دوره 17، شماره 1 - ( 5-1402 )
جلد 17 شماره 1 صفحات 333-320 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Ethics code: IR.MAZUMS.REC.1400.539
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Nemati F, Abdullahpour R, Soleymani Rad S, Poorali H, Ghahari F. Biological Effects of Combining Ethanol Extract of Mord Leaf With Olive Oil on the Expression of Selected Growth Factors in Wound Healing of Male BALB/c Mice. Qom Univ Med Sci J 2023; 17 (1) : 2732.1
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3589-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3589-fa.html
نعمتی فرخنده، عبداللهپور روحالله، سلیمانی راد سمانه، پورعلی هاجر، قهاری فاطمه. ارتباط اثرات بیولوژیکی برگ مورد و روغن زیتون با بیان ژنهای مرتبط با التیام زخم در موشهای آزمایشگاهی. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1402; 17 (1) :320-333
فرخنده نعمتی*1 
، روحالله عبداللهپور2 ، سمانه سلیمانی راد3 ، هاجر پورعلی3 ، فاطمه قهاری3
، روحالله عبداللهپور2 ، سمانه سلیمانی راد3 ، هاجر پورعلی3 ، فاطمه قهاری3
1- گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، واحد قائمشهر، دانشگاه آزاد اسلامی، قائمشهر، ایران ، farkhondehnemati@gmail.com
2- گروه علوم جانوری، دانشکده کشاورزی، واحد قائمشهر، دانشگاه آزاد اسلامی، قائمشهر، ایران.
3- گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، واحد قائمشهر، دانشگاه آزاد اسلامی، قائمشهر، ایران
2- گروه علوم جانوری، دانشکده کشاورزی، واحد قائمشهر، دانشگاه آزاد اسلامی، قائمشهر، ایران.
3- گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، واحد قائمشهر، دانشگاه آزاد اسلامی، قائمشهر، ایران
متن کامل [PDF 4847 kb]
(459 دریافت)
| چکیده (HTML) (941 مشاهده)
متن کامل: (407 مشاهده)
مقدمه
ترمیم زخم که در پاسخ به زخم شروع شده و تا اصلاح بافت آسیبدیده ادامه مییابد، مجموعهای از فرایندهای فیزیولوژیکی بوده که طی آن سلولها و ترشحات مختلف سلولی، بهویژه فاکتورهای رشد و بسیاری از سیتوکینها وارد عمل میشوند. فاکتورهای رشد برای عملکرد خود به رسپتورهای خانواده خود متصل شده و بهدنبال آن با اثر بر خانواده پروتئین کینازهای درون غشایی مراحل ترمیم را آغاز میکنند [1].
فاکتور رشد اپیدرمال در ابتدا از عصاره غدد بزاقی موش بهعنوان یک عامل تسریعکننده بهبود زخم قرنیه جدا شد، اما به زودی مشخص شد که در واقع، یک فاکتور رشد عمومی است که موجب اعمال مختلفی، از جمله مهاجرت سلولی و تکثیر طیف گستردهای از سلولها میشود. گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی یک گیرنده فاکتور رشد با فعالیت ذاتی تیروزین کیناز است. این گیرنده بهطور گسترده در بسیاری از انواع سلولها، از جمله دودمان اپیتلیال و مزانشیمی بیان میشود و اتوفسفوریلاسیون آن موجب فعال شدن تعداد زیادی مولکولهای هدف پاییندست میشود [2].
فاکتور رشد شبهانسولین-1 نقش مهمی در بهبود زخم از طریق سازوکارهای متعدد دارد. بهعنوان یک عامل کموتاکتیک برای سلولهای اندوتلیال عمل میکند، تکثیر و مهاجرت کراتینوسیتها و فیبروبلاستها را تحریک میکند و استحکام زخم را افزایش میدهد [3]. چندین مطالعه دیگر نشان دادهاند که فاکتور رشد شبهانسولین-1 به ترمیم انواع بافتها کمک میکند. پاسکوالینا و همکاران [4] توانایی فاکتور رشد شبهانسولین-1 را برای ترمیم بافت ماهیچهای اسکلتی و زوئی و همکاران [5] در بافت میوکارد نشان دادند. به اعتقاد محققان، هورمون رشد بهطور مستقیم در تحریک رشد شرکت نمیکند. بدین ترتیب که هورمون رشد باعث میشود کبد (و به میزان بسیار کمتر سایر بافتها) چند پروتئین کوچک موسوم به فاکتور رشد شبهانسولین-1 تولید کند که ضمن داشتن آثار آنابولیک، موجب رشد بافتی و افزایش حجم و قدرت عضلانی میشود.
فاکتور رشد شبهانسولین-1 در روند آنژیوژنز دخیل است. آنژیوژنز یکی از جنبههای مهم فرایند ترمیم زخم است که در آن عروق خونی جدید رشد میکند. فرایند آنژیوژنز نقش بازسازی و مرمت رگهای خونی را در بافتهای آسیبدیده دارد و علاوه بر اکسیژن و مواد غذایی موردنیاز برای حمایت از رشد و عملکرد سلولها، هورمونها و فاکتورهای رشد را به محل زخم هدایت میکند [6]. فاکتور رشد آندوتلیال عروقی یکی از فاکتورهای رشد در پوست است که میزان بیان آن بهطور قابلتوجهی با میزان ترمیم زخم در ارتباط است [7].
خانواده فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 از مؤثرترین فاکتورهای شرکتکننده در مراحل ترمیم زخم هستند که بهطور عمده توسط سلولهای پوستی نظیر فیبروبلاستها و کراتینوسیتها و همچنین برخی سلولهای دیگر نظیر سلولهای آندوتلیال و عضله صاف بیان میشوند. مهمترین نقش این فاکتور رشد تأثیر تحریکی آنها بر سلولهای سنتزکننده کلاژن برای تنظیم تولید و بازسازی اجزای ماتریکس خارج سلولی است. همچنین این فاکتورها میتوانند بر روند مهاجرتی سلولهای فیبروبلاست به لبههای زخم مؤثر باشند [8]. با وجود پیشرفت روشهای نوین در ترمیم زخم، هنوز روند التیام زخم به نتیجه مطلوب نرسیده و در برخی بیماریها و اختلالات مزمن، ترمیم زخم به یکی از چالشهای علم پزشکی تبدیل شده است و محققان به دنبال ترکیبات جدید برای تسریع در فرایند التیام زخم هستند [9].
تحقیقات نشان داده است که بسیاری از گیاهان دارویی و مواد بیولوژیک میتوانند برای درمان زخمها مفید باشند. از جمله این گیاهان دارویی که در طب باستانی بسیار مورد توجه بوده، گیاه مُورد است. این گیاه با دارا بودن اثرات ضدمیکروبی، ضدالتهابی، آنتیسپتیک و ضداحتقانی موجب تسریع در فرایند التیام زخم میشود [9، 10]. روغن زیتون در طب سنتی در درمان زخمها استفاده میشود و مقادیر زیادی از ویتامینهای A ،D ،K و E دارد که منبع اصلی محافظت در برابر رادیکالهای آزاد است [11].
در مطالعه قبلی ما مشخص شد که تیمار با ترکیب عصاره اتانولی برگ گیاه مُورد و روغن زیتون موجب افزایش معناداری در درصد بهبود زخم میشود [12]. در پژوهش حاضر به بررسی تأثیر ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون بر بیان ژنهای فاکتورهای رشد آندوتلیال عروقی، اپیدرمال، فیبروبلاستی-1 و شبهانسولین-1 در روند بهبود زخم در موشهای کوچک آزمایشگاهی نژاد balb/c میپردازیم.
مواد و روشها
آمادهسازی عصاره برگ مُورد
100 گرم از پودر برگ مُورد به مدت 3 روز در 1000 میلیلیتر اتانول 96 درصد درون یک ارلن خیسانده شد. پس از 3 روز عصارهها را با کاغذ صافی واتمن شماره 1 و قیف جدا کرده و برای پراندن اتانول در محلول موردنظر از دستگاه روتاری استفاده شد. برای به دست آوردن یک عصاره غلیظتر، محلول به مدت چند روز در انکوباتور با دمای 37 درجه قرار داده شد. عصاره غلیظ بهدستآمده برای محافظت از اکسیداسیون، درون ظروف تیرهرنگ به همراه روکشی از کاغذ آلومینیوم و در دمای 0 تا 4 درجه نگهداری شد. عصاره برگ گیاه مُورد به نسبت حجمی 1 به 1 با روغن زیتون ترکیب شد.
حیوانات آزمایشگاهی
برای انجام این آزمایش از 36 موش نر سوری در محدوده وزنی 35 تا 45 گرم استفاده شد و با شرایط آزمایشگاهی مناسب در شرایط استاندارد 12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی و نیز رطوبت نسبی مناسب هوا و دمای 222± نگهداری شدند تا با محیط سازگار شوند.
روش ایجاد زخم
برای ایجاد زخم در موشها، با رعایت حقوق حیوانات و از طریق تزریق صفاقی از ماده کتامین زایلازین با نسبت 1:10 به ازای هر کیلوگرم از وزن بدن برای بیهوشی موشها استفاده شد. موهای ناحیهای که برای ایجاد زخم در نظر گرفته شد در پشت حیوان کامل با تیغ تراشیده شد و پوست این ناحیه با الکل 70 درصد استریل شد. سپس با استفاده از تیغ استریل و رعایت همه اصول جراحی، زخم 1×1 سانتیمتری در پشت حیوان ایجاد شد.
گروهبندی موشها و درمان زخم با عصاره برگ مُورد
پس از ایجاد زخم، در این مرحله حیوانات به صورت تصادفی به 3 گروه 12 تایی تقسیم شدند: گروه اول، گروه کنترل بود که هیچ نوع زخمی در بدن موشها ایجاد نشد. گروه دوم که گروه مورد مطالعه ما هستند، زخم در پشت آنها ایجاد شد و روزانه یک نوبت به مدت 15 روز با پماد تهیهشده از ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون تیمار شدند. گروه سوم نیز مانند گروه دوم، زخم در بدن آنها ایجاد شد و روزانه یک نوبت با استفاده از نرمال سالین تیمار شدند.
نمونهبرداری برای بررسی میزان بیان ژن
در فاصله هر 5 روز 4 حیوان از هر گروه با استفاده از دُز کشنده ماده کتامین زایلازین کشته و بیوپسی شدند و پوست ناحیه زخم در حال ترمیم جدا شد. برای بررسی میزان بیان ژنهای فاکتورهای رشد فیبروبلاستی-1، اپیدرمال، آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 از روش Real Tme PCR استفاده شد.
استخراج RNA
در این مطالعه برای بررسیهای مولکولی از تکنیک Real Tme PCR برای ارزیابی میزان بیان ژنهای فاکتورهای رشد فیبروبلاستی-1، اپیدرمال، آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 استفاده شد. استخراج RNA با استفاده از کیتهای استخراج RNA شرکت سیناکولون با نام تجاری RNX_Plus (Aryogen Biopharma Complex, Karaj, Iran) و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. کیفیت RNA استخراجشده با بردن نمونه روی ژل آگارز 1 درصد تعیین شد. کیفیت RNA حاصله با توجه به پررنگی و وضوح باندها تعیین شد.
همچنین برای بررسی کمّی RNA استخراجشده با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومترنوری، جذب نوری نمونه در طول موج 260 تقسیم بر جذب نوری نمونه در طول موج 280 خوانده شد و نمونههای با جذب 5/1 تا 2 انتخاب شدند. RNAهای استخراجشده بلافاصله برای انجام مرحله نسخهبرداری معکوس و ساخت و تولید cDNA توسط کیت شرکت سیناکلون بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد. نمونهها برای ادامه مراحل کار در دمای 20- درجه نگهداری شد.
طراحی پرایمر
پرایمرها برای تکثیر بخشی از قطعات موردنظر ژنهای فاکتورهای رشد فیبروبلاستی-1، اپیدرمال، آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 و هیپوگزانتین فسفو ریبوزیل ترانسفراز طراحی شد. این پرایمرها طوری طراحی شدند که بتوانند قطعاتی به طول ۱۸۹ جفتباز برای ژن فاکتور رشد شبهانسولین-1، ۱۲۲ جفتباز برای ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1، ۱۹۸ جفتباز برای ژن فاکتور رشد اپیدرمال، ۱۸۹ جفتباز برای ژن فاکتور رشد آندوتلیال عروقی و 131 جفتباز برای ژن هیپوگزانتین فسفو ریبوزیل ترانسفراز را تکثیر کنند (جدول شماره 1).
واکنش Real Tme PCR
واکنش PCR برای هریک از ژنهای موردنظر انجام شد (جدول شماره 2). برنامه دناتوراسیون (95 درجه سانتیگراد برای 10 دقیقه)، یک برنامه تقویت 4 مرحلهای با 40 تکرار و یک برنامه منحنی ذوب فلورسنس (60 تا 95 درجه سانتیگراد با حرارتی به اندازه 0/01oc/s و میزان لازم فلورسنس) و در نهایت، برنامه خنکسازی تا دمای 40 درجه سانتیگراد پس از انجام PCR در شرایط بهینهشده برای هر مولکول (تعداد چرخه، دمای اتصال آغازگرها و بافرها)، محصول PCR روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شد تا اطمینان حاصل شود که واکنش قطعه DNA تقویتشدهای از اندازه مورد انتظار را دارد.
برای ارزیابی محصولات PCR به روش الکتروفورز روی ژل آگارز تعیین کیفیت محصولات حاصله انجام شد. برای اندازهگیری بیان ژنهای فاکتورهای رشد فیبروبلاستی-1، اپیدرمال، آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 تکثیر ژن توسط واکنش PCR Real time با استفاده از مستر میکس سایبرگرین(Applied Biosystems, Warrington, UK) در یک سیستم تشخیص توالی ABI 7300 ،(Applied Biosystems, Foster City, CA) انجام شد. تعیین کمیت نسبی درReal time PCR بهوسیله اندازهگیری افزایش تشعشع فلورسنس در نتیجه اتصال رنگ سایبرگرین انجام شد. اجزای واکنش Real time PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر و غلظت نهایی مواد در جدول شماره 2 نشان داده شده است.
برنامه حرارتی برای تکثیر ژنها با استفاده از روش Real time PCR مطابق جدول شماره 3 بود. از هیپوگزانتین فسفو ریبوزیل ترانسفراز بهعنوان ژن کنترل استفاده شد. منحنیهای استاندارد نسبی با رقتهای سریال تولید شده و همه نمونهها در 3 نسخه اجرا شدند. توالی آغازگرهای PCR در جدول شماره 1 ذکر شده است. منحنی ذوب بهوسیله اندازهگیری تغییرات میزان فلورسنس در زمانهای مختلف بهوسیله دستگاه Real time PCR رسم شد. پس از انجام واکنش تکثیر به روش Relative Quantitative Real time PCR، دادههای خام بهصورت CT از دستگاه استخراج شد. دادههای CT برای تعیین مقدار هر ژن / mRNA موجود نسبت به هر نمونه استفاده شد و تغییر نسبی سطح RNA هدف با استفاده از رابطه2-ΔΔCT (لیواک و اشمیتگن 2001) محاسبه شد.
بررسی تکثیر اختصاصی محصولات Real Tme PCR
برای بررسی اختصاصیت پرایمرهای طراحیشده و حصول اطمینان از تکثیر قطعات اختصاصی هر ژن و عدم حضور محصولات غیراختصاصی و پرایمر دایمر، محصولات نهایی حاصل از Real Tme PCR روی ژل 1 درصد آگارز بارگذاری و الکتروفورز شدند. در این بررسی، محصولات بارگذاریشده، تنها یک باند (تکباند) را روی ژل نشان میدهند که میتوان به اختصاصی بودن پرایمرهای طراحیشده و نبود آلودگی پی برد. همچنین با مشاهده تکباند قوی برای هر پرایمر میتوان استنباط کرد که شرایط بهینه برای واکنش PCR وجود داشته و نکات اصلی در طراحی هر پرایمر شامل میزان GC، دمای Tm و اندازه پرایمر به درستی انتخاب شده است که به این ترتیب از تکثیر قطعات غیراختصاصی و پرایمر دایمرها جلوگیری شد.
تجزیهوتحلیل آماری دادهها
تجزیهوتحلیل آماری دادهها با استفاده از روش تجزیه واریانس در نرمافزار R انجام شد. همچنین مقایسه دوبهدوی میانگین تیمارها نیز با استفاده از روش توکی انجام شد و گروههای دارای اختلاف معنادار با حروف الفبایی متفاوت مشخص شدند. مقدار 05/0>P معنادار در نظر گرفته شد. نمودارها در محیط نرمافزار اکسل ترسیم شد.
یافتهها
بررسی تکثیر اختصاصی محصولات Real Tme PCR
ژن فاکتور رشد اپیدرمال باند 198 جفتبازی (bp)، ژن فاکتورهای رشد آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 باند 189 جفتبازی (bp)، ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 باند 122 جفتبازی (bp) و همچنین ژن هیپوگزانتین فسفو ریبوزیل ترانسفراز باند 131 جفتبازی (bp) روی ژل آگارز دارد و از آنجا که این 5 ژن باند اختصاصی دادند، یعنی تکباند روی ژل ظاهر شدند، پس میتوان نتیجه گرفت که پرایمر دایمر ندارند و پرایمرهای طراحیشده برای این 3 ژن اختصاصی عمل میکنند (تصویر شماره 1).
نتایج مربوط به اندازهگیری میزان بیان ژنهای فاکتورهای رشد فیبروبلاستی-1، اپیدرمال، آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 با روشReal Time PCR در گروه کنترل، سالین و ترکیب عصاره مُورد و روغن زیتون در تصویر شماره 2 نشان داده شده است.
بررسی میزان بیان ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1
نتایج حاصل از بررسی میانگین میزان بیان ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 نشان داد که افزایش معناداری در میزان بیان ژن گروه تیمار با ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون پس از 5، 10 و 15 روز نسبت به گروه تیمار با سالین و کنترل اتفاق افتاد (05/0>P). بیشترین میزان بیان ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 نیز پس از گذشت 15 روز با تیمار عصاره برگ مُورد و روغن زیتون با میانگین 37/1098 مشاهده شد (تصویر شماره 2).
بررسی میزان بیان ژن فاکتور رشد شبهانسولین-1
نتایج حاصل از بررسی میانگین میزان بیان ژن فاکتور رشد شبهانسولین-1 نشان داد که افزایش معناداری در میزان بیان ژن گروه تیمار با ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون پس از 5، 10 و 15 روز نسبت به گروه تیمار با سالین و کنترل اتفاق افتاد (05/0>P). بیشترین میزان بیان ژن فاکتور رشد شبهانسولین-1 نیز پس از گذشت 15 روز با تیمار عصاره برگ مُورد و روغن زیتون با میانگین 03/124 مشاهده شد (تصویر شماره 2).
بررسی میزان بیان ژن فاکتور رشد اپیدرمال
نتایج حاصل از بررسی میانگین میزان بیان ژن فاکتور رشد اپیدرمال نشان داد که افزایش معناداری در میزان بیان ژن گروه تیمار با ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون پس از 5، 10 و 15 روز نسبت به گروه تیمار با سالین و کنترل اتفاق افتاد (05/0>P). بیشترین میزان بیان فاکتور رشد اپیدرمال نیز پس از گذشت 15 روز با تیمار عصاره برگ مُورد و روغن زیتون با میانگین 89/68 مشاهده شد (تصویر شماره 2).
بررسی میزان بیان ژن فاکتور رشد آندوتلیال عروقی
نتایج حاصل از بررسی میانگین میزان بیان ژن فاکتور رشد آندوتلیال عروقی نشان داد که افزایش معناداری در میزان بیان ژن گروه تیمار با ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون پس از 5، 10 و 15 روز نسبت به گروه تیمار با سالین و کنترل اتفاق افتاد (05/0>P). بیشترین میزان بیان ژن فاکتور رشد آندوتلیال عروقی نیز پس از گذشت 15 روز با تیمار عصاره برگ مُورد و روغن زیتون با میانگین 48/12 مشاهده شد (تصویر شماره 2).
نتایج حاصل از مقایسه میزان بیان 4 ژن ذکرشده در تصویر شماره 3 نشان داد که تیمار با ترکیب عصاره مُورد و روغن زیتون بیشترین تأثیر را در افزایش بیان ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 (به مقدار 37/1098) نسبت به سایر ژنهای اندازهگیریشده دارد.
بحث
نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داد که تیمار با ترکیب عصاره اتانولی برگ مُورد و روغن زیتون در محل زخم، موجب افزایش بیان ژنهای فاکتورهای رشد آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 و بهعنوان عوامل مهم در ترمیم زخمهای پوستی در موشها شد. نتایج حاصل از این پژوهش نشان میدهد ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون در تسریع روند ترمیم زخمهای پوستی مؤثر است.
در مطالعه قبلی که نعمتی و همکاران روی ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون بر بهبود زخم پوستی موشهای Balb/c در مقایسه با کرم سولفادیازین نقره 1 درصد انجام دادند، نشان داده شد که تیمار با ترکیب عصاره اتانولی برگ گیاه مُورد و روغن زیتون موجب افزایش معناداری در درصد بهبود زخم، ضخامت پوست، قطر فولیکولهای مو، نسبت به گروه دریافتکننده کرم سولفادیازین نقره 1 درصد شد. همچنین افزایش معناداری در میزان تشکیل کلاژن و رگزایی مشاهده شد.
این نتایج نشاندهنده تسریع روند بهبود زخم در نمونههای تحت تیمار با ترکیب عصاره مُورد و روغن زیتون بوده است. آنها همچنین نشان دادند استفاده از عصاره برگ مُورد و روغن زیتون باعث تسریع انتقال از مرحله التهابی به مرحله هایپرپلازی فیبروبلاست بهدلیل افزایش در سنتز کلاژن و عروق خونی میشود [12].
آلم و همکاران در مطالعه خود نشان دادند که تیمار با پماد عصاره برگ مُورد باعث تسریع در آغاز فرایند بهبود شده و باعث افزایش سرعت گذر از فاز التهابی و وارد شدن به فاز فیبروپلازی و در نهایت در افزایش روند بهبود زخم میشود [13]. قرب غاز زاده و همکاران و همکاران نشان دادند که پماد گیاه مُورد موجب تعدیل التهاب و مانع از تخریب بیشتر بافتی میشود و همچنین در مطالعهای که روی تأثیر آلوئهورا بر ترمیم زخم انجام دادند، به این نتیجه دست یافتند که خانواده فاکتور رشد اپیدرمی از پلاکتها و ماکروفاژها در محل آسیب و زخم در بافت تولید و ترشح شده و پس از ترشح در روند تقسیم میتوز، اپیتلیزاسیون، مهاجرت گلبولهای سفید به محل زخم و تا حد کمتری در آنژیوژنز و افزایش ترشح رشتههای کلاژن در محل زخم فعالیت میکنند و ژن فاکتور رشد اپیدرمال باعث ترمیم زخم در موشهای مورد آزمایش میشود [14].
ایشی و همکاران و ویجیوان و همکاران در پژوهش خود که بر رسپتور فاکتور رشد اپیدرمی انجام دادند، نشان دادند که رسپتور فاکتور رشد اپیدرمی موجب افزایش تکثیر سلولی در محل زخم میشود و مقدار رسپتور فاکتور رشد اپیدرمیای که در یک زخم بیان میشود، بهطور قابلتوجهی با میزان ترمیم زخم در ارتباط است. مشخص شد که فاکتور رشد اپیدرمال رگزایی را از طریق مسیر فسفاتیدیل اینوزیتول 3-کیناز / پروتئین کینازB (pl3k/Akt) و سیگنالدهی خارج سلولی تنظیمکننده 2/1 (ERK1/2) از طریق مسیرهای با واسطه فاکتور رشد آندوتلیال عروقی افزایش میدهد [15]. همچنین فاکتور رشد اپیدرمال یک جاذب شیمیایی قوی برای مهاجرت کراتینوسیتها برای اپیتلیالیزاسیون زخم است [16].
باسو و همکاران در مطالعهای که بر میزان انتقال فاکتور رشد بتا و فاکتور رشد شبهانسولینی در محل ترمیم زخم پرداختند، به این نتیجه دست یافتند که فاکتور رشد شبهانسولینی -1 همراه با سایر فاکتورهای رشد نظیر فاکتور رشد مشتق از پلاکتها نقش مهمی در فرایند ترمیم زخم داشته، بهطوری که باعث افزایش ضخامت درم و اپیدرم میشوند [17].
در پژوهش دیگری که بالاجی و همکاران درباره فاکتور رشد شبهانسولین-1 انجام دادند، نشان داده شد که این فاکتور رشد یک کراتینوسیت میتوژن است و از طریق مسیر وابسته به فاکتور رشد آندوتلیال عروقی (فاکتور رشد اندوتلیال عروقی) باعث رگزایی و بهبود زخم میشود [18]. خانواده فاکتور رشد آندوتلیال عروقی نقش مهمی در نفوذپذیری عروق خونی و اتساع عروق دارد. نشان داده شده است که فاکتور رشد آندوتلیال عروقی رشد عروق خونی جدید را در طول زخم تثبیت میکند[ 19].
خون و عوامل مشتق از خون حاوی فاکتورهای رشد و سیتوکینهایی هستند که میتوانند روند ترمیم زخم طبیعی را بهبود بخشند. انتقال تعداد زیادی از فاکتورهای رشد از قبیل PDGF-BB, TGF-B1, FGF-2, ، آندوتلیال عروقی و اپیدرمال از طریق خون به محل زخم، روشی ساده برای افزایش ترمیم زخم و رگزایی است [20].
همچنین ژو و همکاران با مطالعه روی تأثیر فاکتور رشد فیبروبلاستی بنیادی در ترمیم جای زخم به این نتیجه رسیدند که افزایش میزان بیان فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 تأثیر بسزایی در ترمیم جای زخم دارد [21]. خانواده فاکتور رشد اپیدرمال با رگزایی و اپیتلیالیزاسیون رگ ارتباط قوی دارند [22-25]. لیگاندهای فاکتور رشد اپیدرمال به گیرندههای خود متصل شده و رگزایی و مهاجرت سلولهای آندوتلیال را در محل زخم افزایش میدهند [26]. در مطالعه حاضر، افزایش بیان ژن فاکتور رشد اپیدرمال در روند ترمیم زخم بسیار چشمگیر بوده و این تأثیر بهخصوص در روز 15 آزمایش بیشتر از روزهای دیگر بوده است.
ﻧﻘﺶ آﻧﺘﯽاﮐﺴﯿﺪانی ﻗﻮی ویﺘﺎﻣﯿﻦﻫﺎیC ،A ،E و ترکیبات فلاونوییدی و عناصری مثل روی، مس و سلنیوم در ﺗﺴـﺮیﻊ ﺗﺮﻣﯿﻢ زﺧﻢ به کرات ثابت شده است [27]. بر اساس یافتههای ملگیزو رودریگز و همکاران، زیتون حاوی مقادیر زیادی از ترکیبات آنتیاکسیدانی است که حضور این ترکیبات نقش مؤثری در ترمیم بافتهای تخریبشده و التیام زخمهای پوستی دارد. این امر به خاصیت آنتیاکسیدانی پلیفنلهای آن مربوط میشـود و در خصوص مقاومت در برابر استرس اکسیداتیو (بالا بردن غلظـت لیپـوپروتئینهای بـا دانسیته بالا و پایین آوردن لیپوپروتئینهای با دانسیته پـایین) روغـن زیتـون مـؤثرتر از ترکیباتش به صورت مجزاست [28].
نتیجهگیری
یافتههای پژوهش حاضر نشاندهنده تأثیرگذاری چشمگیر ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون در تسریع دوره ترمیم کامل در محل زخمهاست. مطالعات مولکولی در تحقیق حاضر نشاندهنده تأثیر مثبت ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون بر بیان ژن فاکتور رشد آندوتلیال عروقی، فاکتور رشد اپیدرمال، فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 و فاکتور رشد شبهانسولین-1 در پوست آسیبدیده موشها و سرعت ترمیم و بهبود زخم از طریق افزایش بیان فاکتورهای رشد مذکور و خونرسانی به محل زخم است.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مقاله با شماره 11662 و با کد اخلاق IR.MAZUMS.REC.1400.539 به تأیید کمیته اخلاق دانشگاه علومپزشکی مازندران رسیده است.
حامی مالی
این پژوهش هیچگونه کمک مالی از سازمانهای دولتی، خصوصی و غیرانتفاعی دریافت نکرده است.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش همه بخشهای پژوهش حاضر مشارکت داشتهاند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
ترمیم زخم که در پاسخ به زخم شروع شده و تا اصلاح بافت آسیبدیده ادامه مییابد، مجموعهای از فرایندهای فیزیولوژیکی بوده که طی آن سلولها و ترشحات مختلف سلولی، بهویژه فاکتورهای رشد و بسیاری از سیتوکینها وارد عمل میشوند. فاکتورهای رشد برای عملکرد خود به رسپتورهای خانواده خود متصل شده و بهدنبال آن با اثر بر خانواده پروتئین کینازهای درون غشایی مراحل ترمیم را آغاز میکنند [1].
فاکتور رشد اپیدرمال در ابتدا از عصاره غدد بزاقی موش بهعنوان یک عامل تسریعکننده بهبود زخم قرنیه جدا شد، اما به زودی مشخص شد که در واقع، یک فاکتور رشد عمومی است که موجب اعمال مختلفی، از جمله مهاجرت سلولی و تکثیر طیف گستردهای از سلولها میشود. گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی یک گیرنده فاکتور رشد با فعالیت ذاتی تیروزین کیناز است. این گیرنده بهطور گسترده در بسیاری از انواع سلولها، از جمله دودمان اپیتلیال و مزانشیمی بیان میشود و اتوفسفوریلاسیون آن موجب فعال شدن تعداد زیادی مولکولهای هدف پاییندست میشود [2].
فاکتور رشد شبهانسولین-1 نقش مهمی در بهبود زخم از طریق سازوکارهای متعدد دارد. بهعنوان یک عامل کموتاکتیک برای سلولهای اندوتلیال عمل میکند، تکثیر و مهاجرت کراتینوسیتها و فیبروبلاستها را تحریک میکند و استحکام زخم را افزایش میدهد [3]. چندین مطالعه دیگر نشان دادهاند که فاکتور رشد شبهانسولین-1 به ترمیم انواع بافتها کمک میکند. پاسکوالینا و همکاران [4] توانایی فاکتور رشد شبهانسولین-1 را برای ترمیم بافت ماهیچهای اسکلتی و زوئی و همکاران [5] در بافت میوکارد نشان دادند. به اعتقاد محققان، هورمون رشد بهطور مستقیم در تحریک رشد شرکت نمیکند. بدین ترتیب که هورمون رشد باعث میشود کبد (و به میزان بسیار کمتر سایر بافتها) چند پروتئین کوچک موسوم به فاکتور رشد شبهانسولین-1 تولید کند که ضمن داشتن آثار آنابولیک، موجب رشد بافتی و افزایش حجم و قدرت عضلانی میشود.
فاکتور رشد شبهانسولین-1 در روند آنژیوژنز دخیل است. آنژیوژنز یکی از جنبههای مهم فرایند ترمیم زخم است که در آن عروق خونی جدید رشد میکند. فرایند آنژیوژنز نقش بازسازی و مرمت رگهای خونی را در بافتهای آسیبدیده دارد و علاوه بر اکسیژن و مواد غذایی موردنیاز برای حمایت از رشد و عملکرد سلولها، هورمونها و فاکتورهای رشد را به محل زخم هدایت میکند [6]. فاکتور رشد آندوتلیال عروقی یکی از فاکتورهای رشد در پوست است که میزان بیان آن بهطور قابلتوجهی با میزان ترمیم زخم در ارتباط است [7].
خانواده فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 از مؤثرترین فاکتورهای شرکتکننده در مراحل ترمیم زخم هستند که بهطور عمده توسط سلولهای پوستی نظیر فیبروبلاستها و کراتینوسیتها و همچنین برخی سلولهای دیگر نظیر سلولهای آندوتلیال و عضله صاف بیان میشوند. مهمترین نقش این فاکتور رشد تأثیر تحریکی آنها بر سلولهای سنتزکننده کلاژن برای تنظیم تولید و بازسازی اجزای ماتریکس خارج سلولی است. همچنین این فاکتورها میتوانند بر روند مهاجرتی سلولهای فیبروبلاست به لبههای زخم مؤثر باشند [8]. با وجود پیشرفت روشهای نوین در ترمیم زخم، هنوز روند التیام زخم به نتیجه مطلوب نرسیده و در برخی بیماریها و اختلالات مزمن، ترمیم زخم به یکی از چالشهای علم پزشکی تبدیل شده است و محققان به دنبال ترکیبات جدید برای تسریع در فرایند التیام زخم هستند [9].
تحقیقات نشان داده است که بسیاری از گیاهان دارویی و مواد بیولوژیک میتوانند برای درمان زخمها مفید باشند. از جمله این گیاهان دارویی که در طب باستانی بسیار مورد توجه بوده، گیاه مُورد است. این گیاه با دارا بودن اثرات ضدمیکروبی، ضدالتهابی، آنتیسپتیک و ضداحتقانی موجب تسریع در فرایند التیام زخم میشود [9، 10]. روغن زیتون در طب سنتی در درمان زخمها استفاده میشود و مقادیر زیادی از ویتامینهای A ،D ،K و E دارد که منبع اصلی محافظت در برابر رادیکالهای آزاد است [11].
در مطالعه قبلی ما مشخص شد که تیمار با ترکیب عصاره اتانولی برگ گیاه مُورد و روغن زیتون موجب افزایش معناداری در درصد بهبود زخم میشود [12]. در پژوهش حاضر به بررسی تأثیر ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون بر بیان ژنهای فاکتورهای رشد آندوتلیال عروقی، اپیدرمال، فیبروبلاستی-1 و شبهانسولین-1 در روند بهبود زخم در موشهای کوچک آزمایشگاهی نژاد balb/c میپردازیم.
مواد و روشها
آمادهسازی عصاره برگ مُورد
100 گرم از پودر برگ مُورد به مدت 3 روز در 1000 میلیلیتر اتانول 96 درصد درون یک ارلن خیسانده شد. پس از 3 روز عصارهها را با کاغذ صافی واتمن شماره 1 و قیف جدا کرده و برای پراندن اتانول در محلول موردنظر از دستگاه روتاری استفاده شد. برای به دست آوردن یک عصاره غلیظتر، محلول به مدت چند روز در انکوباتور با دمای 37 درجه قرار داده شد. عصاره غلیظ بهدستآمده برای محافظت از اکسیداسیون، درون ظروف تیرهرنگ به همراه روکشی از کاغذ آلومینیوم و در دمای 0 تا 4 درجه نگهداری شد. عصاره برگ گیاه مُورد به نسبت حجمی 1 به 1 با روغن زیتون ترکیب شد.
حیوانات آزمایشگاهی
برای انجام این آزمایش از 36 موش نر سوری در محدوده وزنی 35 تا 45 گرم استفاده شد و با شرایط آزمایشگاهی مناسب در شرایط استاندارد 12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی و نیز رطوبت نسبی مناسب هوا و دمای 222± نگهداری شدند تا با محیط سازگار شوند.
روش ایجاد زخم
برای ایجاد زخم در موشها، با رعایت حقوق حیوانات و از طریق تزریق صفاقی از ماده کتامین زایلازین با نسبت 1:10 به ازای هر کیلوگرم از وزن بدن برای بیهوشی موشها استفاده شد. موهای ناحیهای که برای ایجاد زخم در نظر گرفته شد در پشت حیوان کامل با تیغ تراشیده شد و پوست این ناحیه با الکل 70 درصد استریل شد. سپس با استفاده از تیغ استریل و رعایت همه اصول جراحی، زخم 1×1 سانتیمتری در پشت حیوان ایجاد شد.
گروهبندی موشها و درمان زخم با عصاره برگ مُورد
پس از ایجاد زخم، در این مرحله حیوانات به صورت تصادفی به 3 گروه 12 تایی تقسیم شدند: گروه اول، گروه کنترل بود که هیچ نوع زخمی در بدن موشها ایجاد نشد. گروه دوم که گروه مورد مطالعه ما هستند، زخم در پشت آنها ایجاد شد و روزانه یک نوبت به مدت 15 روز با پماد تهیهشده از ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون تیمار شدند. گروه سوم نیز مانند گروه دوم، زخم در بدن آنها ایجاد شد و روزانه یک نوبت با استفاده از نرمال سالین تیمار شدند.
نمونهبرداری برای بررسی میزان بیان ژن
در فاصله هر 5 روز 4 حیوان از هر گروه با استفاده از دُز کشنده ماده کتامین زایلازین کشته و بیوپسی شدند و پوست ناحیه زخم در حال ترمیم جدا شد. برای بررسی میزان بیان ژنهای فاکتورهای رشد فیبروبلاستی-1، اپیدرمال، آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 از روش Real Tme PCR استفاده شد.
استخراج RNA
در این مطالعه برای بررسیهای مولکولی از تکنیک Real Tme PCR برای ارزیابی میزان بیان ژنهای فاکتورهای رشد فیبروبلاستی-1، اپیدرمال، آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 استفاده شد. استخراج RNA با استفاده از کیتهای استخراج RNA شرکت سیناکولون با نام تجاری RNX_Plus (Aryogen Biopharma Complex, Karaj, Iran) و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. کیفیت RNA استخراجشده با بردن نمونه روی ژل آگارز 1 درصد تعیین شد. کیفیت RNA حاصله با توجه به پررنگی و وضوح باندها تعیین شد.
همچنین برای بررسی کمّی RNA استخراجشده با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومترنوری، جذب نوری نمونه در طول موج 260 تقسیم بر جذب نوری نمونه در طول موج 280 خوانده شد و نمونههای با جذب 5/1 تا 2 انتخاب شدند. RNAهای استخراجشده بلافاصله برای انجام مرحله نسخهبرداری معکوس و ساخت و تولید cDNA توسط کیت شرکت سیناکلون بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد. نمونهها برای ادامه مراحل کار در دمای 20- درجه نگهداری شد.
طراحی پرایمر
پرایمرها برای تکثیر بخشی از قطعات موردنظر ژنهای فاکتورهای رشد فیبروبلاستی-1، اپیدرمال، آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 و هیپوگزانتین فسفو ریبوزیل ترانسفراز طراحی شد. این پرایمرها طوری طراحی شدند که بتوانند قطعاتی به طول ۱۸۹ جفتباز برای ژن فاکتور رشد شبهانسولین-1، ۱۲۲ جفتباز برای ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1، ۱۹۸ جفتباز برای ژن فاکتور رشد اپیدرمال، ۱۸۹ جفتباز برای ژن فاکتور رشد آندوتلیال عروقی و 131 جفتباز برای ژن هیپوگزانتین فسفو ریبوزیل ترانسفراز را تکثیر کنند (جدول شماره 1).
واکنش Real Tme PCR
واکنش PCR برای هریک از ژنهای موردنظر انجام شد (جدول شماره 2). برنامه دناتوراسیون (95 درجه سانتیگراد برای 10 دقیقه)، یک برنامه تقویت 4 مرحلهای با 40 تکرار و یک برنامه منحنی ذوب فلورسنس (60 تا 95 درجه سانتیگراد با حرارتی به اندازه 0/01oc/s و میزان لازم فلورسنس) و در نهایت، برنامه خنکسازی تا دمای 40 درجه سانتیگراد پس از انجام PCR در شرایط بهینهشده برای هر مولکول (تعداد چرخه، دمای اتصال آغازگرها و بافرها)، محصول PCR روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شد تا اطمینان حاصل شود که واکنش قطعه DNA تقویتشدهای از اندازه مورد انتظار را دارد.
برای ارزیابی محصولات PCR به روش الکتروفورز روی ژل آگارز تعیین کیفیت محصولات حاصله انجام شد. برای اندازهگیری بیان ژنهای فاکتورهای رشد فیبروبلاستی-1، اپیدرمال، آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 تکثیر ژن توسط واکنش PCR Real time با استفاده از مستر میکس سایبرگرین(Applied Biosystems, Warrington, UK) در یک سیستم تشخیص توالی ABI 7300 ،(Applied Biosystems, Foster City, CA) انجام شد. تعیین کمیت نسبی درReal time PCR بهوسیله اندازهگیری افزایش تشعشع فلورسنس در نتیجه اتصال رنگ سایبرگرین انجام شد. اجزای واکنش Real time PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر و غلظت نهایی مواد در جدول شماره 2 نشان داده شده است.
برنامه حرارتی برای تکثیر ژنها با استفاده از روش Real time PCR مطابق جدول شماره 3 بود. از هیپوگزانتین فسفو ریبوزیل ترانسفراز بهعنوان ژن کنترل استفاده شد. منحنیهای استاندارد نسبی با رقتهای سریال تولید شده و همه نمونهها در 3 نسخه اجرا شدند. توالی آغازگرهای PCR در جدول شماره 1 ذکر شده است. منحنی ذوب بهوسیله اندازهگیری تغییرات میزان فلورسنس در زمانهای مختلف بهوسیله دستگاه Real time PCR رسم شد. پس از انجام واکنش تکثیر به روش Relative Quantitative Real time PCR، دادههای خام بهصورت CT از دستگاه استخراج شد. دادههای CT برای تعیین مقدار هر ژن / mRNA موجود نسبت به هر نمونه استفاده شد و تغییر نسبی سطح RNA هدف با استفاده از رابطه2-ΔΔCT (لیواک و اشمیتگن 2001) محاسبه شد.
بررسی تکثیر اختصاصی محصولات Real Tme PCR
برای بررسی اختصاصیت پرایمرهای طراحیشده و حصول اطمینان از تکثیر قطعات اختصاصی هر ژن و عدم حضور محصولات غیراختصاصی و پرایمر دایمر، محصولات نهایی حاصل از Real Tme PCR روی ژل 1 درصد آگارز بارگذاری و الکتروفورز شدند. در این بررسی، محصولات بارگذاریشده، تنها یک باند (تکباند) را روی ژل نشان میدهند که میتوان به اختصاصی بودن پرایمرهای طراحیشده و نبود آلودگی پی برد. همچنین با مشاهده تکباند قوی برای هر پرایمر میتوان استنباط کرد که شرایط بهینه برای واکنش PCR وجود داشته و نکات اصلی در طراحی هر پرایمر شامل میزان GC، دمای Tm و اندازه پرایمر به درستی انتخاب شده است که به این ترتیب از تکثیر قطعات غیراختصاصی و پرایمر دایمرها جلوگیری شد.
تجزیهوتحلیل آماری دادهها
تجزیهوتحلیل آماری دادهها با استفاده از روش تجزیه واریانس در نرمافزار R انجام شد. همچنین مقایسه دوبهدوی میانگین تیمارها نیز با استفاده از روش توکی انجام شد و گروههای دارای اختلاف معنادار با حروف الفبایی متفاوت مشخص شدند. مقدار 05/0>P معنادار در نظر گرفته شد. نمودارها در محیط نرمافزار اکسل ترسیم شد.
یافتهها
بررسی تکثیر اختصاصی محصولات Real Tme PCR
ژن فاکتور رشد اپیدرمال باند 198 جفتبازی (bp)، ژن فاکتورهای رشد آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 باند 189 جفتبازی (bp)، ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 باند 122 جفتبازی (bp) و همچنین ژن هیپوگزانتین فسفو ریبوزیل ترانسفراز باند 131 جفتبازی (bp) روی ژل آگارز دارد و از آنجا که این 5 ژن باند اختصاصی دادند، یعنی تکباند روی ژل ظاهر شدند، پس میتوان نتیجه گرفت که پرایمر دایمر ندارند و پرایمرهای طراحیشده برای این 3 ژن اختصاصی عمل میکنند (تصویر شماره 1).
نتایج مربوط به اندازهگیری میزان بیان ژنهای فاکتورهای رشد فیبروبلاستی-1، اپیدرمال، آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 با روشReal Time PCR در گروه کنترل، سالین و ترکیب عصاره مُورد و روغن زیتون در تصویر شماره 2 نشان داده شده است.
بررسی میزان بیان ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1
نتایج حاصل از بررسی میانگین میزان بیان ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 نشان داد که افزایش معناداری در میزان بیان ژن گروه تیمار با ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون پس از 5، 10 و 15 روز نسبت به گروه تیمار با سالین و کنترل اتفاق افتاد (05/0>P). بیشترین میزان بیان ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 نیز پس از گذشت 15 روز با تیمار عصاره برگ مُورد و روغن زیتون با میانگین 37/1098 مشاهده شد (تصویر شماره 2).
بررسی میزان بیان ژن فاکتور رشد شبهانسولین-1
نتایج حاصل از بررسی میانگین میزان بیان ژن فاکتور رشد شبهانسولین-1 نشان داد که افزایش معناداری در میزان بیان ژن گروه تیمار با ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون پس از 5، 10 و 15 روز نسبت به گروه تیمار با سالین و کنترل اتفاق افتاد (05/0>P). بیشترین میزان بیان ژن فاکتور رشد شبهانسولین-1 نیز پس از گذشت 15 روز با تیمار عصاره برگ مُورد و روغن زیتون با میانگین 03/124 مشاهده شد (تصویر شماره 2).
بررسی میزان بیان ژن فاکتور رشد اپیدرمال
نتایج حاصل از بررسی میانگین میزان بیان ژن فاکتور رشد اپیدرمال نشان داد که افزایش معناداری در میزان بیان ژن گروه تیمار با ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون پس از 5، 10 و 15 روز نسبت به گروه تیمار با سالین و کنترل اتفاق افتاد (05/0>P). بیشترین میزان بیان فاکتور رشد اپیدرمال نیز پس از گذشت 15 روز با تیمار عصاره برگ مُورد و روغن زیتون با میانگین 89/68 مشاهده شد (تصویر شماره 2).
بررسی میزان بیان ژن فاکتور رشد آندوتلیال عروقی
نتایج حاصل از بررسی میانگین میزان بیان ژن فاکتور رشد آندوتلیال عروقی نشان داد که افزایش معناداری در میزان بیان ژن گروه تیمار با ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون پس از 5، 10 و 15 روز نسبت به گروه تیمار با سالین و کنترل اتفاق افتاد (05/0>P). بیشترین میزان بیان ژن فاکتور رشد آندوتلیال عروقی نیز پس از گذشت 15 روز با تیمار عصاره برگ مُورد و روغن زیتون با میانگین 48/12 مشاهده شد (تصویر شماره 2).
نتایج حاصل از مقایسه میزان بیان 4 ژن ذکرشده در تصویر شماره 3 نشان داد که تیمار با ترکیب عصاره مُورد و روغن زیتون بیشترین تأثیر را در افزایش بیان ژن فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 (به مقدار 37/1098) نسبت به سایر ژنهای اندازهگیریشده دارد.
بحث
نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داد که تیمار با ترکیب عصاره اتانولی برگ مُورد و روغن زیتون در محل زخم، موجب افزایش بیان ژنهای فاکتورهای رشد آندوتلیال عروقی و شبهانسولین-1 و بهعنوان عوامل مهم در ترمیم زخمهای پوستی در موشها شد. نتایج حاصل از این پژوهش نشان میدهد ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون در تسریع روند ترمیم زخمهای پوستی مؤثر است.
در مطالعه قبلی که نعمتی و همکاران روی ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون بر بهبود زخم پوستی موشهای Balb/c در مقایسه با کرم سولفادیازین نقره 1 درصد انجام دادند، نشان داده شد که تیمار با ترکیب عصاره اتانولی برگ گیاه مُورد و روغن زیتون موجب افزایش معناداری در درصد بهبود زخم، ضخامت پوست، قطر فولیکولهای مو، نسبت به گروه دریافتکننده کرم سولفادیازین نقره 1 درصد شد. همچنین افزایش معناداری در میزان تشکیل کلاژن و رگزایی مشاهده شد.
این نتایج نشاندهنده تسریع روند بهبود زخم در نمونههای تحت تیمار با ترکیب عصاره مُورد و روغن زیتون بوده است. آنها همچنین نشان دادند استفاده از عصاره برگ مُورد و روغن زیتون باعث تسریع انتقال از مرحله التهابی به مرحله هایپرپلازی فیبروبلاست بهدلیل افزایش در سنتز کلاژن و عروق خونی میشود [12].
آلم و همکاران در مطالعه خود نشان دادند که تیمار با پماد عصاره برگ مُورد باعث تسریع در آغاز فرایند بهبود شده و باعث افزایش سرعت گذر از فاز التهابی و وارد شدن به فاز فیبروپلازی و در نهایت در افزایش روند بهبود زخم میشود [13]. قرب غاز زاده و همکاران و همکاران نشان دادند که پماد گیاه مُورد موجب تعدیل التهاب و مانع از تخریب بیشتر بافتی میشود و همچنین در مطالعهای که روی تأثیر آلوئهورا بر ترمیم زخم انجام دادند، به این نتیجه دست یافتند که خانواده فاکتور رشد اپیدرمی از پلاکتها و ماکروفاژها در محل آسیب و زخم در بافت تولید و ترشح شده و پس از ترشح در روند تقسیم میتوز، اپیتلیزاسیون، مهاجرت گلبولهای سفید به محل زخم و تا حد کمتری در آنژیوژنز و افزایش ترشح رشتههای کلاژن در محل زخم فعالیت میکنند و ژن فاکتور رشد اپیدرمال باعث ترمیم زخم در موشهای مورد آزمایش میشود [14].
ایشی و همکاران و ویجیوان و همکاران در پژوهش خود که بر رسپتور فاکتور رشد اپیدرمی انجام دادند، نشان دادند که رسپتور فاکتور رشد اپیدرمی موجب افزایش تکثیر سلولی در محل زخم میشود و مقدار رسپتور فاکتور رشد اپیدرمیای که در یک زخم بیان میشود، بهطور قابلتوجهی با میزان ترمیم زخم در ارتباط است. مشخص شد که فاکتور رشد اپیدرمال رگزایی را از طریق مسیر فسفاتیدیل اینوزیتول 3-کیناز / پروتئین کینازB (pl3k/Akt) و سیگنالدهی خارج سلولی تنظیمکننده 2/1 (ERK1/2) از طریق مسیرهای با واسطه فاکتور رشد آندوتلیال عروقی افزایش میدهد [15]. همچنین فاکتور رشد اپیدرمال یک جاذب شیمیایی قوی برای مهاجرت کراتینوسیتها برای اپیتلیالیزاسیون زخم است [16].
باسو و همکاران در مطالعهای که بر میزان انتقال فاکتور رشد بتا و فاکتور رشد شبهانسولینی در محل ترمیم زخم پرداختند، به این نتیجه دست یافتند که فاکتور رشد شبهانسولینی -1 همراه با سایر فاکتورهای رشد نظیر فاکتور رشد مشتق از پلاکتها نقش مهمی در فرایند ترمیم زخم داشته، بهطوری که باعث افزایش ضخامت درم و اپیدرم میشوند [17].
در پژوهش دیگری که بالاجی و همکاران درباره فاکتور رشد شبهانسولین-1 انجام دادند، نشان داده شد که این فاکتور رشد یک کراتینوسیت میتوژن است و از طریق مسیر وابسته به فاکتور رشد آندوتلیال عروقی (فاکتور رشد اندوتلیال عروقی) باعث رگزایی و بهبود زخم میشود [18]. خانواده فاکتور رشد آندوتلیال عروقی نقش مهمی در نفوذپذیری عروق خونی و اتساع عروق دارد. نشان داده شده است که فاکتور رشد آندوتلیال عروقی رشد عروق خونی جدید را در طول زخم تثبیت میکند[ 19].
خون و عوامل مشتق از خون حاوی فاکتورهای رشد و سیتوکینهایی هستند که میتوانند روند ترمیم زخم طبیعی را بهبود بخشند. انتقال تعداد زیادی از فاکتورهای رشد از قبیل PDGF-BB, TGF-B1, FGF-2, ، آندوتلیال عروقی و اپیدرمال از طریق خون به محل زخم، روشی ساده برای افزایش ترمیم زخم و رگزایی است [20].
همچنین ژو و همکاران با مطالعه روی تأثیر فاکتور رشد فیبروبلاستی بنیادی در ترمیم جای زخم به این نتیجه رسیدند که افزایش میزان بیان فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 تأثیر بسزایی در ترمیم جای زخم دارد [21]. خانواده فاکتور رشد اپیدرمال با رگزایی و اپیتلیالیزاسیون رگ ارتباط قوی دارند [22-25]. لیگاندهای فاکتور رشد اپیدرمال به گیرندههای خود متصل شده و رگزایی و مهاجرت سلولهای آندوتلیال را در محل زخم افزایش میدهند [26]. در مطالعه حاضر، افزایش بیان ژن فاکتور رشد اپیدرمال در روند ترمیم زخم بسیار چشمگیر بوده و این تأثیر بهخصوص در روز 15 آزمایش بیشتر از روزهای دیگر بوده است.
ﻧﻘﺶ آﻧﺘﯽاﮐﺴﯿﺪانی ﻗﻮی ویﺘﺎﻣﯿﻦﻫﺎیC ،A ،E و ترکیبات فلاونوییدی و عناصری مثل روی، مس و سلنیوم در ﺗﺴـﺮیﻊ ﺗﺮﻣﯿﻢ زﺧﻢ به کرات ثابت شده است [27]. بر اساس یافتههای ملگیزو رودریگز و همکاران، زیتون حاوی مقادیر زیادی از ترکیبات آنتیاکسیدانی است که حضور این ترکیبات نقش مؤثری در ترمیم بافتهای تخریبشده و التیام زخمهای پوستی دارد. این امر به خاصیت آنتیاکسیدانی پلیفنلهای آن مربوط میشـود و در خصوص مقاومت در برابر استرس اکسیداتیو (بالا بردن غلظـت لیپـوپروتئینهای بـا دانسیته بالا و پایین آوردن لیپوپروتئینهای با دانسیته پـایین) روغـن زیتـون مـؤثرتر از ترکیباتش به صورت مجزاست [28].
نتیجهگیری
یافتههای پژوهش حاضر نشاندهنده تأثیرگذاری چشمگیر ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون در تسریع دوره ترمیم کامل در محل زخمهاست. مطالعات مولکولی در تحقیق حاضر نشاندهنده تأثیر مثبت ترکیب عصاره برگ مُورد و روغن زیتون بر بیان ژن فاکتور رشد آندوتلیال عروقی، فاکتور رشد اپیدرمال، فاکتور رشد فیبروبلاستی-1 و فاکتور رشد شبهانسولین-1 در پوست آسیبدیده موشها و سرعت ترمیم و بهبود زخم از طریق افزایش بیان فاکتورهای رشد مذکور و خونرسانی به محل زخم است.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مقاله با شماره 11662 و با کد اخلاق IR.MAZUMS.REC.1400.539 به تأیید کمیته اخلاق دانشگاه علومپزشکی مازندران رسیده است.
حامی مالی
این پژوهش هیچگونه کمک مالی از سازمانهای دولتی، خصوصی و غیرانتفاعی دریافت نکرده است.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش همه بخشهای پژوهش حاضر مشارکت داشتهاند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
ژنتیک
دریافت: 1401/7/18 | پذیرش: 1401/11/30 | انتشار: 1402/1/10
دریافت: 1401/7/18 | پذیرش: 1401/11/30 | انتشار: 1402/1/10
فهرست منابع
1. Kebriti K, Naderi MS, Tabaie SM, Hesami Tackllou S. [Herbal medicine efficiency in wound healing (Persian)]. J Lasers Med. 2020; 16(4):41-32. [Link]
2. Alvites R, Branquinho M, Sousa AC, Lopes B, Sousa P, Maurício AC. Mesenchymal stem/stromal cells and their paracrine activity-immunomodulation mechanisms and how to influence the therapeutic potential. Pharmaceutics. 2022; 14(2):381. [DOI:10.3390/pharmaceutics14020381] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/pharmaceutics14020381]
3. Garoufalia Z, Papadopetraki A, Karatza E, Vardakostas D, Philippou A, Kouraklis G, et al. Insulin-like growth factor-I and wound healing, a potential answer to non-healing wounds: A systematic review of the literature and future perspectives. Biomed Rep. 2021; 15(2):66. [DOI:10.3892/br.2021.1442] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3892/br.2021.1442]
4. Scala P, Rehak L, Giudice V, Ciaglia E, Puca AA, Selleri C, et al. Stem cell and macrophage roles in skeletal muscle regenerative medicine. Int J Mol Sci. 2021; 22(19):10867. [DOI:10.3390/ijms221910867] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/ijms221910867]
5. Garoufalia Z, Papadopetraki A, Karatza E, Vardakostas D, Philippou A, Kouraklis G, et al. Insulin-like growth factor-I and wound healing, a potential answer to non-healing wounds: A systematic review of the literature and future perspectives. Biomed Rep. 2021; 15(2):66. [DOI:10.3892/br.2021.1442] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3892/br.2021.1442]
6. Blanco-Fernandez B, Castaño O, Mateos-Timoneda MÁ, Engel E, Pérez-Amodio S. Nanotechnology approaches in chronic wound healing. Adv Wound Care. 2021; 10(5):234-56. [DOI:10.1089/wound.2019.1094] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1089/wound.2019.1094]
7. Zhu Y, Wang Y, Jia Y, Xu J, Chai Y. Roxadustat promotes angiogenesis through HIF-1α/VEGF/VEGFR2 signaling and accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats. Wound Repair Regen. 2019; 27(4):324-34. [DOI:10.1111/wrr.12708] [PMID] [DOI:10.1111/wrr.12708]
8. Haj Ebrahimi Z, Naderi MS, Tabaie SM. [Study of gene expression and nanotechnology in wound healing process (Persian)]. J Lasers Med. 2016; 13(2 & 3):50-63. [Link]
9. Rezaie A, Mohajeri D, Khamene B, Nazeri M, Shishehgar R, Zakhireh S. Effect of myrtus communis on healing of the experimental skin wounds on rats and its comparison with zinc oxide. Curr Res J Biol Sci. 2012; 4(2):176-85. [Link]
10. Goli M, Samare Mousavi S, Rahbarian R, Rajabiyan M. [The effect of crocin and safranal components of saffron on skin wound healing in streptozotocin-induced diabetic rat (Persian)]. Jundishapur Sci Med J. 2022; 21(1):42-53. [DOI:10.32598/JSMJ.21.1.2358] [DOI:10.32598/JSMJ.21.1.2358]
11. Massoud D, Fouda MMA, Sarhan M, Salama SG, Khalifa HS. Topical application of Aloe gel and/or olive oil combination promotes the wound healing properties of streptozotocin-induced diabetic rats. Environ Sci Pollut Res Int. 2022; 29(39):59727-35. [DOI:10.1007/s11356-022-20100-9] [PMID] [DOI:10.1007/s11356-022-20100-9]
12. Nemati F, Ataee R, Gorji F, Houseini ST, Lotfvarzi A, Bagheri Hashem Abad A. [The effect of combining mord (Myrtus communis) leaf extract and olive oil (Olea europaea) in comparison with silver sulfadiazine cream on skin wound healing in Balb/c mice (Persian)]. Sci Res Q J Biol Sci Iran. 2022; 16(4):15-24. [link]
13. Aleem M, Anis M. Therapeutic potential of Habb-ul-Aas (Myrtus communis Linn.) with unani perspective and modern pharmacology: A review. J Pharmacogn Phytochemistry. 2021; 10(1):910-23. [DOI:10.22271/phyto.2021.v10.i1m.13452] [DOI:10.22271/phyto.2021.v10.i1m.13452]
14. Gharaboghaz MNZ, Farahpour MR, Saghaie S. Topical co-administration of Teucrium polium hydroethanolic extract and Aloe vera gel triggered wound healing by accelerating cell proliferation in diabetic mouse model. Biomed Pharmacother. 2020; 127:110189. [DOI:10.1016/j.biopha.2020.110189] [PMID] [DOI:10.1016/j.biopha.2020.110189]
15. Ishii T, Warabi E, Mann GE. Mechanisms underlying unidirectional laminar shear stress-mediated Nrf2 activation in endothelial cells: Amplification of low shear stress signaling by primary cilia. Redox Biol. 2021; 46:102103. [DOI:10.1016/j.redox.2021.102103] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1016/j.redox.2021.102103]
16. Vijayan A, Sabareeswaran A, Vinod Kumar GS. PEG grafted chitosan scaffold for dual growth factor delivery for enhanced wound healing. Sci Rep. 2019; 9(1):19165. [DOI:10.1038/s41598-019-55214-7] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1038/s41598-019-55214-7]
17. Basu S, Goswami AG, David LE, Mudge E. Psychological stress on wound healing: A silent player in a complex background. Int J Low Extrem Wounds. 2022; 15347346221077571.[DOI:10.1177/15347346221077571] [PMID] [DOI:10.1177/15347346221077571]
18. Balaji S, LeSaint M, Bhattacharya SS, Moles C, Dhamija Y, Kidd M, et al. Adenoviral-mediated gene transfer of insulin-like growth factor 1 enhances wound healing and induces angiogenesis. J Surg Res. 2014; 190(1):367-77. [DOI:10.1016/j.jss.2014.02.051] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1016/j.jss.2014.02.051]
19. Johnson T, Zhao L, Manuel G, Taylor H, Liu D. Approaches to therapeutic angiogenesis for ischemic heart disease. J Mol Med. 2019; 97(2):141-51. [DOI:10.1007/s00109-018-1729-3] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1007/s00109-018-1729-3]
20. Zhang Y, Wang ZL, Deng ZP, Wang ZL, Song F, Zhu LL. Emerging delivery strategies of platelet-rich plasma with hydrogels for wound healing. Adv Polym Technol. 2022; 2022:1-11. [DOI:10.1155/2022/5446291] [DOI:10.1155/2022/5446291]
21. Zhu J, Zhang M, Gao Y, Qin X, Zhang T, Cui W, et al. Tetrahedral framework nucleic acids promote scarless healing of cutaneous wounds via the AKT-signaling pathway. Signal Transduct Target Ther. 2020; 5(1):120. [DOI:10.1038/s41392-020-0173-3] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1038/s41392-020-0173-3]
22. Koike Y, Yozaki M, Utani A, Murota H. Fibroblast growth factor 2 accelerates the epithelial-mesenchymal transition in keratinocytes during wound healing process. Sci Rep. 2020; 10(1):18545. [DOI:10.1038/s41598-020-75584-7] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1038/s41598-020-75584-7]
23. Tottoli EM, Dorati R, Genta I, Chiesa E, Pisani S, Conti B. Skin wound healing process and new emerging technologies for skin wound care and regeneration. Pharmaceutics. 2020; 12(8):735. [DOI:10.3390/pharmaceutics12080735] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/pharmaceutics12080735]
24. Bártolo I, Reis RL, Marques AP, Cerqueira MT. Keratinocyte growth factor-based strategies for wound re-epithelialization. Tissue Eng Part B Rev. 2022; 28(3):665-76. [DOI:10.1089/ten.teb.2021.0030] [PMID] [DOI:10.1089/ten.teb.2021.0030]
25. Blaber SI, Diaz J, Blaber M. Accelerated healing in NONcNZO10/LtJ type 2 diabetic mice by FGF-1. Wound Repair Regen. 2015; 23(4):538-49. [DOI:10.1111/wrr.12305] [PMID] [DOI:10.1111/wrr.12305]
26. Ronca R, Giacomini A, Rusnati M, Presta M. The potential of fibroblast growth factor/fibroblast growth factor receptor signaling as a therapeutic target in tumor angiogenesis. Expert Opin Ther Targets. 2015; 19(10):1361-77. [DOI:10.1517/14728222.2015.1062475] [PMID] [DOI:10.1517/14728222.2015.1062475]
27. Michalak M, Pierzak M, Kręcisz B, Suliga E. Bioactive compounds for skin health: A review. Nutrients. 2021; 13(1):203. [DOI:10.3390/nu13010203] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/nu13010203]
28. Melguizo-Rodríguez L, de Luna-Bertos E, Ramos-Torrecillas J, Illescas-Montesa R, Costela-Ruiz VJ, García-Martínez O. Potential effects of phenolic compounds that can be found in olive oil on wound healing. Foods. 2021; 10(7):1642. [DOI:10.3390/foods10071642] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/foods10071642]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
