابله کنند، بهعنوان یک جایگاه در مهار بیماریها میتوانند مورد توجه قرار گیرند. آنتیاکسیدانها مولکولهایی هستند که قادر به واکنش و خنثیسازی رادیکالهای آزاد هستند؛ بنابراین از استرس اکسیداتیو و اثرات مخرب آن در سلولهای بدن انسان جلوگیری میکند و کاهش مییابد [36].
گیاه مورد، منبع غنی از آنتیاکسیدان است و درواقع، مقادیر بالای ترکیبات زیستفعال موجود در میوه و برگهای آن بهطور قابلتوجهی به ظرفیت آنتیاکسیدانی کل و خاصیت مهار رادیکالهای آزاد کمک میکند. بهطورخاص، پلیفنولها از ظرفیت آنتیاکسیدانی بالایی برخوردار هستند [37]. عصاره مورد باعث مهار رادیکالهای آزاد، جلوگیری از تخریب اسیدهای چرب اشباعنشده و کاهش سطح مالوندیآلدئید میشود. بوزاباتا و همکاران طی مطالعهای نشان دادند ترکیبات موجود در مورد قادر به مهار قابلتوجهی در تولید سیاهدانه بودند، بدون اینکه بر زنده ماندن سلول تأثیر بگذارند [38].
نتیجهگیری
نتایجی که در این مطالعه به آن اشاره شد، دال بر تأثیرگذاری داربست پلیکاپرولاکتون حاوی عصاره گیاه مورد بر تسریع ترمیم سوختگی در موشهای صحرایی، کاهش زمان لازم برای بهبود کامل زخم و همچنین جلوگیری از پیشرفت عفونت زخم ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین است. داربستهای حاوی عصاره مورد و نانوذره بهوسیله کاهش مالوندیآلدئید و نیتریک اکساید سرمی و همچنین افزایش پتانسیل اکسیدانی بافت در موشهای صحرایی موجب کاهش استرس اکسیداتیو و درنهایت، کاهش تخریب بافتی شدند.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این طرح در کمیته اخلاق دانشگاه علومپزشکی یاسوج با شماره کد اخلاق (IR.YUMS.REC.1399.083) به تصویب رسیده است.
حامی مالی
این مطالعه با حمایت مالی دانشگاه علومپزشکی یاسوج انجام شده است.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در آمادهسازی این مقاله مشارکت داشتند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله هیچگونه تضاد منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسـندگان از مسئولین محترم آزمایشگاه میکروبشناسی دانشکده پزشکی و مرکز تحقیقات گیاهان دارویی دانشگاه علومپزشکی یاسوج تقدیر و تشکر میکنند.