جلد 17 -
جلد 17 - صفحات 35-24 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Ethics code: IR.IAU.FALA.REC.1399.061
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Aboutalebi A, Mohammadi-Sichani M, Naghavi N. Detection of Brucella militensis in the Serum of Patients Suspected of Brucellosis by the Omp31 Gene Amplification, Compared to the Serological Diagnostic Tests. Qom Univ Med Sci J 2023; 17 : 44.4
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3624-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3624-fa.html
ابوطالبی عاطفه، محمدی سیچانی مریم، نقوی نفیسه السادات. تشخیص مولکولی بروسلا ملیتنسیس در سرم بیماران مشکوک به تب مالت با بررسی ژن omp31 و مقایسه با نتایج آزمون‌های سرولوژیک. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1402; 17 () :24-35
1- گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران.
2- گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران. ،Ma.Mohammadi1347@iau.ac.ir
2- گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران. ،
متن کامل [PDF 4049 kb]
(241 دریافت)
| چکیده (HTML) (501 مشاهده)
متن کامل: (267 مشاهده)
مقدمه
ﺑﺮوﺳﻠﻮز یﮑﯽ از مهم‌‌ترین ﺑﯿﻤﺎریﻫﺎی ﻋﻔﻮﻧﯽ ﻣﺸﺘﺮک ﺑﯿﻦ اﻧﺴﺎن و دام است که معمولاًً ﻣﺼﺮفﮐﻨﻨﺪﮔﺎن ﻓﺮآوردهﻫﺎی ﺷﯿﺮ ﺧﺎم آﻟﻮده، ﮐﺸﺎورزان، داﻣﭙﺮوران، ﻗﺼﺎﺑﺎن و داﻣﭙﺰﺷﮑﺎن به آن مبتلا می‌شوند. این بیماری قابل انتقال از انسان به انسان نیست و بر اساس مطالعات صورت‌گرفته، تنها بین انسان و حیوان حامل آن، همچنین از طریق تماس مستقیم با حیوانات آلوده و از طریق مصرف فرآورده‌های لبنی غیرپاستوریزه و خام قابل انتقال است [1]. گونه‌های مختلفی از بروسلاها توانایی ایجاد بیماری در انسان را دارند اما اصلی‌‌ترین گونه آلوده‌کننده انسان که شیوع بیشتری در سراسر جهان دارد، بروسلا ملیتنسیس است [2، 3].
کشت خون به‌عنوان استاندارد طلایی در تشخیص بروسلوز شناخته می‌شود، اما این روش محدودیت‌هایی از نظر زمان‌بر بودن، نیاز به محیط کشت اختصاصی، نیاز به ایمنی زیستی سطح 3 و افراد متخصص دارد و نتایج منفی کاذب آن زیاد است [4، 5]. روش‌های جایگزین تشخیصی تب مالت در غیاب امکانات کشت، آزمایش‌های سرولوژی مانند رز بنگال، آگلوتیناسیون سرم و آزمایش کومبس است که براساس واکنش آنتی‌‌بادی‌ها در برابر لیپوپلی‌ساکارید صاف دیواره باکتری طراحی شده‌اند. به‌طور معمول از آزمون رز بنگال به‌عنوان آزمایش غربالگری استفاده می‌شود و نمونه‌های مثبت با آگلوتیناسیون سرم تأیید می‌شوند [3].
آزمون کومبس رایت در صورتی انجام می‌شود که تست رایت منفی و پزشک به فاز مزمن این بیماری مشکوک باشد. آزمون کومبس رایت در بررسی‌های اپیدمیولوژیکی بروسلوز، به‌علت شناسایی انواع IgG مفید است، زیرا این آنتی‌‌بادی‌های ناقص علی‌رغم ترکیب شدن با آنتی‌‌ژن‌های سلولی، قادر به ایجاد واکنش آگلوتیناسیون نیستند. آزمون 2مرکاپتواتانول جهت مشخص کردن کلاس آنتی‌‌بادی‌های تولیدشده در عفونت با بروسلاها و نیز مشخص شدن مرحله بیماری بروسلوز انجام می‌شود. اساس این آزمایش اندازه‌گیری IgG است زیرا پیوند دی‌سولفیدی موجود در ساختار احیاشده و این آنتی‌بادی به مولکول‌های منومری تفکیک می‌شوند و بنابراین قادر به ایجاد آگلوتیناسیون نخواهند بود. روش آگلوتیناسیون بر پایه ژل نیز به‌دلیل کوتاه‌تر بودن زمان انجام آزمون نسبت به سایر روش‌های سرولوژیک، می‌تواند در موارد اورژانس کاربرد داشته باشد. نتایج این روش معمولاًً با نتایج آزمایش کومبس رایت تطابق دارد [6].
باوجوداین، تکنیک‌های مبتنی بر تشخیص مولکولی ابزار بسیار مؤثری برای تشخیص گونه‌های بروسلا هستند [7]. آزمایش‌های سرولوژیکی مرسوم، نتایج مثبت کاذب دارند [8]. بنابراین، تلاش بر این بوده است که از پروتئین‌های اختصاصی بروسلا، به‌خصوص سومین گروه از پروتئین‌های غشای خارجی در تشخیص‌های سرولوژیک و مولکولی آن‌ها استفاده شود. این گروه شامل Omp25 و Omp31 است که 34 درصد هویت مشترک دارند. پروتئین Omp31 در گونه‌های بروسلا بسیار حفاظت شده است. پروتئین Omp31 نقش مهمی در تحریک سلول‌های
CD8+ T و CD4+ T دارد و آنتی‌بادی ضد آن علیه بروسلا ملیتنسیس در افراد آلوده شناسایی شده است [9]. با استفاده از پروتئین Omp31 بروسلا ملیتنسیس به‌صورت خالص‌شده و نوترکیب، تشخیص این باکتری در سرم انسان و حیوانات مبتلا به بروسلوز به روش سنجش ایمونوسوربنت پیوندی با روش الایزا موفقیت‌آمیز بوده است [10]. به همین دلیل، ژن کدکننده Omp31 در مطالعه حاضر برای تشخیص مولکولی اختصاصی بروسلا ملیتنسیس استفاده شد.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه از 200 فرد مشکوک به بروسلوز که بنابر توصیه پزشک و براساس علائم بالینی به آزمایشگاه‌های تشخیص طبی در شهر اصفهان مراجعه کرده بودند، پس از تکمیل فرم پرسش‌نامه و فرم رضایت، نمونه خون گرفته شد. نمونه‌های خون در دو لوله جداگانه، یکی حاوی هپارین جهت انجام آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و دیگری فاقد هپارین به‌منظور جداسازی سرم و انجام آزمایش‌های سرولوژیک، تقسیم و به بخش میکروب‌شناسی آزمایشگاه ارجاع داده شد. سرم نمونه‌ها جدا شدند و جهت انجام آزمون PCR، تا زمان انجام آزمایش در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
آزمون سرولوژیک رایت و کومبس رایت
ابتدا 50 میکرولیتر از سرم با 50 میکرولیتر آنتی‌ژن رز بنگال روی لام گسترده شد. پس از 2 دقیقه، نتایج آگلوتیناسیون زیر نور چراغ بررسی شد. در صورت مشاهده ذرات آگلوتینه، تست مثبت در نظر گرفته شد. در صورت منفی شدن آزمون رایت لامی، برای بررسی پدیده پروزون، رقت‌های 20/1، 40/1 و 80/1 از سرم بیمار همراه با آنتی‌ژن بروسلایی در 3 لوله تهیه شد و لوله‌ها 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. سپس نمونه‌ها با دور 2000 به‌مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند و آگلوتیناسیون موردبررسی قرار گرفت. نتایج آگلوتیناسیون مثبت و منفی هر نمونه ثبت شد. در صورت مثبت شدن آزمون رایت لامی، رقت‌های 20/1، 40/1، 80/1، 160/1، 320/1 و 640/1 از سرم بیمار همراه با آنتی‌ژن بروسلایی در 6 لوله تهیه شده و 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. نمونه‌ها با دور 2000 به‌مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند و آگلوتیناسیون موردبررسی قرار گرفت و نتایج به‌صورت تیتر هر رقت گزارش شد [11]. به‌منظور انجام آزمون کومبس رایت به 6 لوله آزمون رایت، یک قطره سرم ضد‌آنتی‌‌بادی‌های انسانی اضافه شد و مخلوط شدند. سپس به‌مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. لوله‌ها با 2000 دور به‌مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند و آگلوتیناسیون موردبررسی قرار گرفت [12].
به‌منظور انجام آزمون 2ME، رقت‌های 20/1، 40/1، 80/1، 160/1، 320/1 و 640/1 از سرم بیمار همراه با آنتی‌ژن بروسلایی مربوط به آزمون 2ME در 6 لوله تهیه شد و 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. نمونه‌ها با دور 2000 به‌مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند و آگلوتیناسیون موردبررسی قرار گرفت و نتایج به‌صورت تیتر هر رقت گزارش شد [11].
آزمون آگلوتیناسیون بر پایه ژل با کیت تشخیص بروسلوز انستیتو پاستور انجام شد. به‌منظور انجام این آزمایش، رقت‌های 20/1، 40/1، 80/1، 160/1، 320/1 و 640/1 از سرم بیمار همراه با آنتی‌ژن بروسلایی در چاهک‌های پلیت 96 خانه استریل ته Uشکل تهیه شد و میکروپلیت به‌مدت 30 ثانیه به‌آرامی تکان داده شد و 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. تشکیل کمپلکس آنتی‌ژن آنتی‌بادی به‌صورت دایره صورتی‌رنگ در چاهک‌ها موردبررسی قرار گرفت [13].
استخراج DNA
با استفاده از روش مولکولی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و به‌کمک پرایمرهای اختصاصی طراحی‌شده، شناسایی دقیق و نهایی بروسلا انجام شد. به‌منظور استخراج DNA از روش فنل/کلروفرم استفاده شد. در ابتدا برای از بین رفتن باکتری‌های فعال احتمالی، نمونه‌های سرم جمع‌آوری‌شده به‌مدت 5 دقیقه جوشانده شدند. سپس 500 میکرولیتر سرم همراه با 500 میکرولیتر بافر لیزکننده (Tris 100 میلی‌مولار با 6/7= pH و EDTA 2 میلی‌مولار با 8=pH و SDS 2/0 درصد و NaCl با غلظت نهایی 150 میلی‌مولار) در یک میکروتیوب استریل مخلوط شدند. در ادامه، 150 میکرولیتر فنل و کلروفرم به محتویات میکروتیوب اضافه و مخلوط شد. پس از به دست آمدن محلولی شیری‌رنگ، میکروتیوب به‌مدت 2 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد. میکروتیوب‌ها با دور 12000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و به‌مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند. محلول شفاف رویی حاوی DNA، با دقت جدا شد و هم‌حجم آن اتانول مطلق اضافه شد و به‌مدت 5 دقیقه در دمای 20- درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. به‌منظور رسوب دادن DNA، میکروتیوب به‌مدت 10 دقیقه با دور 12000 و دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ شد. پس از رسوب دادن DNA در میکروتیوب، الکل رویی دور ریخته شد و رسوب با اضافه کردن 500 میکرولیتر اتانول 70 درصد و سانتریفیوژ به‌مدت 5 دقیقه با دور 10000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، شست‌وشو داده شد. پس از تخلیه الکل رویی، رسوب در دمای اتاق خشک شد. درنهایت، رسوب در 25 میکرولیتر آب مقطر تزریقی حل شد و کیفیت DNA استخراج‌شده با الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد در بافر TBE 1X و رنگ‌آمیری ژل با رنگ Green Viewer موردبررسی قرار گرفت. ایجاد باند در ژل مؤید استخراج DNA با کیفیت بالا بود. DNA استخراج‌شده تا انجام مراحل بعدی پژوهش در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد [14].
تکثیر ژن Omp31 در بروسلا ملیتنسیس با روش PCR
به‌منظور طراحی پرایمرهای مورداستفاده در این تحقیق، ابتدا توالی مربوط به ژن Omp31 از باکتری بروسلا ملیتنسیس با شماره دسترسی NG-021140.1 از پایگاه اطلاعاتی NCBI دریافت شد و درنهایت به کمک نرم‌افزار Gene runner پرایمرها طراحی شدند. پرایمر پیشرو (5’-GTGGTGTTCAGGCCGGTTAC-3’) و معکوس (5’- CGCAGACTTGACCTTACCATAG-3’) با دمای ذوب 54 درجه سانتی‌گراد سنتز شدند [15]. مخلوط PCR شامل بافرPCR (1X) ، شMgCl2 (5/1 میلی‌مولار)، dNTPs (2/0 میلی‌مولار)، پرایمرهای پیشرو و معکوس (هرکدام با غلظت 4/0 میکرومولار) و DNA پلیمراز (یک واحد در کل مخلوط) تهیه شد. به مخلوط فوق 3 میکرولیتر DNA الگو اضافه شد و حجم کلی آن با آب دوبار تقطیر استریل به 25 میکرولیتر رسانده شد. واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر (Eppendorf، آلمان) انجام شد. برنامه دمایی و زمانی مورداستفاده شامل یک مرحله واسرشت اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 300 ثانیه، 30 چرخه شامل مراحل واسرشت در 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه، اتصال پرایمرها در دمای 56 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه و تکثیر در دمای 72 درجه سانتی‌گراد و یک مرحله تکثیر نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 220 ثانیه بود. پس از اتمام واکنش، باند حاصل از تکثیر ژن با الکتروفورز ژل آگارز یک درصد در بافر TBE 1X پس رنگ‌آمیری با رنگ Green Viewer، موردارزیابی قرار گرفت. همچنین، به‌منظور افزایش دقت و حساسیت آزمون، از روش الکتروفورز روی ژل پلی‌آکریل آمید نیزبرای تأیید صحت و اندازه قطعات تکثیرشده استفاده شد [16]. در این مطالعه از بروسلا ملیتنسیس سویه CIT31 که با شماره دسترسی CP025822 در مرکز ملی اطلاعات زیست فناوریثبت شده است به‌عنوان سویه کنترل‌مثبت استفاده شد.
یافته‌ها
ویژگی‌های جمعیت‌شناختی افراد مشکوک به بروسلوز واردشده به مطالعه در جدول شماره 1 ارائه شده است. در این مطالعه، 200 نمونه خون از 122 زن و 78 مرد با میانگین سنی 43/17±17/45 سال بررسی شد. بیماری در میانسالان 30 تا 60ساله (5/56 درصد)، زنان خانه‌دار (5/41 درصد) و افراد شهرنشین (5/75 درصد) بیشترین شیوع را داشت. بررسی علائم بالینی در این افراد مطابق تصویر شماره 1 نشان داد بیشترین فراوانی علائم بالینی بیماری در زنان، درد عضلانی (68 درصد) و در مردان، درد در ناحیه پا (3/62 درصد) است.
فراوانی بروسلوز براساس نتایج آزمون PCR
جهت شناسایی بروسلا از پرایمرهای اختصاصی ژن Omp31 بروسلا ملیتنسیس استفاده شد. نتایج حاصل از الکتروفورز ژل آگارز و ژل پلی‌آکریل آمید محصولات PCR در جدایه‌های موردمطالعه به‌ترتیب در تصویر شماره 2 و تصویر شماره 3 ارائه شده است.
مقایسه توزیع فراوانی بیماران مشکوک به ابتلا به بروسلوز براساس آزمون‌های سرولوژیک و آزمون PCR
در جدول شماره 2 توزیع فراوانی بیماران مشکوک به بروسلوز که به مطالعه وارد شدند، براساس آزمون‌های سرولوژیک در مقایسه با آزمون مولکولی PCR ارائه شده است.
بحث
در ایران، بروسلوز همچنان یک معضل بهداشتی اندمیک، هم در انسان و هم در دام به شمار می‌رود و علی‌رغم اجرای طرح ریشه‌کنی این بیماری در دام از دهه 50 خورشیدی، موارد ابتلا به این بیماری در انسان و دام به‌کرات گزارش می‌شود [17]. یکی از بهترین روش‌های تشخیصی بروسلوز در انسان، جداسازی ارگانیسم موردنظر است که این روش نیز دارای محدودیت‌هایی است. ازجمله این محدودیت‌ها، دریافت پاسخ مثبت به‌مدت 4 تا 6 روز و حتی 2 هفته و در مواردی بیش از 27 روز، به‌دلیل دوره انکوباسیون طولانی و همچنین خطر انتقال ارگانیسم به کارکنان آزمایشگاه حین کار کردن با آن است، به‌طوری که 2 درصد از کل موارد بروسلوز در آزمایشگاه ایجاد می‌شود. از مهم‌‌ترین محدودیت‌های تست‌های سرولوژیکی نیز می‌توان به مثبت بودن تیتر آنتی‌بادی پس از یک دوره طولانی درمان، منفی بودن تست‌های سرولوژیکی در ابتدای بیماری به‌دلیل ناکافی بودن تیتر آنتی‌بادی و ناکارآمدی این روش‌ها در تشخیص بیماری در موارد عود آن پس از درمان طولانی‌مدت با انواع آنتی‌بیوتیک‌ها اشاره کرد. ازاین‌رو محققان همواره به‌دنبال راهی برای تشخیص سریع و دقیق بیماری بروسلوز بوده‌اند [18].
روش PCR یکی از سریع‌ترین و دقیق‌ترین روش‌های تشخیص بروسلوز است. استفاده از این روش در دهه‌های اخیر بسیار گسترش یافته است و دارای مزایای بسیاری است. نداشتن محدودیت‌های موجود در روش کشت، تشخیص بیماری در کمتر از یک روز، حساسیت بالا، قدرت و قابلیت تکرار در زمان‌های مختلف و کم‌خطر بودن برای کارکنان از مهم‌‌ترین خصوصیات این روش است [19]. در تحقیق حاضر از مجموع 200 نمونه مشکوک به بروسلا، با روش PCR 29 نمونه با استفاده از پرایمرهای متصل‌شونده به ژن Omp31، مثبت ارزیابی شد که معادل 13 درصد نمونه‌ها بود. به‌طورکلی، نتایج حاصل از پژوهش حاضر نشان داد شناسایی باکتری با استفاده از PCR روشی بسیار دقیق و قابل اعتماد است. علاوه بر این، یکی از مهم‌‌ترین ویژگی‌های تکنیک PCR تشخیص سریع و تمایز گونه‌های مختلف است [20]. محققان بیان کردند که آزمایش‌های اسیدنوکلئیک مانند PCR فناوری‌های نسل جدید هستند که حساسیت بالاتری نسبت به کشت خون و ویژگی بهتری نسبت به آزمایش‌های سرولوژیک برای شناسایی عفونت بروسلوز دارند که با مطالعه حاضر مطابقت دارد [21]. گرشاسبی و همکاران گزارش کردند که حساسیت و ویژگی تکنیک PCR برای شناسایی بروسلوز به‌ترتیب 96 و 7/80 درصد بود که با مطالعه حاضر مطابقت دارد [21].
بررسی نتایج مطالعه حاضر نشان داد زنان بیشتر از مردان به بروسلوز مبتلا می‌شوند. این نتیجه با مطالعه زینلی مطابقت دارد [22]. هرچند در مطالعه حمزوی و همکاران نشان داده شده است که مردان بیشتر از زنان مبتلا شده‌اند [23]. همچنین امرو و همکاران بیان کردند که بروز بروسلوز در مردان 1/75 درصد و نسبت مرد به زن 3 به 1 است [24] که با مطالعه حاضر همخوانی دارد. با بررسی همه نتایج مشخص شده است که شیوع این بیماری در مردان به‌دلیل فعالیت بیشتر در دامپروری‌ها بیشتر است.
میانگین سنی افراد مبتلا به بروسلوز در پژوهش حاضر 30 تا 60 سال بود که با مطالعه محمدیان و همکاران همخوانی دارد [25]. باتوجه‌به نتایج به‌دست‌آمده، احتمال دارد علت این امر این باشد که این بیماری بیشتر در گروه سنی فعالان جامعه رخ می‌دهد. علاوه بر این نشان داده شده که این بیماری در دهه‌های دوم و سوم زندگی شیوع بیشتری دارد. این نتایج با مطالعه حوزوی و همکاران مطابقت دارد [23]. در مطالعه امرو و همکاران میزان بروز بروسلوز در گروه سنی 11 تا 20 سال 29 درصد گزارش شد که با مطالعه حاضر که در سنین بالاتر بروز بیشتری رخ داده بود مطابقت ندارد [24]. بررسی وضعیت اشتغال نشان داد اکثراً مبتلایان به بروسلوز خانه‌دار بوده‌اند. نتایج مطالعات متعددی با نتایج مطالعه حاضر همسو ست. به نظر می‌رسد شغل به‌عنوان یک عامل خطر بسیار مهم به وضعیت ارتباط فرد با دام وابسته است [26].
علاوه بر این، در مطالعه حاضر مشخص شد مصرف لبنیات غیرپاستوریزه به‌خصوص پنیر و شیر بیشترین فراوانی را در بروز بروسلوز دارد. تحقیقات بسیاری نشان داده‌اند تماس با دام و مصرف شیر و پنیر غیرپاستوریزه بیشترین فراوانی را در بین عوامل خطر داشته است. همچنین مشخص شده است در بسیاری از مناطق کنترل مؤثر بروسلوز گوسفند به‌طور قابل‌توجهی خطر ابتلا به بروسلوز انسانی را کاهش می‌دهد [27]. سادات و همکاران در مطالعه خود توصیه کردند که تشخیص بروسلوز با استفاده از تست الایزای غیرمستقیم، به‌دلیل ویژگی و حساسیت بالای این تست انجام شود [28].
علائم سیستمیک و غیراختصاصی بروسلوز و تشابه علائم بالینی آن با برخی بیماری‌های دیگر ضرورت تشخیص بالینی آن را دوچندان کرده است [16]. روش تشخیص مولکولی ارائه‌شده در مطالعه حاضر برای تشخیص این بیماری، با حساسیت و ویژگی 100 درصد برای تهیه کیت‌های آزمایشگاهی جهت استفاده در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی پیشنهاد می‌شود. مطالعات نشان می‌دهند سویه‌های بروسلا آبورتوس و بروسلا ملیتنسیس از طریق تجارت حیوانات به سراسر جهان منتقل شده‌اند و در برنامه‌های کنترل عوامل عفونی آتی مهم خواهند بود [29]. بنابراین، پیشرفت‌ها در فناوری تشخیص مولکولی نوین از طریق تکثیر نواحی اختصاصی در ژنوم، می‌تواند به تایپینگ از طریق توالی‌یابی لوکوس‌های ژنی چندگانه در ژنوم بروسلا، در مناطق اندمیک مختلف مانند ایران منجر شود [30].
نتیجه‌گیری
بروسلوز یکی از شایع‌‌ترین بیماری‌های عفونی مشترک بین انسان و دام همراه با گسترش جهانی است. این بیماری یک مشکل اساسی در بهداشت نیز به شمار می‌رود زیرا نه‌تنها به ایجاد عوارض بالینی منجر می‌شود بلکه عامل زیان‌های اقتصادی بسیار زیادی است و همواره در ایران بروز بالایی داشته است. امروزه چند آزمون سرولوژیک وجود دارد که آزمایشگاه‌های مختلف از آن‌ها برای تشخیص بروسلوز استفاده می‌کنند، اما با وجود مشکلات و محدودیت‌هایی که استفاده از این آزمون‌ها به‌همراه دارند، روش‌های دیگری همچون تشخیص مولکولی به‌عنوان روشی ساده، سریع و بسیار حساس به‌منظور تشخیص بروسلوز موردتوجه قرار گرفته است. باتوجه‌به نتایج حاصل از این تحقیق و تحقیقات مشابه دیگر، تشخیص عوامل عفونی با استفاده از آزمایش PCR در مقایسه با روش‌های سنتی می‌تواند روشی سریع و قابل اطمینان به شمار آید. حساسیت و اختصاصی بودن روش PCR در تشخیص بروسلوزیس 98 درصد است که بسیار بیشتر از سایر روش‌های تشخیصی است. مطالعه جمعیت‌شناختی بروسلوز تشخیص داده‌شده با روش PCR در بررسی حاضر از نظر گروه‌های سنی و شغلی مبتلایان و عوامل خطر مؤثر در ابتلا، با مطالعات قبلی همسو بود، اما علی‌رغم اینکه در اکثر مطالعات قبلی میزان شیوع در مردان بیشتر از زنان گزارش شده بود، در مطالعه حاضر نسبت ابتلای زنان در میان افراد موردمطالعه بیشتر از مردان بود که می‌تواند زنگ خطری برای علت‌یابی افزایش بروز بروسلوز در زنان باشد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه دارای تأییدیه از کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی، واحد فلاورجان به شماره IR.IAU.FALA.REC.1399.061است.
حامی مالی
این تحقیق هیچ کمک مالی از سازمان‌های تأمین مالی در بخش‌های عمومی، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در آماده‌سازی این مقاله مشارکت داشتند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از همکاری مدیر آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد فلاورجان تشکر و قدردانی می‌کنند.
ﺑﺮوﺳﻠﻮز یﮑﯽ از مهم‌‌ترین ﺑﯿﻤﺎریﻫﺎی ﻋﻔﻮﻧﯽ ﻣﺸﺘﺮک ﺑﯿﻦ اﻧﺴﺎن و دام است که معمولاًً ﻣﺼﺮفﮐﻨﻨﺪﮔﺎن ﻓﺮآوردهﻫﺎی ﺷﯿﺮ ﺧﺎم آﻟﻮده، ﮐﺸﺎورزان، داﻣﭙﺮوران، ﻗﺼﺎﺑﺎن و داﻣﭙﺰﺷﮑﺎن به آن مبتلا می‌شوند. این بیماری قابل انتقال از انسان به انسان نیست و بر اساس مطالعات صورت‌گرفته، تنها بین انسان و حیوان حامل آن، همچنین از طریق تماس مستقیم با حیوانات آلوده و از طریق مصرف فرآورده‌های لبنی غیرپاستوریزه و خام قابل انتقال است [1]. گونه‌های مختلفی از بروسلاها توانایی ایجاد بیماری در انسان را دارند اما اصلی‌‌ترین گونه آلوده‌کننده انسان که شیوع بیشتری در سراسر جهان دارد، بروسلا ملیتنسیس است [2، 3].
کشت خون به‌عنوان استاندارد طلایی در تشخیص بروسلوز شناخته می‌شود، اما این روش محدودیت‌هایی از نظر زمان‌بر بودن، نیاز به محیط کشت اختصاصی، نیاز به ایمنی زیستی سطح 3 و افراد متخصص دارد و نتایج منفی کاذب آن زیاد است [4، 5]. روش‌های جایگزین تشخیصی تب مالت در غیاب امکانات کشت، آزمایش‌های سرولوژی مانند رز بنگال، آگلوتیناسیون سرم و آزمایش کومبس است که براساس واکنش آنتی‌‌بادی‌ها در برابر لیپوپلی‌ساکارید صاف دیواره باکتری طراحی شده‌اند. به‌طور معمول از آزمون رز بنگال به‌عنوان آزمایش غربالگری استفاده می‌شود و نمونه‌های مثبت با آگلوتیناسیون سرم تأیید می‌شوند [3].
آزمون کومبس رایت در صورتی انجام می‌شود که تست رایت منفی و پزشک به فاز مزمن این بیماری مشکوک باشد. آزمون کومبس رایت در بررسی‌های اپیدمیولوژیکی بروسلوز، به‌علت شناسایی انواع IgG مفید است، زیرا این آنتی‌‌بادی‌های ناقص علی‌رغم ترکیب شدن با آنتی‌‌ژن‌های سلولی، قادر به ایجاد واکنش آگلوتیناسیون نیستند. آزمون 2مرکاپتواتانول جهت مشخص کردن کلاس آنتی‌‌بادی‌های تولیدشده در عفونت با بروسلاها و نیز مشخص شدن مرحله بیماری بروسلوز انجام می‌شود. اساس این آزمایش اندازه‌گیری IgG است زیرا پیوند دی‌سولفیدی موجود در ساختار احیاشده و این آنتی‌بادی به مولکول‌های منومری تفکیک می‌شوند و بنابراین قادر به ایجاد آگلوتیناسیون نخواهند بود. روش آگلوتیناسیون بر پایه ژل نیز به‌دلیل کوتاه‌تر بودن زمان انجام آزمون نسبت به سایر روش‌های سرولوژیک، می‌تواند در موارد اورژانس کاربرد داشته باشد. نتایج این روش معمولاًً با نتایج آزمایش کومبس رایت تطابق دارد [6].
باوجوداین، تکنیک‌های مبتنی بر تشخیص مولکولی ابزار بسیار مؤثری برای تشخیص گونه‌های بروسلا هستند [7]. آزمایش‌های سرولوژیکی مرسوم، نتایج مثبت کاذب دارند [8]. بنابراین، تلاش بر این بوده است که از پروتئین‌های اختصاصی بروسلا، به‌خصوص سومین گروه از پروتئین‌های غشای خارجی در تشخیص‌های سرولوژیک و مولکولی آن‌ها استفاده شود. این گروه شامل Omp25 و Omp31 است که 34 درصد هویت مشترک دارند. پروتئین Omp31 در گونه‌های بروسلا بسیار حفاظت شده است. پروتئین Omp31 نقش مهمی در تحریک سلول‌های
CD8+ T و CD4+ T دارد و آنتی‌بادی ضد آن علیه بروسلا ملیتنسیس در افراد آلوده شناسایی شده است [9]. با استفاده از پروتئین Omp31 بروسلا ملیتنسیس به‌صورت خالص‌شده و نوترکیب، تشخیص این باکتری در سرم انسان و حیوانات مبتلا به بروسلوز به روش سنجش ایمونوسوربنت پیوندی با روش الایزا موفقیت‌آمیز بوده است [10]. به همین دلیل، ژن کدکننده Omp31 در مطالعه حاضر برای تشخیص مولکولی اختصاصی بروسلا ملیتنسیس استفاده شد.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه از 200 فرد مشکوک به بروسلوز که بنابر توصیه پزشک و براساس علائم بالینی به آزمایشگاه‌های تشخیص طبی در شهر اصفهان مراجعه کرده بودند، پس از تکمیل فرم پرسش‌نامه و فرم رضایت، نمونه خون گرفته شد. نمونه‌های خون در دو لوله جداگانه، یکی حاوی هپارین جهت انجام آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و دیگری فاقد هپارین به‌منظور جداسازی سرم و انجام آزمایش‌های سرولوژیک، تقسیم و به بخش میکروب‌شناسی آزمایشگاه ارجاع داده شد. سرم نمونه‌ها جدا شدند و جهت انجام آزمون PCR، تا زمان انجام آزمایش در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
آزمون سرولوژیک رایت و کومبس رایت
ابتدا 50 میکرولیتر از سرم با 50 میکرولیتر آنتی‌ژن رز بنگال روی لام گسترده شد. پس از 2 دقیقه، نتایج آگلوتیناسیون زیر نور چراغ بررسی شد. در صورت مشاهده ذرات آگلوتینه، تست مثبت در نظر گرفته شد. در صورت منفی شدن آزمون رایت لامی، برای بررسی پدیده پروزون، رقت‌های 20/1، 40/1 و 80/1 از سرم بیمار همراه با آنتی‌ژن بروسلایی در 3 لوله تهیه شد و لوله‌ها 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. سپس نمونه‌ها با دور 2000 به‌مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند و آگلوتیناسیون موردبررسی قرار گرفت. نتایج آگلوتیناسیون مثبت و منفی هر نمونه ثبت شد. در صورت مثبت شدن آزمون رایت لامی، رقت‌های 20/1، 40/1، 80/1، 160/1، 320/1 و 640/1 از سرم بیمار همراه با آنتی‌ژن بروسلایی در 6 لوله تهیه شده و 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. نمونه‌ها با دور 2000 به‌مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند و آگلوتیناسیون موردبررسی قرار گرفت و نتایج به‌صورت تیتر هر رقت گزارش شد [11]. به‌منظور انجام آزمون کومبس رایت به 6 لوله آزمون رایت، یک قطره سرم ضد‌آنتی‌‌بادی‌های انسانی اضافه شد و مخلوط شدند. سپس به‌مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. لوله‌ها با 2000 دور به‌مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند و آگلوتیناسیون موردبررسی قرار گرفت [12].
به‌منظور انجام آزمون 2ME، رقت‌های 20/1، 40/1، 80/1، 160/1، 320/1 و 640/1 از سرم بیمار همراه با آنتی‌ژن بروسلایی مربوط به آزمون 2ME در 6 لوله تهیه شد و 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. نمونه‌ها با دور 2000 به‌مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شدند و آگلوتیناسیون موردبررسی قرار گرفت و نتایج به‌صورت تیتر هر رقت گزارش شد [11].
آزمون آگلوتیناسیون بر پایه ژل با کیت تشخیص بروسلوز انستیتو پاستور انجام شد. به‌منظور انجام این آزمایش، رقت‌های 20/1، 40/1، 80/1، 160/1، 320/1 و 640/1 از سرم بیمار همراه با آنتی‌ژن بروسلایی در چاهک‌های پلیت 96 خانه استریل ته Uشکل تهیه شد و میکروپلیت به‌مدت 30 ثانیه به‌آرامی تکان داده شد و 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. تشکیل کمپلکس آنتی‌ژن آنتی‌بادی به‌صورت دایره صورتی‌رنگ در چاهک‌ها موردبررسی قرار گرفت [13].
استخراج DNA
با استفاده از روش مولکولی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و به‌کمک پرایمرهای اختصاصی طراحی‌شده، شناسایی دقیق و نهایی بروسلا انجام شد. به‌منظور استخراج DNA از روش فنل/کلروفرم استفاده شد. در ابتدا برای از بین رفتن باکتری‌های فعال احتمالی، نمونه‌های سرم جمع‌آوری‌شده به‌مدت 5 دقیقه جوشانده شدند. سپس 500 میکرولیتر سرم همراه با 500 میکرولیتر بافر لیزکننده (Tris 100 میلی‌مولار با 6/7= pH و EDTA 2 میلی‌مولار با 8=pH و SDS 2/0 درصد و NaCl با غلظت نهایی 150 میلی‌مولار) در یک میکروتیوب استریل مخلوط شدند. در ادامه، 150 میکرولیتر فنل و کلروفرم به محتویات میکروتیوب اضافه و مخلوط شد. پس از به دست آمدن محلولی شیری‌رنگ، میکروتیوب به‌مدت 2 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد. میکروتیوب‌ها با دور 12000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و به‌مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند. محلول شفاف رویی حاوی DNA، با دقت جدا شد و هم‌حجم آن اتانول مطلق اضافه شد و به‌مدت 5 دقیقه در دمای 20- درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. به‌منظور رسوب دادن DNA، میکروتیوب به‌مدت 10 دقیقه با دور 12000 و دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ شد. پس از رسوب دادن DNA در میکروتیوب، الکل رویی دور ریخته شد و رسوب با اضافه کردن 500 میکرولیتر اتانول 70 درصد و سانتریفیوژ به‌مدت 5 دقیقه با دور 10000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، شست‌وشو داده شد. پس از تخلیه الکل رویی، رسوب در دمای اتاق خشک شد. درنهایت، رسوب در 25 میکرولیتر آب مقطر تزریقی حل شد و کیفیت DNA استخراج‌شده با الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد در بافر TBE 1X و رنگ‌آمیری ژل با رنگ Green Viewer موردبررسی قرار گرفت. ایجاد باند در ژل مؤید استخراج DNA با کیفیت بالا بود. DNA استخراج‌شده تا انجام مراحل بعدی پژوهش در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد [14].
تکثیر ژن Omp31 در بروسلا ملیتنسیس با روش PCR
به‌منظور طراحی پرایمرهای مورداستفاده در این تحقیق، ابتدا توالی مربوط به ژن Omp31 از باکتری بروسلا ملیتنسیس با شماره دسترسی NG-021140.1 از پایگاه اطلاعاتی NCBI دریافت شد و درنهایت به کمک نرم‌افزار Gene runner پرایمرها طراحی شدند. پرایمر پیشرو (5’-GTGGTGTTCAGGCCGGTTAC-3’) و معکوس (5’- CGCAGACTTGACCTTACCATAG-3’) با دمای ذوب 54 درجه سانتی‌گراد سنتز شدند [15]. مخلوط PCR شامل بافرPCR (1X) ، شMgCl2 (5/1 میلی‌مولار)، dNTPs (2/0 میلی‌مولار)، پرایمرهای پیشرو و معکوس (هرکدام با غلظت 4/0 میکرومولار) و DNA پلیمراز (یک واحد در کل مخلوط) تهیه شد. به مخلوط فوق 3 میکرولیتر DNA الگو اضافه شد و حجم کلی آن با آب دوبار تقطیر استریل به 25 میکرولیتر رسانده شد. واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر (Eppendorf، آلمان) انجام شد. برنامه دمایی و زمانی مورداستفاده شامل یک مرحله واسرشت اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 300 ثانیه، 30 چرخه شامل مراحل واسرشت در 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه، اتصال پرایمرها در دمای 56 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه و تکثیر در دمای 72 درجه سانتی‌گراد و یک مرحله تکثیر نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 220 ثانیه بود. پس از اتمام واکنش، باند حاصل از تکثیر ژن با الکتروفورز ژل آگارز یک درصد در بافر TBE 1X پس رنگ‌آمیری با رنگ Green Viewer، موردارزیابی قرار گرفت. همچنین، به‌منظور افزایش دقت و حساسیت آزمون، از روش الکتروفورز روی ژل پلی‌آکریل آمید نیزبرای تأیید صحت و اندازه قطعات تکثیرشده استفاده شد [16]. در این مطالعه از بروسلا ملیتنسیس سویه CIT31 که با شماره دسترسی CP025822 در مرکز ملی اطلاعات زیست فناوریثبت شده است به‌عنوان سویه کنترل‌مثبت استفاده شد.
یافته‌ها
ویژگی‌های جمعیت‌شناختی افراد مشکوک به بروسلوز واردشده به مطالعه در جدول شماره 1 ارائه شده است. در این مطالعه، 200 نمونه خون از 122 زن و 78 مرد با میانگین سنی 43/17±17/45 سال بررسی شد. بیماری در میانسالان 30 تا 60ساله (5/56 درصد)، زنان خانه‌دار (5/41 درصد) و افراد شهرنشین (5/75 درصد) بیشترین شیوع را داشت. بررسی علائم بالینی در این افراد مطابق تصویر شماره 1 نشان داد بیشترین فراوانی علائم بالینی بیماری در زنان، درد عضلانی (68 درصد) و در مردان، درد در ناحیه پا (3/62 درصد) است.
فراوانی بروسلوز براساس نتایج آزمون PCR
جهت شناسایی بروسلا از پرایمرهای اختصاصی ژن Omp31 بروسلا ملیتنسیس استفاده شد. نتایج حاصل از الکتروفورز ژل آگارز و ژل پلی‌آکریل آمید محصولات PCR در جدایه‌های موردمطالعه به‌ترتیب در تصویر شماره 2 و تصویر شماره 3 ارائه شده است.
مقایسه توزیع فراوانی بیماران مشکوک به ابتلا به بروسلوز براساس آزمون‌های سرولوژیک و آزمون PCR
در جدول شماره 2 توزیع فراوانی بیماران مشکوک به بروسلوز که به مطالعه وارد شدند، براساس آزمون‌های سرولوژیک در مقایسه با آزمون مولکولی PCR ارائه شده است.
بحث
در ایران، بروسلوز همچنان یک معضل بهداشتی اندمیک، هم در انسان و هم در دام به شمار می‌رود و علی‌رغم اجرای طرح ریشه‌کنی این بیماری در دام از دهه 50 خورشیدی، موارد ابتلا به این بیماری در انسان و دام به‌کرات گزارش می‌شود [17]. یکی از بهترین روش‌های تشخیصی بروسلوز در انسان، جداسازی ارگانیسم موردنظر است که این روش نیز دارای محدودیت‌هایی است. ازجمله این محدودیت‌ها، دریافت پاسخ مثبت به‌مدت 4 تا 6 روز و حتی 2 هفته و در مواردی بیش از 27 روز، به‌دلیل دوره انکوباسیون طولانی و همچنین خطر انتقال ارگانیسم به کارکنان آزمایشگاه حین کار کردن با آن است، به‌طوری که 2 درصد از کل موارد بروسلوز در آزمایشگاه ایجاد می‌شود. از مهم‌‌ترین محدودیت‌های تست‌های سرولوژیکی نیز می‌توان به مثبت بودن تیتر آنتی‌بادی پس از یک دوره طولانی درمان، منفی بودن تست‌های سرولوژیکی در ابتدای بیماری به‌دلیل ناکافی بودن تیتر آنتی‌بادی و ناکارآمدی این روش‌ها در تشخیص بیماری در موارد عود آن پس از درمان طولانی‌مدت با انواع آنتی‌بیوتیک‌ها اشاره کرد. ازاین‌رو محققان همواره به‌دنبال راهی برای تشخیص سریع و دقیق بیماری بروسلوز بوده‌اند [18].
روش PCR یکی از سریع‌ترین و دقیق‌ترین روش‌های تشخیص بروسلوز است. استفاده از این روش در دهه‌های اخیر بسیار گسترش یافته است و دارای مزایای بسیاری است. نداشتن محدودیت‌های موجود در روش کشت، تشخیص بیماری در کمتر از یک روز، حساسیت بالا، قدرت و قابلیت تکرار در زمان‌های مختلف و کم‌خطر بودن برای کارکنان از مهم‌‌ترین خصوصیات این روش است [19]. در تحقیق حاضر از مجموع 200 نمونه مشکوک به بروسلا، با روش PCR 29 نمونه با استفاده از پرایمرهای متصل‌شونده به ژن Omp31، مثبت ارزیابی شد که معادل 13 درصد نمونه‌ها بود. به‌طورکلی، نتایج حاصل از پژوهش حاضر نشان داد شناسایی باکتری با استفاده از PCR روشی بسیار دقیق و قابل اعتماد است. علاوه بر این، یکی از مهم‌‌ترین ویژگی‌های تکنیک PCR تشخیص سریع و تمایز گونه‌های مختلف است [20]. محققان بیان کردند که آزمایش‌های اسیدنوکلئیک مانند PCR فناوری‌های نسل جدید هستند که حساسیت بالاتری نسبت به کشت خون و ویژگی بهتری نسبت به آزمایش‌های سرولوژیک برای شناسایی عفونت بروسلوز دارند که با مطالعه حاضر مطابقت دارد [21]. گرشاسبی و همکاران گزارش کردند که حساسیت و ویژگی تکنیک PCR برای شناسایی بروسلوز به‌ترتیب 96 و 7/80 درصد بود که با مطالعه حاضر مطابقت دارد [21].
بررسی نتایج مطالعه حاضر نشان داد زنان بیشتر از مردان به بروسلوز مبتلا می‌شوند. این نتیجه با مطالعه زینلی مطابقت دارد [22]. هرچند در مطالعه حمزوی و همکاران نشان داده شده است که مردان بیشتر از زنان مبتلا شده‌اند [23]. همچنین امرو و همکاران بیان کردند که بروز بروسلوز در مردان 1/75 درصد و نسبت مرد به زن 3 به 1 است [24] که با مطالعه حاضر همخوانی دارد. با بررسی همه نتایج مشخص شده است که شیوع این بیماری در مردان به‌دلیل فعالیت بیشتر در دامپروری‌ها بیشتر است.
میانگین سنی افراد مبتلا به بروسلوز در پژوهش حاضر 30 تا 60 سال بود که با مطالعه محمدیان و همکاران همخوانی دارد [25]. باتوجه‌به نتایج به‌دست‌آمده، احتمال دارد علت این امر این باشد که این بیماری بیشتر در گروه سنی فعالان جامعه رخ می‌دهد. علاوه بر این نشان داده شده که این بیماری در دهه‌های دوم و سوم زندگی شیوع بیشتری دارد. این نتایج با مطالعه حوزوی و همکاران مطابقت دارد [23]. در مطالعه امرو و همکاران میزان بروز بروسلوز در گروه سنی 11 تا 20 سال 29 درصد گزارش شد که با مطالعه حاضر که در سنین بالاتر بروز بیشتری رخ داده بود مطابقت ندارد [24]. بررسی وضعیت اشتغال نشان داد اکثراً مبتلایان به بروسلوز خانه‌دار بوده‌اند. نتایج مطالعات متعددی با نتایج مطالعه حاضر همسو ست. به نظر می‌رسد شغل به‌عنوان یک عامل خطر بسیار مهم به وضعیت ارتباط فرد با دام وابسته است [26].
علاوه بر این، در مطالعه حاضر مشخص شد مصرف لبنیات غیرپاستوریزه به‌خصوص پنیر و شیر بیشترین فراوانی را در بروز بروسلوز دارد. تحقیقات بسیاری نشان داده‌اند تماس با دام و مصرف شیر و پنیر غیرپاستوریزه بیشترین فراوانی را در بین عوامل خطر داشته است. همچنین مشخص شده است در بسیاری از مناطق کنترل مؤثر بروسلوز گوسفند به‌طور قابل‌توجهی خطر ابتلا به بروسلوز انسانی را کاهش می‌دهد [27]. سادات و همکاران در مطالعه خود توصیه کردند که تشخیص بروسلوز با استفاده از تست الایزای غیرمستقیم، به‌دلیل ویژگی و حساسیت بالای این تست انجام شود [28].
علائم سیستمیک و غیراختصاصی بروسلوز و تشابه علائم بالینی آن با برخی بیماری‌های دیگر ضرورت تشخیص بالینی آن را دوچندان کرده است [16]. روش تشخیص مولکولی ارائه‌شده در مطالعه حاضر برای تشخیص این بیماری، با حساسیت و ویژگی 100 درصد برای تهیه کیت‌های آزمایشگاهی جهت استفاده در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی پیشنهاد می‌شود. مطالعات نشان می‌دهند سویه‌های بروسلا آبورتوس و بروسلا ملیتنسیس از طریق تجارت حیوانات به سراسر جهان منتقل شده‌اند و در برنامه‌های کنترل عوامل عفونی آتی مهم خواهند بود [29]. بنابراین، پیشرفت‌ها در فناوری تشخیص مولکولی نوین از طریق تکثیر نواحی اختصاصی در ژنوم، می‌تواند به تایپینگ از طریق توالی‌یابی لوکوس‌های ژنی چندگانه در ژنوم بروسلا، در مناطق اندمیک مختلف مانند ایران منجر شود [30].
نتیجه‌گیری
بروسلوز یکی از شایع‌‌ترین بیماری‌های عفونی مشترک بین انسان و دام همراه با گسترش جهانی است. این بیماری یک مشکل اساسی در بهداشت نیز به شمار می‌رود زیرا نه‌تنها به ایجاد عوارض بالینی منجر می‌شود بلکه عامل زیان‌های اقتصادی بسیار زیادی است و همواره در ایران بروز بالایی داشته است. امروزه چند آزمون سرولوژیک وجود دارد که آزمایشگاه‌های مختلف از آن‌ها برای تشخیص بروسلوز استفاده می‌کنند، اما با وجود مشکلات و محدودیت‌هایی که استفاده از این آزمون‌ها به‌همراه دارند، روش‌های دیگری همچون تشخیص مولکولی به‌عنوان روشی ساده، سریع و بسیار حساس به‌منظور تشخیص بروسلوز موردتوجه قرار گرفته است. باتوجه‌به نتایج حاصل از این تحقیق و تحقیقات مشابه دیگر، تشخیص عوامل عفونی با استفاده از آزمایش PCR در مقایسه با روش‌های سنتی می‌تواند روشی سریع و قابل اطمینان به شمار آید. حساسیت و اختصاصی بودن روش PCR در تشخیص بروسلوزیس 98 درصد است که بسیار بیشتر از سایر روش‌های تشخیصی است. مطالعه جمعیت‌شناختی بروسلوز تشخیص داده‌شده با روش PCR در بررسی حاضر از نظر گروه‌های سنی و شغلی مبتلایان و عوامل خطر مؤثر در ابتلا، با مطالعات قبلی همسو بود، اما علی‌رغم اینکه در اکثر مطالعات قبلی میزان شیوع در مردان بیشتر از زنان گزارش شده بود، در مطالعه حاضر نسبت ابتلای زنان در میان افراد موردمطالعه بیشتر از مردان بود که می‌تواند زنگ خطری برای علت‌یابی افزایش بروز بروسلوز در زنان باشد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه دارای تأییدیه از کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی، واحد فلاورجان به شماره IR.IAU.FALA.REC.1399.061است.
حامی مالی
این تحقیق هیچ کمک مالی از سازمان‌های تأمین مالی در بخش‌های عمومی، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در آماده‌سازی این مقاله مشارکت داشتند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از همکاری مدیر آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد فلاورجان تشکر و قدردانی می‌کنند.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
میکروب شناسی
دریافت: 1401/9/18 | پذیرش: 1402/1/5 | انتشار: 1402/5/10
دریافت: 1401/9/18 | پذیرش: 1402/1/5 | انتشار: 1402/5/10
فهرست منابع
1. Tulu D. Bovine brucellosis: Epidemiology, public health implications, and status of brucellosis in Ethiopia. Vet Med. 2022; 13:21-30. [DOI:10.2147/VMRR.S347337] [PMID] [PMCID] [DOI:10.2147/VMRR.S347337]
2. Kydyshov K, Usenbaev N, Sharshenbekov A, Aitkuluev N, Abdyraev M, Chegirov S, et al. Brucellosis in humans and animals in Kyrgyzstan. Microorganisms. 2022; 10(7):1293. [DOI:10.3390/microorganisms10071293] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/microorganisms10071293]
3. Golshani M, Buozari S. A review of brucellosis in Iran: Epidemiology, risk factors, diagnosis, control, and prevention. Iran Biomed J. 2017; 21(6):349-59. [DOI:10.18869/acadpub.ibj.21.6.349] [PMID] [PMCID]
4. Głowacka P, Żakowska D, Naylor K, Niemcewicz M, Bielawska-Drózd A. Brucella - virulence factors, pathogenesis and treatment. Pol J Microbiol. 2018; 67(2):151-61. [DOI:10.21307/pjm-2018-029] [PMID] [PMCID] [DOI:10.21307/pjm-2018-029]
5. Waktole H, Aden M, Ashenafi H. Seroepidemiology of camel brucellosis in and around Dire Dawa, Eastern Ethiopia. Vet Med Int. 2022; 2022:6624293. [DOI:10.1155/2022/6624293] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1155/2022/6624293]
6. Lukambagire AS, Mendes ÂJ, Bodenham RF, McGiven JA, Mkenda NA, Mathew C, et al. Performance characteristics and costs of serological tests for brucellosis in a pastoralist community of northern Tanzania. Sci Rep. 2021; 11(1):5480. [DOI:10.1038/s41598-021-82906-w] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1038/s41598-021-82906-w]
7. Ma X, Sun GQ, Wang ZH, Chu YM, Jin Z, Li BL. Transmission dynamics of brucellosis in Jilin province, China. Commun Nonlinear Sci Numer Simul. 2022; 114:106702. [DOI:10.1016/j.cnsns.2022.106702] [DOI:10.1016/j.cnsns.2022.106702]
8. Trotta A, Marinaro M, Cirilli M, Sposato A, Adone R, Beverelli M, et al. Brucella melitensis B115-based ELISA to unravel false positive serologic reactions in bovine brucellosis: A field study. BMC Vet Res. 2020; 16(1):50. [DOI:10.1186/s12917-020-02278-7] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/s12917-020-02278-7]
9. Cassataro J, Pasquevich K, Bruno L, Wallach JC, Fossati CA, Baldi PC. Antibody reactivity to Omp31 from Brucella melitensis in human and animal infections by smooth and rough Brucellae. Clin Diagn Lab Immunol. 2004; 11(1):111-4. [DOI:10.1128/CDLI.11.1.111-114.2004] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1128/CDLI.11.1.111-114.2004]
10. Bulashev AK, Ingirbay BK, Mukantayev KN, Syzdykova AS. Evaluation of chimeric proteins for serological diagnosis of brucellosis in cattle. Vet World. 2021; 14(8):2187-96.[DOI:10.14202/vetworld.2021.2187-2196] [PMID] [PMCID] [DOI:10.14202/vetworld.2021.2187-2196]
11. Erfanian M, Seyyed Nouzadi SM, Jarahi L. Evaluation of diagnostic sensitivity of wright, coombs wright and 2-Mercapto Ethanol in diagnosis of brucellosis. Evidence Based Care. 2013; 2(4):69-74. [DOI:10.22038/ebcj.2013.488]
12. Haghdoost M, Ansari L, Owaysee Osquee H. Brucellacapt test, wright and coombs wright in diagnosis of brucellosis. J Res Clin Med. 2021; 9(15):1-5. [DOI:10.34172/jrcm.2021.0015] [DOI:10.34172/jrcm.2021.0015]
13. Borsa BA, Aldag ME, Yilmaz M, Dalar ZG, Ozalp VC. Comparison of a novel test (ODAK brucella coombs gel test) with commonly used serological tests in human brucellosis. Clin Lab. 2016; 62(9):1671-4. [DOI:10.7754/Clin.Lab.2016.160120] [PMID] [DOI:10.7754/Clin.Lab.2016.160120]
14. Wang Y, Wang Z, Zhang Y, Bai L, Zhao Y, Liu C, et al. Polymerase chain reaction-based assays for the diagnosis of human brucellosis. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2014; 13:31. [DOI:10.1186/s12941-014-0031-7] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/s12941-014-0031-7]
15. Moulana Z, Roushan MR, Marashi SM. Evaluation of different primers for detection of brucella by using PCR method. Electron Physician. 2016; 8(11):3222-7. [DOI:10.19082/3222] [PMID] [PMCID] [DOI:10.19082/3222]
16. Delam H, Keshtkaran Z, Rezaei B, Soufi O, Bazrafshan MR. Changing patterns in epidemiology of brucellosis in the south of Iran (2015-2020): Based on cochrane-armitage trend test. Ann Glob Health. 2022; 88(1):11. [DOI:10.5334/aogh.3474] [PMID] [PMCID] [DOI:10.5334/aogh.3474]
17. Adabi M, Karami M, Keramat F, Alikhani MY, Bakhtiari S. Serological and molecular investigation of human brucellosis in participants of Famenin brucellosis cohort study, Hamadan, Iran. Iran J Microbiol. 2021; 13(3):319-24. [DOI:10.18502/ijm.v13i3.6394] [PMID] [PMCID] [DOI:10.18502/ijm.v13i3.6394]
18. Di Bonaventura G, Angeletti S, Ianni A, Petitti T, Gherardi G. Microbiological laboratory diagnosis of human brucellosis: An overview. Pathogens. 2021; 10(12):1623. [DOI:10.3390/pathogens10121623] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/pathogens10121623]
19. Al Dahouk S, Nöckler K. Implications of laboratory diagnosis on brucellosis therapy. Expert Rev Anti Infect Ther. 2011; 9(7):833-45. [DOI:10.1586/eri.11.55] [PMID] [DOI:10.1586/eri.11.55]
20. Dadar M, Alamian S, Behrozikhah AM, Yazdani F, Kalantari A, Etemadi A, et al. Molecular identification of brucella species and biovars associated with animal and human infection in Iran. Vet Res Forum. 2019; 10(4): 315-21. [DOI:10.30466/vrf.2018.89680.2171] [PMID] [PMCID]
21. Garshasbi M, Ramazani A, Sorouri R, Javani S, Moradi S. Molecular detection of Brucella species in patients suspicious of Brucellosis from Zanjan, Iran. Braz J Microbiol. 2014; 45(2):533-8. [DOI:10.1590/S1517-83822014005000048] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1590/S1517-83822014005000048]
22. Zeinali A. [A review on the serological and allergical diagnostic methods of brucellosis (Persian)]. Vet Res Bio Pro. 1994; 7(1):145-7. [Link]
23. Hamzavi Y, Khademi N, Ghazi Zadeh MM, Janbakhsh A. [Epidemiology of malt fever in Kermanshah province in 2011 (Persian)]. J Kermanshah Uni Med Sci. 2014; 18(2):e74170. [DOI:10.22110/jkums.v18i2.1604]
24. Amro A, Mansoor B, Hamarsheh O, Hjaija D. Recent trends in human brucellosis in the West Bank, Palestine. Int J Infect Dis. 2021; 106:308-313. [DOI:10.1016/j.ijid.2021.04.037] [PMID] [DOI:10.1016/j.ijid.2021.04.037]
25. Mohammadian M, Salehiniya H, Kazaei S, Ramazanpour J, Mohammadian-Hafshejani A. [Epidemiological characteristics and incidence rate of brucellosis in Isfahan Province, Iran, 2012 (Persian)]. J Isfahan Med Sch. 2015; 33(355):1784-95. [Link]
26. Soodejani Taheri M, Lotfi M, Ghaderi A, Reisi A, Mohannadzadeh M. [Epidemiology of brucellosis in Shahr-e- Kord during the years 2010 to 2014 (Persian)]. Pars J Med Sci. 2016; 14(1):1-7. [DOI:10.29252/jmj.14.1.1] [DOI:10.29252/jmj.14.1.1]
27. Lai S, Chen Q, Li Z. Human brucellosis: An ongoing global health challenge. China CDC Wkly. 2021; 3(6):120-3.[DOI:10.46234/ccdcw2021.031] [PMID] [PMCID]
28. Saadat S, Mardaneh J, Ahouran M, Mohammadzadeh A, Ardebili A, Yousefi M, et al. Diagnosis of cattle brucellosis by PCR and serological methods: Comparison of diagnostic tests. Biomed Pharmacol J. 2017; 10(2):881-8. [DOI:10.13005/bpj/1181] [DOI:10.13005/bpj/1181]
29. Allen AR, Milne G, Drees K, Presho E, Graham J, McAdam P, et al. Genomic epizootiology of a Brucella abortus outbreak in Northern Ireland (1997-2012). Infect Genet Evol. 2020; 81:104235. [DOI:10.1016/j.meegid.2020.104235] [PMID] [DOI:10.1016/j.meegid.2020.104235]
30. O'Callaghan D. Human brucellosis: Recent advances and future challenges. Infect Dis Poverty. 2020; 9(1):101.[DOI:10.1186/s40249-020-00715-1] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/s40249-020-00715-1]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
