جلد 17 -
جلد 17 - صفحات 471-462 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Rezaei S, Khoshsokhan-Mozaffar M, Kalhor N. Comparative Study of PRMT1 and MAPK14 Genes Expression in Healthy and Oligospermic Individuals. Qom Univ Med Sci J 2023; 17 : 2823.1
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3668-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3668-fa.html
رضایی سمیه، خوش‌سخن مظفر مریم، کلهر ناصر. بررسی مقایسه‌ای میزان بیان ژن‌های PRMT1 و MAPK14 در افراد سالم و الیگواسپرمی. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1402; 17 () :462-471
سمیه رضایی1 
، مریم خوش‌سخن مظفر* 2، ناصر کلهر1
، مریم خوش‌سخن مظفر* 2، ناصر کلهر1
1- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران ،m.khoshm@gmail.com
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران ،
متن کامل [PDF 3418 kb]
(181 دریافت)
| چکیده (HTML) (377 مشاهده)
متن کامل: (183 مشاهده)
مقدمه
با اینکه بسیاری از علل ناباروری مردان ناشناخته است، به نظر می‌رسد اختلالات ژنتیکی نقش مهمی در ناباروری مردان به‌ویژه در موارد الیگواسپرمی ایفا کند [1، 2]. PRMT1 و MAPK14 2 نمونه از ژن‌هایی هستند که احتمالاً در اختلالات اسپرم نقش دارند. پروتئینی که توسط ژن MAPK14 کد می‌شود به گروه پروتئین‌های MAP کینازها تعلق دارد. این کیناز با فعالیت‌های میتوژنیک و استرس‌های محیطی فعال می‌شود و سری واکنش‌های آبشاری وابسته به MAP کیناز را فعال میکند و سبب فسفریلاسیون و درنتیجه فعالسازی MAP3K7IP1/TAB1 می‌شود [3]. برخی فرایندهای سلولی همچون تکثیر و تمایز، کنترل رشد، آپوپتوزیس و پیری، همچنین ایجاد مقاومت در مقابل شیمی‌درمانی و رادیوتراپی توسط مسیرهای سیگنالینگ پروتئین‌کینازهای فعال‌کننده میتوژن (MAPKs) و با هدایت پیام داخل‌سلولی کنترل می‌شوند [4].
ژن PRMT1 عضوی از خانواده آرژنین N-متیل‌ترانسفرازها را رمزگذاری میکند و نقش تنظیمی مهمی در بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی ایفا میکند. PRMTها با انتقال گروه‌های متیل از S-Adenosyle-L-Methionine به اتم‌های نیتروژن گوانیدین، بقایای آرژنین را متیله می‌کنند. افزایش بیان این ژن ممکن است در بسیاری از انواع سرطان‌ها نقش داشته باشد [5].
نقص‌های ژنتیکی و اختلالات مولکولی در مسیرهای تکاملی فرایند اسپرماتوژنز می‌تواند به الیگواسپرمی منجر شود. یکی از مسیرهای مهمی که در روند اسپرم‌سازی دخیل است FOXO pathway است [6]. FOXO به‌عنوان یک فاکتور حیاتی اثرگذار بر مسیر PI3K/AKT در سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی است. مسیر PI3Kinase/AKT در کنترل هم‌زمان متابولیسم و نیز رشد و تکثیر سلولی در سلول‌های سالم و بدخیم دخالت دارد. در بسیاری از انواع سرطان‌ها اجزای این مسیر دچار افزایش میزان یا عملکرد شده‌اند و این امر یکی از مهم‌ترین دلایل افزایش بقا و کاهش مرگ سلول‌های سرطانی است [7].
فعال شدن برخی از گیرنده‌های سطح سلول ازجمله گیرنده‌های تیروزین‌کینازی یا گیرنده‌های متصل به -Gپروتئین‌ها در اثر اتصال لیگاندهایی نظیر فاکتورهای رشد و انسولین، منجر به فسفریلاسیون و فعالسازی آنزیم PI3-K و متعاقباً فسفریلاسیون و فعالسازی AKT به‌عنوان یک کیناز مرکزی در این مسیر می‌شود. AKT فعال به فسفریلاسیون برخی ترکیبات موجود در مسیرهای تنظیمی تکثیر، تمایز و بقای سلولی ازقبیل پروتئین‌های آپوپتوتیک و فاکتورهای رونویسی منجر می‌شود که نهایتاً به مهار آپوپتوز و افزایش تکثیر، رشد و بقای سلولی منجر می‌شود [7]. طبق مطالعه‌ای که در سال 2002 صورت گرفت بیان ژن‌های FKHR ،FKHRL1 و AFX در جوندگان نشان داد تنظیم این ژن‌ها به‌واسطه مسیر IGF-1 است و بیان ژن‌های اعضای خانواده FOXO در سلول‌های گرانولوزا موجب تکثیر و تأثیر بر عملکرد این سلول‌ها می‌شوند [8].
شی و همکاران در سال 2003 اثبات کردند که سطوح پروتئینی FOXO1 با تکوین، آتریزیا و لوتئینیزاسیون فولیکولی در رحم موش صحرایی مرتبط است [9]. مطالعه‌ای که در سال 2004 پارک و همکاران انجام دادند به نقش FOXO1 در مهار القای سیکلین D2 و تکثیر و تمایز سلول‌های گرانولوزا اشاره میکند که طبق نتیجه این مطالعه، با حذف مهار وابسته به FOXO1و اثر مثبت آن بر سیگنالینگ SMAD2/3، تکثیر و تمایز بالاتری با استفاده از FSH مشاهده می‌شود [10]. در سال 2013 اسکارا و همکاران به این نتیجه دست پیدا کردند که بیان FOXO1 در اسپرماتوگونی و گرانولوزا در پستانداران به‌صورت حفاظت‌شده است و همچنین با حفظ اووسیت نیز در ارتباط است [11]. همچنین در بررسی نقش FOXO1و ناباروری در موش‌های نر، نتایج نشان دادند با مهار بیان FOXO1میزان بیان ژن CEP55 که ناباروری در موش‌ها را موجب می‌شود، نیز مهار می‌شود [12]. PRMT1 نیز به‌واسطه ویژگی متیل‌ترانسفرازی که دارد با متیله کردن FOXO آن را مهار میکند [13]. باتوجه‌به دلایل عنوان‌شده در سطور قبل، هدف از این تحقیق، بررسی ارتباط بیان ژن‌های PRMT1 و MAPK14 با ناباروری در مردان مبتلا به الیگواسپرمی است.
مواد و روش‌ها
این مطالعه بر روی 200 مرد (100 مرد مبتلا به الیگواسپرم و 100 مرد سالم به‌عنوان گروه کنترل) مراجعه‌کننده به مرکز درمان ناباروری جهاد دانشگاهی قم در فاصله زمانی 1/2/1399 الی 18/9/1399، انجام شد. پس از تشخیص الیگواسپرمی توسط متخصص مردان، اطلاعات جمعیت‌شناختی جمع‌آوری شدند. بررسی پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک و مورفولوژی) با استفاده از میکروسکوپ نوری و براساس استاندارد جهانی (1999) صورت گرفت. شمارش اسپرم‌ها برحسب میلیون بر لیتر توسط لام نئوبار انجام شد. بررسی میزان تحرک اسپرم‌ها نیز براساس همین استاندارد جهانی سال 1999 سازمان جهانی بهداشت [14] اندازه‌گیری شد. درصد تحرک کل اسپرمی باید کمتر از 40 درصد و حرکت پیش‌رونده کمتر از 32 درصد باشد. برای بررسی مورفولوژی نرمال اسپرم‌ها از روش رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو استفاده شد. پس از رنگ‌آمیزی، 200 اسپرم توسط میکروسکوپ نوری با بزرگ‌نمایی 100 برابر بررسی شدند.
RNA نمونه‌ها با استفاده از Trizol و براساس دستورالعمل سازنده، استخراج شد. غلظت RNA استخراج‌شده با استفاده از دستگاه نانودراپ خوانده شد و نسبت جذب 260 به 280 محاسبه و کیفیت‌سنجی RNA روی ژل آگارز انجام شد. به منظور صحت استخراج، روی ژل آگارز 1 درصد برده شد و با مشاهده باند شارپ 28rRNA و 18rRNA و اطمینان از استخراج و عدم آلودگی به DNA ژنومی، RNA استخراج‌شده تا زمان اقدامات بعدی در دمای منهای70 درجه ذخیره شد. بعد از انجام استخراج با 2 میکرولیتر RNA و استفاده از کیت شرکت پارس طوس، طبق دستورالعمل شرکت سازنده، cDNA سنتز شد (جدول شماره 1). پرایمر و آنزیم مورداستفاده به‌ترتیب رندوم هگزامر و AMV Reverse transcriptase بود.
Real Time - PCR
در ابتدا میزان غلظت بهینه cDNA و همچنین پرایمرهای مربوط به هر ژن با استفاده از آمایش سریال غلظت برای هرکدام به‌طور جداگانه تعیین شد. به‌طوری‌که کمترین میزان دایمر در محصول PCR مشاهده شود. Real Time–PCR با استفاده از غلظت مناسب از cDNA انجام شد. توالی پرایمرهای مورداستفاده در مطالعه همراه با طول قطعه تکثیرشده هر دو ژن، در جدول شماره 1 ارائه شده است. برنامه Real Time–PCR شامل 95 درجه به مدت 10 دقیقه، 93 درجه به مدت 20 ثانیه، 57 درجه به مدت 35 ثانیه برای ژن PRMT1 و 58 درجه به مدت 40 ثانیه برای ژن MAPK14 (تکرار 40 سیکل) و 20 ثانیه در 72 درجه بود. از GAPDH به‌عنوان ژن مرجع استفاده شد. جهت کمی‌سازی بیان نسبی ژن‌های موردنظر از روش CTΔΔ -2 استفاده شد. جهت اطمینان از تکثیر تخصصی ژن از melting curve استفاده شد.
محاسبه میزان بیان ژن
پس از اتمام تست و به دست آوردن CTهای ژن رفرنس و ژن موردنظر، از روش Fold Change برای محاسبه میزان بیان ژن استفاده شد (فرمول شماره 1).
1.
تحلیل آماری داده‌ها
داده‌های حاصل از این مطالعه ازنظر آماری و با استفاده از نرم‌افزار PRISM نسخه 8 و آزمون آماری تی مستقل، با سطح معناداری P<0/05 تجزیه‌وتحلیل شدند.
یافته‌ها
مقایسه پارامترهای جمعیت‌شناختی بیماران و افراد سالم
جدول شماره 2 میانگین پارامترهای مختلف بین 2 گروه الیگواسپرم و سالم را نشان می‌دهد. میانگین سن افراد سالم و افراد الیگواسپرم و آزمون آماری تی مستقل مشخص کرد که اختلاف میانگین مشاهده‌شده معنادار نیست (8/(P=0. حجم نمونه مایع منی (039/(P=0 و غلظت اسپرم (04/(P=0 در گروه نابارور کاهش معناداری داشت. همچنین میزان تحرک کل اسپرم‌ها (027/(P=0، تحرک پیش‌رونده اسپرمی (03/(P=0 و مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم (045/(P=0 در بیماران مبتلا به الیگواسپرمی پایین‌تر از افراد بارور بود.
بررسی بیان ژن‌های PRMT1 و MAPK14
نتایج حاصل از استخراج RNA از اسپرم ازنظر آلودگی و وجود باندهای rRNA بررسی شد (تصویر شماره 1).
میزان بیان ژن PRMT1 در افراد الیگواسپرم به‌طور میانگین 4/2±98/3 و میزان بیان این ژن در افراد سالم نیز 78/0±03/1 بود. این اعداد افزایش بیان ژن مزبور را در افراد بیمار نشان می‌دهد (0001/0(P= (تصویر شماره 2). میزان بیان ژن MAPK14 در افراد الیگواسپرم 06/0±78/0 و در افراد سالم 56/0±96/0 بود. نتایج نشان داد میزان بیان این ژن در افراد بیمار نسبت به سالم معنادار نیست (23/(P=0 (تصویر شماره 3).
بحث
مطالعه حاضر با هدف مقایسه بیان ژن‌های PRMT1 وMAPK14 با ناباروری مردان الیگواسپرم در مردان مراجعه‌کننده به مرکز ناباروری جهاد دانشگاهی قم انجام شد. مهم‌ترین یافته مطالعه حاضر این بود که بیان ژن PRMT1 در افراد الیگواسپرم نسبت به افراد سالم و بارور افزایش چشمگیری می‌یابد، اما بیان ژن MAPK14 در افراد الیگواسپرم نسبت به افراد سالم، تغییر معناداری نداشت.
این نتیجه مؤید این مطلب است که نقش ژنتیک در ناباروری مردان بسیار حائز اهمیت است، به‌طوری‌که تخمین زده می‌شود عوامل ژنتیکی باعث ایجاد 15 تا 30 درصد از ناباروری‌های مردان است [15] یا به نوعی دیگر ناباروری‌های ایدیوپاتیک در مردان بدون سابقه پزشکی بیشتر به دلیل تأثیر ژن‌ها مخصوصاً در مسیر اسپرماتوژنز است که به‌عنوان یکی از عوامل احتمالی ایجاد الیگواسپرمی مردان مطرح است. طی سال‌های اخیر بررسی ژن‌های مؤثر در فرایند ناباروری مردان، به دلیل نقش مهم آن‌ها در برنامه‌ریزی درمانی و امکان بررسی مشکلات ژنتیکی در فرزندان از‌طریق روش‌هایی همچون تشخیص‌های ژنتیکی قبل از لانه‌گزینی مورد توجه قرار گرفته‌اند [16].
ژن MAPK14 روی کروموزوم 6 p21/31 و 22 اگزون دارد. اندازه آن 95254 جفت باز است و از روی آن 13 نوع RNA ساخته می‌شود. MAPK14 یکی از ژن‌هایی است که در مسیر سیگنالینگ MAP Signaling Pathway دخالت میکند [3]. غیر از برخی فرایندهای سلولی این ژن در ایجاد مقاومت در مقابل شیمی‌درمانی و رادیوتراپی توسط مسیرهای سیگنالینگ پروتیین کینازهای فعال‌کننده میتوژن (MAPKs) نقش دارد. خانواده MAPK شامل پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن 14، کیناز تنظیم شده خارج سلولی، پروتئین کینازهای فعال شونده با استرس هستند که دارای فعالیت کینازی بوده و از‌طریق فسفریلاسیون پروتئین‌های مختلف در هدایت پیام نقش دارند. بنابراین گونه‌های فعال اکسیژن با اثر بر روی MAPKs می‌توانند در وقایع مختلف سلولی نقش داشته باشند [5]. با اینکه میزان بیان این ژن در مردان نابارور الیگواسپرم افزایش یافت، منتها این افزایش معنادار نبود و به نظر می‌رسد الیگواسپرمی تحت تأثیر مستقیم این ژن ایجاد نشود. مطالعاتی از این دست عدم ارتباط برخی ژن‌ها را با ناباروری مردان نشان داده‌اند؛ به‌طوری‌که یوسف دانشمندپور نیز در سال 1398 نشان داد بیان ژن‌های CX3CR1 و UBE2B نسبت به افراد گروه کنترل تغییر معناداری نداشته است [17].
ژن PRMT1 کدکننده خانواده پروتئین آرژنین N-متیل‌ترانسفرازهاست و همچنین در تغییرات پس از ترجمه نقش تنظیمی مهمی را در بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی ایفا میکند. گزارش شده است افزایش بیان این ژن ممکن است در بسیاری از انواع سرطان‌ها نقش داشته باشد [4]. همچنین این ژن در فرایند یوبیکوئیتیناسیون دخالت میکند. یوبیکوئیتین یک پپتید نشان‌گذار پروتئولیتیک سلولی است که در کنترل عملکردهای پیچیده سلول‌های انسانی و حیوانی نقش دارد. اصلی‌ترین عملکرد آن نشان‌دار کردن پروتئین‌ها برای تجزیه توسط سیستم پروتئوزومی است. این ژن پایداری، عملکرد و محل قرارگیری پروتئین‌های داخل‌سلولی را هم کنترل میکند [18].
با اضافه شدن یک یوبیکوئیتین به سوبسترا، مولکول‌های یوبیکوئیتین بیشتری می‌توانند به اولی اضافه شوند و یک زنجیره پلی‌یوبیکوئیتین ایجاد می‌کنند. در حالت معمول حدود 4 مولکول یوبیکوئیتین به سوبسترا اضافه می‌شود و در این حالت پروتئین برای تجزیه شدن به سمت کمپلکس پروتئوزوم می‌رود. پروتئوزوم که از چندین زیرواحد تشکیل شده است وظیفه تجزیه پروتئین‌های نشان‌دارشده به‌وسیله یوبیکوئیتین را انجام می‌دهد [19]. یوبیکوئیتین در پلاسمای مایع منی انسان و همچنین در اسپرماتوزوآهای آسیب‌دیده وجود دارد که در طی گذر اپیدیدیمی توسط سلول‌های اپیتلیال اپیدیدیم ترشح می‌شود [20]. آسیب در ساختار DNA و یا ساختارهای دیگر در بیضه ممکن است به راه افتادن مسیرهای آپوپتوز منجر شوند و این اسپرم‌ها ممکن است یوبیکوئیتینه شوند. علاوه‌بر آپوپتوز، پیچش نامناسب آنتی‌ژن‌های سطحی اسپرم و یا از بین رفتن ساختار آن‌ها می‌تواند باعث یوبیکوئیناسیون اسپرم‌های آسیب‌دیده شود [21].
نتیجه‌گیری
باتوجه‌به نقش PRMT1 و اینکه در مطالعه حاضر بیان این ژن افزایش پیدا کرده است می‌توان گفت با افزایش بیان این ژن اسپرم‌های زیادی از بین می‌روند و درنتیجه تعداد اسپرم‌ها در افراد الیگواسپرم کاهش پیدا میکند. همچنین بیان این ژن بر تحرک کل اسپرم‌ها و تحرک پیش‌رونده اسپرمی اثر منفی داشته و باعث غیرطبیعی شدن شکل اسپرم در بیماران مبتلا به الیگواسپرمی شده است.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه پس از تصویب در کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم با کد IR.IAU.QOM.REC.1399.026 و اخذ رضایت‌نامه کتبی از شرکت‌کنندگان انجام شده است.
حامی مالی
مطالعه حاضر از پایان‌نامه کارشناسی ارشد سمیه رضایی در دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم استخراج شده و تحت حمایت معاونت پژوهش دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم انجام شده است.
مشارکت نویسندگان
انجام آزمایش‌ها، کمک در نگارش پیش‌نویس اولیه: سمیه رضایی؛ تجزیه‌وتحلیل داده‌ها: ناصر کلهر؛ طراحی مطالعه، نظارت و نگارش مقاله: مریم خوش‌سخن مظفر؛ خوانش و تأیید نهایی: همه نویسندگان.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
از معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم و همچنین مرکز ناباروری و مرکز تحقیقات جهاد دانشگاهی استان قم قدردانی می‌شود.
با اینکه بسیاری از علل ناباروری مردان ناشناخته است، به نظر می‌رسد اختلالات ژنتیکی نقش مهمی در ناباروری مردان به‌ویژه در موارد الیگواسپرمی ایفا کند [1، 2]. PRMT1 و MAPK14 2 نمونه از ژن‌هایی هستند که احتمالاً در اختلالات اسپرم نقش دارند. پروتئینی که توسط ژن MAPK14 کد می‌شود به گروه پروتئین‌های MAP کینازها تعلق دارد. این کیناز با فعالیت‌های میتوژنیک و استرس‌های محیطی فعال می‌شود و سری واکنش‌های آبشاری وابسته به MAP کیناز را فعال میکند و سبب فسفریلاسیون و درنتیجه فعالسازی MAP3K7IP1/TAB1 می‌شود [3]. برخی فرایندهای سلولی همچون تکثیر و تمایز، کنترل رشد، آپوپتوزیس و پیری، همچنین ایجاد مقاومت در مقابل شیمی‌درمانی و رادیوتراپی توسط مسیرهای سیگنالینگ پروتئین‌کینازهای فعال‌کننده میتوژن (MAPKs) و با هدایت پیام داخل‌سلولی کنترل می‌شوند [4].
ژن PRMT1 عضوی از خانواده آرژنین N-متیل‌ترانسفرازها را رمزگذاری میکند و نقش تنظیمی مهمی در بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی ایفا میکند. PRMTها با انتقال گروه‌های متیل از S-Adenosyle-L-Methionine به اتم‌های نیتروژن گوانیدین، بقایای آرژنین را متیله می‌کنند. افزایش بیان این ژن ممکن است در بسیاری از انواع سرطان‌ها نقش داشته باشد [5].
نقص‌های ژنتیکی و اختلالات مولکولی در مسیرهای تکاملی فرایند اسپرماتوژنز می‌تواند به الیگواسپرمی منجر شود. یکی از مسیرهای مهمی که در روند اسپرم‌سازی دخیل است FOXO pathway است [6]. FOXO به‌عنوان یک فاکتور حیاتی اثرگذار بر مسیر PI3K/AKT در سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی است. مسیر PI3Kinase/AKT در کنترل هم‌زمان متابولیسم و نیز رشد و تکثیر سلولی در سلول‌های سالم و بدخیم دخالت دارد. در بسیاری از انواع سرطان‌ها اجزای این مسیر دچار افزایش میزان یا عملکرد شده‌اند و این امر یکی از مهم‌ترین دلایل افزایش بقا و کاهش مرگ سلول‌های سرطانی است [7].
فعال شدن برخی از گیرنده‌های سطح سلول ازجمله گیرنده‌های تیروزین‌کینازی یا گیرنده‌های متصل به -Gپروتئین‌ها در اثر اتصال لیگاندهایی نظیر فاکتورهای رشد و انسولین، منجر به فسفریلاسیون و فعالسازی آنزیم PI3-K و متعاقباً فسفریلاسیون و فعالسازی AKT به‌عنوان یک کیناز مرکزی در این مسیر می‌شود. AKT فعال به فسفریلاسیون برخی ترکیبات موجود در مسیرهای تنظیمی تکثیر، تمایز و بقای سلولی ازقبیل پروتئین‌های آپوپتوتیک و فاکتورهای رونویسی منجر می‌شود که نهایتاً به مهار آپوپتوز و افزایش تکثیر، رشد و بقای سلولی منجر می‌شود [7]. طبق مطالعه‌ای که در سال 2002 صورت گرفت بیان ژن‌های FKHR ،FKHRL1 و AFX در جوندگان نشان داد تنظیم این ژن‌ها به‌واسطه مسیر IGF-1 است و بیان ژن‌های اعضای خانواده FOXO در سلول‌های گرانولوزا موجب تکثیر و تأثیر بر عملکرد این سلول‌ها می‌شوند [8].
شی و همکاران در سال 2003 اثبات کردند که سطوح پروتئینی FOXO1 با تکوین، آتریزیا و لوتئینیزاسیون فولیکولی در رحم موش صحرایی مرتبط است [9]. مطالعه‌ای که در سال 2004 پارک و همکاران انجام دادند به نقش FOXO1 در مهار القای سیکلین D2 و تکثیر و تمایز سلول‌های گرانولوزا اشاره میکند که طبق نتیجه این مطالعه، با حذف مهار وابسته به FOXO1و اثر مثبت آن بر سیگنالینگ SMAD2/3، تکثیر و تمایز بالاتری با استفاده از FSH مشاهده می‌شود [10]. در سال 2013 اسکارا و همکاران به این نتیجه دست پیدا کردند که بیان FOXO1 در اسپرماتوگونی و گرانولوزا در پستانداران به‌صورت حفاظت‌شده است و همچنین با حفظ اووسیت نیز در ارتباط است [11]. همچنین در بررسی نقش FOXO1و ناباروری در موش‌های نر، نتایج نشان دادند با مهار بیان FOXO1میزان بیان ژن CEP55 که ناباروری در موش‌ها را موجب می‌شود، نیز مهار می‌شود [12]. PRMT1 نیز به‌واسطه ویژگی متیل‌ترانسفرازی که دارد با متیله کردن FOXO آن را مهار میکند [13]. باتوجه‌به دلایل عنوان‌شده در سطور قبل، هدف از این تحقیق، بررسی ارتباط بیان ژن‌های PRMT1 و MAPK14 با ناباروری در مردان مبتلا به الیگواسپرمی است.
مواد و روش‌ها
این مطالعه بر روی 200 مرد (100 مرد مبتلا به الیگواسپرم و 100 مرد سالم به‌عنوان گروه کنترل) مراجعه‌کننده به مرکز درمان ناباروری جهاد دانشگاهی قم در فاصله زمانی 1/2/1399 الی 18/9/1399، انجام شد. پس از تشخیص الیگواسپرمی توسط متخصص مردان، اطلاعات جمعیت‌شناختی جمع‌آوری شدند. بررسی پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک و مورفولوژی) با استفاده از میکروسکوپ نوری و براساس استاندارد جهانی (1999) صورت گرفت. شمارش اسپرم‌ها برحسب میلیون بر لیتر توسط لام نئوبار انجام شد. بررسی میزان تحرک اسپرم‌ها نیز براساس همین استاندارد جهانی سال 1999 سازمان جهانی بهداشت [14] اندازه‌گیری شد. درصد تحرک کل اسپرمی باید کمتر از 40 درصد و حرکت پیش‌رونده کمتر از 32 درصد باشد. برای بررسی مورفولوژی نرمال اسپرم‌ها از روش رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو استفاده شد. پس از رنگ‌آمیزی، 200 اسپرم توسط میکروسکوپ نوری با بزرگ‌نمایی 100 برابر بررسی شدند.
RNA نمونه‌ها با استفاده از Trizol و براساس دستورالعمل سازنده، استخراج شد. غلظت RNA استخراج‌شده با استفاده از دستگاه نانودراپ خوانده شد و نسبت جذب 260 به 280 محاسبه و کیفیت‌سنجی RNA روی ژل آگارز انجام شد. به منظور صحت استخراج، روی ژل آگارز 1 درصد برده شد و با مشاهده باند شارپ 28rRNA و 18rRNA و اطمینان از استخراج و عدم آلودگی به DNA ژنومی، RNA استخراج‌شده تا زمان اقدامات بعدی در دمای منهای70 درجه ذخیره شد. بعد از انجام استخراج با 2 میکرولیتر RNA و استفاده از کیت شرکت پارس طوس، طبق دستورالعمل شرکت سازنده، cDNA سنتز شد (جدول شماره 1). پرایمر و آنزیم مورداستفاده به‌ترتیب رندوم هگزامر و AMV Reverse transcriptase بود.
Real Time - PCR
در ابتدا میزان غلظت بهینه cDNA و همچنین پرایمرهای مربوط به هر ژن با استفاده از آمایش سریال غلظت برای هرکدام به‌طور جداگانه تعیین شد. به‌طوری‌که کمترین میزان دایمر در محصول PCR مشاهده شود. Real Time–PCR با استفاده از غلظت مناسب از cDNA انجام شد. توالی پرایمرهای مورداستفاده در مطالعه همراه با طول قطعه تکثیرشده هر دو ژن، در جدول شماره 1 ارائه شده است. برنامه Real Time–PCR شامل 95 درجه به مدت 10 دقیقه، 93 درجه به مدت 20 ثانیه، 57 درجه به مدت 35 ثانیه برای ژن PRMT1 و 58 درجه به مدت 40 ثانیه برای ژن MAPK14 (تکرار 40 سیکل) و 20 ثانیه در 72 درجه بود. از GAPDH به‌عنوان ژن مرجع استفاده شد. جهت کمی‌سازی بیان نسبی ژن‌های موردنظر از روش CTΔΔ -2 استفاده شد. جهت اطمینان از تکثیر تخصصی ژن از melting curve استفاده شد.
محاسبه میزان بیان ژن
پس از اتمام تست و به دست آوردن CTهای ژن رفرنس و ژن موردنظر، از روش Fold Change برای محاسبه میزان بیان ژن استفاده شد (فرمول شماره 1).
1.
تحلیل آماری داده‌ها
داده‌های حاصل از این مطالعه ازنظر آماری و با استفاده از نرم‌افزار PRISM نسخه 8 و آزمون آماری تی مستقل، با سطح معناداری P<0/05 تجزیه‌وتحلیل شدند.
یافته‌ها
مقایسه پارامترهای جمعیت‌شناختی بیماران و افراد سالم
جدول شماره 2 میانگین پارامترهای مختلف بین 2 گروه الیگواسپرم و سالم را نشان می‌دهد. میانگین سن افراد سالم و افراد الیگواسپرم و آزمون آماری تی مستقل مشخص کرد که اختلاف میانگین مشاهده‌شده معنادار نیست (8/(P=0. حجم نمونه مایع منی (039/(P=0 و غلظت اسپرم (04/(P=0 در گروه نابارور کاهش معناداری داشت. همچنین میزان تحرک کل اسپرم‌ها (027/(P=0، تحرک پیش‌رونده اسپرمی (03/(P=0 و مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم (045/(P=0 در بیماران مبتلا به الیگواسپرمی پایین‌تر از افراد بارور بود.
بررسی بیان ژن‌های PRMT1 و MAPK14
نتایج حاصل از استخراج RNA از اسپرم ازنظر آلودگی و وجود باندهای rRNA بررسی شد (تصویر شماره 1).
میزان بیان ژن PRMT1 در افراد الیگواسپرم به‌طور میانگین 4/2±98/3 و میزان بیان این ژن در افراد سالم نیز 78/0±03/1 بود. این اعداد افزایش بیان ژن مزبور را در افراد بیمار نشان می‌دهد (0001/0(P= (تصویر شماره 2). میزان بیان ژن MAPK14 در افراد الیگواسپرم 06/0±78/0 و در افراد سالم 56/0±96/0 بود. نتایج نشان داد میزان بیان این ژن در افراد بیمار نسبت به سالم معنادار نیست (23/(P=0 (تصویر شماره 3).
بحث
مطالعه حاضر با هدف مقایسه بیان ژن‌های PRMT1 وMAPK14 با ناباروری مردان الیگواسپرم در مردان مراجعه‌کننده به مرکز ناباروری جهاد دانشگاهی قم انجام شد. مهم‌ترین یافته مطالعه حاضر این بود که بیان ژن PRMT1 در افراد الیگواسپرم نسبت به افراد سالم و بارور افزایش چشمگیری می‌یابد، اما بیان ژن MAPK14 در افراد الیگواسپرم نسبت به افراد سالم، تغییر معناداری نداشت.
این نتیجه مؤید این مطلب است که نقش ژنتیک در ناباروری مردان بسیار حائز اهمیت است، به‌طوری‌که تخمین زده می‌شود عوامل ژنتیکی باعث ایجاد 15 تا 30 درصد از ناباروری‌های مردان است [15] یا به نوعی دیگر ناباروری‌های ایدیوپاتیک در مردان بدون سابقه پزشکی بیشتر به دلیل تأثیر ژن‌ها مخصوصاً در مسیر اسپرماتوژنز است که به‌عنوان یکی از عوامل احتمالی ایجاد الیگواسپرمی مردان مطرح است. طی سال‌های اخیر بررسی ژن‌های مؤثر در فرایند ناباروری مردان، به دلیل نقش مهم آن‌ها در برنامه‌ریزی درمانی و امکان بررسی مشکلات ژنتیکی در فرزندان از‌طریق روش‌هایی همچون تشخیص‌های ژنتیکی قبل از لانه‌گزینی مورد توجه قرار گرفته‌اند [16].
ژن MAPK14 روی کروموزوم 6 p21/31 و 22 اگزون دارد. اندازه آن 95254 جفت باز است و از روی آن 13 نوع RNA ساخته می‌شود. MAPK14 یکی از ژن‌هایی است که در مسیر سیگنالینگ MAP Signaling Pathway دخالت میکند [3]. غیر از برخی فرایندهای سلولی این ژن در ایجاد مقاومت در مقابل شیمی‌درمانی و رادیوتراپی توسط مسیرهای سیگنالینگ پروتیین کینازهای فعال‌کننده میتوژن (MAPKs) نقش دارد. خانواده MAPK شامل پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن 14، کیناز تنظیم شده خارج سلولی، پروتئین کینازهای فعال شونده با استرس هستند که دارای فعالیت کینازی بوده و از‌طریق فسفریلاسیون پروتئین‌های مختلف در هدایت پیام نقش دارند. بنابراین گونه‌های فعال اکسیژن با اثر بر روی MAPKs می‌توانند در وقایع مختلف سلولی نقش داشته باشند [5]. با اینکه میزان بیان این ژن در مردان نابارور الیگواسپرم افزایش یافت، منتها این افزایش معنادار نبود و به نظر می‌رسد الیگواسپرمی تحت تأثیر مستقیم این ژن ایجاد نشود. مطالعاتی از این دست عدم ارتباط برخی ژن‌ها را با ناباروری مردان نشان داده‌اند؛ به‌طوری‌که یوسف دانشمندپور نیز در سال 1398 نشان داد بیان ژن‌های CX3CR1 و UBE2B نسبت به افراد گروه کنترل تغییر معناداری نداشته است [17].
ژن PRMT1 کدکننده خانواده پروتئین آرژنین N-متیل‌ترانسفرازهاست و همچنین در تغییرات پس از ترجمه نقش تنظیمی مهمی را در بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی ایفا میکند. گزارش شده است افزایش بیان این ژن ممکن است در بسیاری از انواع سرطان‌ها نقش داشته باشد [4]. همچنین این ژن در فرایند یوبیکوئیتیناسیون دخالت میکند. یوبیکوئیتین یک پپتید نشان‌گذار پروتئولیتیک سلولی است که در کنترل عملکردهای پیچیده سلول‌های انسانی و حیوانی نقش دارد. اصلی‌ترین عملکرد آن نشان‌دار کردن پروتئین‌ها برای تجزیه توسط سیستم پروتئوزومی است. این ژن پایداری، عملکرد و محل قرارگیری پروتئین‌های داخل‌سلولی را هم کنترل میکند [18].
با اضافه شدن یک یوبیکوئیتین به سوبسترا، مولکول‌های یوبیکوئیتین بیشتری می‌توانند به اولی اضافه شوند و یک زنجیره پلی‌یوبیکوئیتین ایجاد می‌کنند. در حالت معمول حدود 4 مولکول یوبیکوئیتین به سوبسترا اضافه می‌شود و در این حالت پروتئین برای تجزیه شدن به سمت کمپلکس پروتئوزوم می‌رود. پروتئوزوم که از چندین زیرواحد تشکیل شده است وظیفه تجزیه پروتئین‌های نشان‌دارشده به‌وسیله یوبیکوئیتین را انجام می‌دهد [19]. یوبیکوئیتین در پلاسمای مایع منی انسان و همچنین در اسپرماتوزوآهای آسیب‌دیده وجود دارد که در طی گذر اپیدیدیمی توسط سلول‌های اپیتلیال اپیدیدیم ترشح می‌شود [20]. آسیب در ساختار DNA و یا ساختارهای دیگر در بیضه ممکن است به راه افتادن مسیرهای آپوپتوز منجر شوند و این اسپرم‌ها ممکن است یوبیکوئیتینه شوند. علاوه‌بر آپوپتوز، پیچش نامناسب آنتی‌ژن‌های سطحی اسپرم و یا از بین رفتن ساختار آن‌ها می‌تواند باعث یوبیکوئیناسیون اسپرم‌های آسیب‌دیده شود [21].
نتیجه‌گیری
باتوجه‌به نقش PRMT1 و اینکه در مطالعه حاضر بیان این ژن افزایش پیدا کرده است می‌توان گفت با افزایش بیان این ژن اسپرم‌های زیادی از بین می‌روند و درنتیجه تعداد اسپرم‌ها در افراد الیگواسپرم کاهش پیدا میکند. همچنین بیان این ژن بر تحرک کل اسپرم‌ها و تحرک پیش‌رونده اسپرمی اثر منفی داشته و باعث غیرطبیعی شدن شکل اسپرم در بیماران مبتلا به الیگواسپرمی شده است.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه پس از تصویب در کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم با کد IR.IAU.QOM.REC.1399.026 و اخذ رضایت‌نامه کتبی از شرکت‌کنندگان انجام شده است.
حامی مالی
مطالعه حاضر از پایان‌نامه کارشناسی ارشد سمیه رضایی در دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم استخراج شده و تحت حمایت معاونت پژوهش دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم انجام شده است.
مشارکت نویسندگان
انجام آزمایش‌ها، کمک در نگارش پیش‌نویس اولیه: سمیه رضایی؛ تجزیه‌وتحلیل داده‌ها: ناصر کلهر؛ طراحی مطالعه، نظارت و نگارش مقاله: مریم خوش‌سخن مظفر؛ خوانش و تأیید نهایی: همه نویسندگان.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
از معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم و همچنین مرکز ناباروری و مرکز تحقیقات جهاد دانشگاهی استان قم قدردانی می‌شود.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
ژنتیک
دریافت: 1401/11/15 | پذیرش: 1402/4/18 | انتشار: 1402/5/10
دریافت: 1401/11/15 | پذیرش: 1402/4/18 | انتشار: 1402/5/10
فهرست منابع
1. Agarwal A, Said TM. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Hum Reprod Update. 2003; 9(4):331-45. [DOI:10.1093/humupd/dmg027] [PMID] [DOI:10.1093/humupd/dmg027]
2. McLachlan RI, Rajpert-De Meyts E, Hoei-Hansen CE, de Kretser DM, Skakkebaek NE. Histological evaluation of the human testis--approaches to optimizing the clinical value of the assessment: Mini review. Hum Reprod. 2007; 22(1):2-16.[DOI:10.1093/humrep/del279] [PMID] [DOI:10.1093/humrep/del279]
3. Li N, Saitou M, Atilla-Gokcumen GE. The role of p38 MAPK in triacylglycerol accumulation during apoptosis. Proteomics. 2019; 19(13):e1900160. [DOI:10.1002/pmic.201900160] [PMID] [DOI:10.1002/pmic.201900160]
4. Ríos-Arrabal S, Artacho-Cordón F, León J, Román-Marinetto E, Del Mar Salinas-Asensio M, Calvente I, et al. Involvement of free radicals in breast cancer. Springerplus. 2013; 2:404. [DOI:10.1186/2193-1801-2-404] [PMID] [DOI:10.1186/2193-1801-2-404]
5. Infantino S, Light A, O'Donnell K, Bryant V, Avery DT, Elliott M, et al. Arginine methylation catalyzed by PRMT1 is required for B cell activation and differentiation. Nat Commun. 2017; 8(1):891. [DOI:10.1038/s41467-017-01009-1] [PMID] [DOI:10.1038/s41467-017-01009-1]
6. Sermondade N, Faure C, Fezeu L, Lévy R, Czernichow S; Obesity-Fertility Collaborative Group. Obesity and increased risk for oligozoospermia and azoospermia. Arch Intern Med. 2012; 172(5):440-2. [DOI:10.1001/archinternmed.2011.1382] [PMID] [DOI:10.1001/archinternmed.2011.1382]
7. Vivanco I, Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer. Nat Rev Cancer. 2002; 2(7):489-501. [DOI:10.1038/nrc839] [PMID] [DOI:10.1038/nrc839]
8. Richards JS, Sharma SC, Falender AE, Lo YH. Expression of FKHR, FKHRL1, and AFX genes in the rodent ovary: evidence for regulation by IGF-I, estrogen, and the gonadotropins. Mol Endocrinol. 2002; 16(3):580-99. [DOI:10.1210/mend.16.3.0806] [PMID] [DOI:10.1210/mend.16.3.0806]
9. Shi F, LaPolt PS. Relationship between FoxO1 protein levels and follicular development, atresia, and luteinization in the rat ovary. J Endocrinol. 2003; 179(2):195-203. [DOI:10.1677/joe.0.1790195] [PMID] [DOI:10.1677/joe.0.1790195]
10. Park Y, Maizels ET, Feiger ZJ, Alam H, Peters CA, Woodruff TK, et al. Induction of cyclin D2 in rat granulosa cells requires FSH-dependent relief from FOXO1 repression coupled with positive signals from Smad. J Biol Chem. 2005; 280(10):9135-48. [DOI:10.1074/jbc.M409486200] [PMID] [DOI:10.1074/jbc.M409486200]
11. Skarra DV, Arriola DJ, Benson CA, Thackray VG. Forkhead box O1 is a repressor of basal and GnRH-induced Fshb transcription in gonadotropes. Mol Endocrinol. 2013; 27(11):1825-39. [DOI:10.1210/me.2013-1185] [PMID] [DOI:10.1210/me.2013-1185]
12. Sinha D, Kalimutho M, Bowles J, Chan AL, Merriner DJ, Bain AL, et al. Cep55 overexpression causes male-specific sterility in mice by suppressing Foxo1 nuclear retention through sustained activation of PI3K/Akt signaling. FASEB J. 2018; 32(9):4984-99. [DOI:10.1096/fj.201701096RR] [PMID] [DOI:10.1096/fj.201701096RR]
13. Rossi BV, Abusief M, Missmer SA. Modifiable risk factors and infertility: What are the Connections? Am J Lifestyle Med. 2014; 10(4):220-231. [DOI:10.1177/1559827614558020] [PMID] [DOI:10.1177/1559827614558020]
14. World Health organization (WHO). WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and sperm-cervical mucus Interaction. Geneva: World Health organization; 1999. [Link]
15. Tahmasbpour E, Balasubramanian D, Agarwal A. A multi-faceted approach to understanding male infertility: Gene mutations, molecular defects and assisted reproductive techniques (ART). J Assist Reprod Genet 2014; 31(9):1115-37. [DOI:10.1007/s10815-014-0280-6] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1007/s10815-014-0280-6]
16. Billig H, Chun SY, Eisenhauer K, Hsueh AJ. Gonadal cell apoptosis: Hormone-regulated cell demise. Hum Reprod Update. 1996; 2(2):103-17. [DOI:10.1093/humupd/2.2.103] [PMID] [DOI:10.1093/humupd/2.2.103]
17. Daneshmandpour Y, Bahramzadeh B, Yousefi M, Nouri M, sakhinia E. [The analysis of expression level of UBE2B and CX3CR1 in sperm cell of infertile patients (Persian)]. Paper presented at: The 6th International Biomedical Congress. 10 November 2022; Tabriz, Iran. [link]
18. Qin J, Wen B, Liang Y, Yu W, Li H. Histone modifications and their role in colorectal cancer (Review). Pathol Oncol Res. 2020; 26(4):2023-33. [DOI:10.1007/s12253-019-00663-8] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1007/s12253-019-00663-8]
19. Jesenberger V, Jentsch S. Deadly encounter: Ubiquitin meets apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002; 3(2):112-21. [DOI:10.1038/nrm731] [PMID] [DOI:10.1038/nrm731]
20. Lippert TH, Seeger H, Schieferstein G, Voelter W. Immunoreactive ubiquitin in human seminal plasma. J Androl. 1993; 14(2):130-1. [DOI:10.1002/j.1939-4640.1993.tb01666.x] [PMID] [DOI:10.1002/j.1939-4640.1993.tb01666.x]
21. Sinha Hikim AP, Swerdloff RS. Hormonal and genetic control of germ cell apoptosis in the testis. Rev Reprod. 1999; 4(1):38-47. [DOI:10.1530/ror.0.0040038] [PMID] [DOI:10.1530/ror.0.0040038]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
