مجله دانشگاه علوم پزشکی قم

مقدمه
کیفیت شیر خام یک موضوع حیاتی برای موفقیت در صنایع لبنی سراسر دنیا می‌باشد که تمرکز آن بر روی مسائل اقتصادی است. امروزه میزان مصرف شیر و فرآورده‌های آن در هر جامعه یکی از مهم‌ترین شاخص‌های توسعه فرهنگی به شمار می‌آید [1]. شیر خام غنی از پروتئین‌های سهل‌الهضم، ویتامین‌های گروه A، 1B، 2B، 6B، پانتوتنیک اسید، اسیدهای چرب اشباع و غیراشباع و املاح فراوان می‌باشد. شیر از لحاظ فراوانی ویتامین‌های K و B12 فقیر می‌باشد [2]. این ماده غذایی، یک محیط رشد مطلوب برای فعالیت میکروارگانیسم‌های مختلف بیماری‌زا می‌‌باشد. رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌های پاتوژن بر روی طعم و دیگر ویژگی‌های ارگانولپتیکی شیر مانند بو، رنگ و مزه آن نیز تأثیرات نامطلوبی دارد که علاوه‌بر فساد در شیر، سبب ایجاد بیماری‌هایی حتی کشنده می‌شود [3]. یکی از میکروارگانیسم‌هایی که می‌تواند سبب کاهش کیفیت و آلودگی در شیر شود، قارچ‌ها و کپک‌ها هستند.
قارچ‌ها و کپک‌ها، به وفور در اتمسفر وجود دارند. چنانچه شرایط نگهداری علوفه و اغذیه مورداستفاده دام‌ها مناسـب نباشـد، وجـود رطوبـت، هـوا و گرمـای مناسب، شرایط مطلوبی را برای رشد، ازدیاد و تکثیر قارچ‌ها فراهم می‌کند. از مهم‌ترین قارچ‌های آلوده‌کننـده علوفه دام‌ها کـه در بـروز آلودگی‌های گاوداری‌ها نقش دارند، مایکوتوکسین‌ها هستند [4]. مایکوتوکسین‌ها متابولیت‌های ثانویه خطرناکی هستند که توسط گونه‌های مختلف کپکی تولید می‌شوند و خطرات جدی برای سلامت انسان و حیوان ایجاد می‌کنند. ازجمله این مخاطرات در انسان، می‌توان به توانایی ایجاد سرطان کبد اشاره کرد. ‌در بین مایکوتوکسین‌ها، آفلاتوکسین‌ها مهم‌ترین نوع سموم کپکی هستند که عمدتاً از آسپرژیلوس‌ها تولید می‌شوند [5-7].
آفلاتوکسین‌ها از گروهی از تقریباً 20 متابولیت قارچی مرتبط تشکیل شده‌اند و می‌توانند در طیف گسترده‌ای از مواد غذایی مهم همانند غلات، آجیل، ادویه‌جات ترشیجات، انجیر، میوه‌های خشک و از همه مهم‌تر در جیره و علوفه دام‌ها وجود داشته باشند. آفلاتوکسینM1 متابولیت هیدروکسیله آفلاتوکسینB1  است و در شیر و متعاقباً در سایر محصولات لبنی هنگامی که حیوانات شیرده با مواد غذایی آلوده تغذیه می‌شوند، یافت می‌شود. وجود آفلاتوکسینM1 در شیر به‌ویژه شیر گاو، به‌دلیل اهمیت آن به‌عنوان یک ماده غذایی برای بزرگسالان و به‌ویژه کودکان، آن را برای انسان تبدیل به یک خطر خاص می‌کند [8]. آفلاتوکسین می‌تواند توسط 3 گونه آسپرژیلوس تولید شود که شامل آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نومیوس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس می‌شود که گیاهان و محصولات گیاهی را آلوده می‌کنند [9].
آفلاتوکسین M1 می‌تواند 12-24 ساعت بعد از ورود افلاتوکسین B1‌ به بدن دام، در شیر تشخیص داده شود و پس از چند روز به سطح بالایی می‌رسد. هنگامی که جذب آفلاتوکسین B1 به اتمام رسید، غلظت آفلاتوکسین M1 در شیر بعد از 72 ساعت به سطحی غیرقابــل تشخیــصی کــاهش پیدا می‌کند. به جهت شناسایی، جداسازی و اندازه‌گیری آفلاتوکسـین موجـود در شیر گاوداری‌ها، شیوه‌های متفاوتی وجود دارد مانند کرومـاتوگرافی لایه نازک، کروماتوگرافی مایع با کارکرد بـالا، کروماتوگرافی گازی-اسپکترومتری جرم و الایـزا کـه امروزه روش الایزا به‌علت سرعت بالا بیشتر مـورد اسـتفاده قـرار می‌گیرد [10-12].
افزودن آب یکی از ساده‌ترین انواع تقلبات می‌باشد که به جهت افزایش وزن، حجم و وزن مخصوص شیر پس از برداشتن چربی در آن صورت می‌گیرد. می‌توان با اندازه‌گیری وزن مخصوص شیر و همچنین نقطه انجماد، به تقلبات ناشی از اضافه کردن تقلبات در شیر خام پی‌برد [13]. وجود تقلبات در حوزه شیر و لنبات بیشتر در کشورهای در حال توسعه همچون هند، پاکستان و ایران وجود دارد. به این دلیل که وجود هرگونه ناخالصی در شیر خام، پاستوریزه و یا استریلیزه، سبب ایجاد مخاطراتی برای مصرف‌کنندگان می‌شود، بنابراین هدف از این مطالعه بررسی وجود آفلاتوکسین M1، آب و آلودگی میکروبی در شیر خام، سنتی و پاستوریزه شهرستان قم در سال 1401 است.
مواد و روش‌ها
درمجموع تعداد 180 نمونه شیر در سال 1401 از مراکز عرضه شیر خام، شیرسنتی و جهت نمونه‌گیری شیر پاستوریزه به فروشگاه‌های سطح شهر مراجعه کردند و بعد از نمونه‌گیری به آزمایشگاه بهداشت مواد غذایی منتقل شدند.
اندازه‌گیری توتال کانت
ابتدا 5 گرم از نمونه‌ها رقیق‌سازی ‌شدند و تا رقت 3- آماده‌سازی شد و به روش پورپلیت در دمای 37 درجه به‌مدت 24 ساعت در محیط کشت پلیت‌کانت‌آگار به‌صورت خطی کشت داده شد و کلنی‌های رشدکرده در پلیت شمارش شدند [14].
اندازه‌گیری نقطه انجماد
به منظور پی بردن به آب اضافی در شیر، نقطه انجماد شیر اندازه‌گیری می‌شود. سنجش نقطه انجماد شیر خام به‌وسیله دستگاه کرایوسکوپ و وزن مخصوص شیر به‌وسیله ترمولاکتو دانسیتومتر مورد بررسی قرار گرفت. در صورت افزودن آب به تنهایی به شیر، وزن مخصوص شیر کاهش می‌یابد و به‌دلیل کاهش غلظت نمک و لاکتوز، نقطه انجماد شیر به نقطه انجماد آب نزدیک‌تر می‌شود [13].
آماده‌سازی نمونه جهت اندازه‌گیری میزان آفلاتوکسین M1 در نمونه‌ها
همه نمونه‌های شیر سرد در سانتریفیوژ یخچال‌دار با دور 3500 به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند و لایه‌های چربی روی شیر برداشته و خارج شــدند. سپس 100 میکرولیتر از نمونه شیر بدون چربی جهت بررسی آفلاتوکسین M1‌ جدا شد [15-17].
اندازه‌گیری آفلاتوکسین M1 به روش ELISA
در ایــن آزمایش کیت الایزای آفلاتوکسینM1‌ (‌‌Biopharm-R, Germany) برای سنجش آفلاتوکسین M1 ‌در شــیر استفاده شد. آزمایش طبق دستورالعمل سازنده کیت انجام شد. به‌طور خالص، 50 میکرولیتر از هر کدام از استانداردها (‌0 ،250 ،500 ،1000 و 2000 نانوگرم بر لیتر) به 50 میکرولیتر ‌از نمونه شــیر بدون چربی در درون چاهک اضافه شد. سپس به‌ترتیب میزان 50 میکرولیتر کنژوکه و 50 میکرولیتر آنتی‌بادی هم به هر چاهک اضافه شد. کیت به‌صورت دســتی چندین بار در جهات مختلف حرکت داده شــد تا تمام محتویات هر چاهک کاملاً با هم مخلوط شــوند. کیت به‌مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. بعد از 10 دقیقه تمام محتویات کیت خارج و کیت 3 مرتبه با آب مقطر شست‌وشــو شد. به کیت به‌صورت وارونه ضربه زده شــد تا تمام آب مقطر موجود در چاهک‌ها خارج و چاهک‌ها تماماً خشک شوند. سپس 100 ‌میکرولیتر از محلول کروموژن به هر چاهک اضافه شــد و سپس کیت به‌صورت دستی چندین بار در جهات مختلف حرکت داده شد تا تمام محتویات چاهک با هم مخلوط شوند. سپس کیــت به‌مدت 5 دقیقه در محیط تاریک قرار داد شــد. پس از 5 دقیقه،100 میکرولیتر محلول متوقف‌کننده به هر چاهک اضافه شد. کیت چندین بار تکان داده شد و سپس با دستگاه الایزا ریدر (Germany, Tech-Bio) با طول موج 450 نانومتر میزان جذب نوری محاسبه و پس از رسم منحنی، غلظت آفلاتوکسین M1‌ محاسبه شد [17].
آزمون آماری
در مطالعه حاضر جهت تحلیل آماری ‌داده‌ها از نرم‌افزار SPSS نسخه 23 و از روش کای‌اسکوئر استفاده شد. همچنین حد معنا‌داری در مطالعه حاضر 05/0>P در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
نتایج حاصل از تحلیل آماری شیرهای موردنظر ازنظر تقلب به آب در تصویر شماره 1 نشان داده شده است. در بین نمونه‌ها، ازنظر عدم تقلب اختلاف معناداری وجود داشت (05/0>P) . البته بین نمونه شیرخام و شیر پاستوریزه باتوجه‌به استاندارد مربوطه به شیر خام و پاستوریزه اختلاف معناداری نبود.
نتایج حاصل از تحلیل آماری در بین 180 نمونه شیرهای موردنظر ازنظر بار میکروبی شمارش‌ کلی در جدول شماره 1 نشان داد در بین نمونه‌ها، ازنظر سالم بودن اختلاف معناداری وجود داشت (05/0>P). البته بین نمونه به‌ترتیب کمترین و بیشترین میزان شمارش‌کلی را نمونه شیرپاستوریزه و شیر سنتی داشت.
نتایج حاصل از تحلیل آماری در بین180 نمونه شیرهای موردنظر ازنظر دارا بودن آفلاتوکسین در جدول شماره 2 نشان داد در بین نمونه‌ها، ازنظر سالم بودن اختلاف معناداری وجود داشت (05/0>P‌). از بین 180 نمونه به‌ترتیب کمترین و بیشترین میزان آفلاتوکسین را نمونه شیرپاستوریزه و شیرخام داشت.

بحث
مطابق استاندارد اتحادیه اروپا، حد مجاز آفلاتوکسین در شیر 50 نانوگرم بر لیتر در هر لیتر می‌‌باشد [18]. طبق استاندارد اروپا هیچ‌کدام از نمونه‌های شیرخام، سنتی و صنعتی فراتر از محدوده تعیین‌شده توسط استاندارد اتحادیه اروپا نیست.
در مطالعه انجام‌شده در چین 280 نمونه، 8/52 درصد از 530 نمونه به آفلاتوکسین آلوده بودند که 9/28 درصد از آن‌ها، غلظت بیش از حد مجاز استاندارد را داشت [19] که با نتایج حاصل از مطالعه حاضر ارتباطی ندارد. در یک مطالعه در ترکیه، 1/30 درصد از نمونه‌های شیر خام به آفلاتوکسین آلوده بودند که 17 درصد از نمونه‌ها دارای آلودگی بیشتر از میزان استاندارد تعریف شده بود [20] که با نتایج این تحقیق مطابقتی ندارد. در این مطالعه تمامی نمونه‌ها آلوده به آفلاتوکسین M1 بود، اما هیچ‌کدام از نمونه‌ها بالاتر از میزان استاندارد نبودند.
 در کشور اردن مطالعه مشابهی انجام شد که نشان داد رخداد افلاتوکسین در نمونه‌های شیر 100 درصد بود، در‌حالی‌که 17 درصد از نمونه‌ها رنج بالای 50 نانوگرم در لیتر را داشتند که بالاتر از استاندارد بود [21]. در مطالعه حاضر 100 درصد از نمونه‌ها به آفلاتوکسین آلوده بودند، اما هیچ‌کدام از نمونه‌ها آلودگی بالاتر از 50 نانوگرم را نداشت. مطالعه واقف و محمدی در غرب ایران 144 نمونه شیر (102 نمونه شیر خام و 42 نمونه شیر پاستوریزه) را ازنظر آفلاتوکسین ‌M1 با روش الایزا مورد بررسی قرار دادند. آفلاتوکسین M1 در 91/47 درصد از نمونه‌ها با غلظت متوسط 40/45±18/39 نانوگرم در لیتر یافت شد. بالاترین میانگین غلظت آفلاتوکسین M1 در نمونه‌های گاوداری سنتی (5/9±9/43 نانوگرم در لیتر) ثبت شد. غلظت آفلاتوکسینM1 در 5/21 درصد شیر خام گاو و 9/11 درصد شیرهای پاستوریزه بالاتر از حداکثر حد تحمل پذیرفته‌شده توسط اتحادیه اروپا/کمیسیون Codex Alimentarius‌ (50 نانوگرم در لیتر) بود.
 میزان آلودگی در زمستان به‌طور معناداری (05/0>P) بیشتر از تابستان بود [22] که با نتایج حاصل از مطالعه حاضر مطابقت ندارد. در این مطالعه میزان آفلاتوکسین در شیر خام در محدوده 32، شیر سنتی 27 و شیر پاستوریزه در محدوده 12 نانوگرم بر لیتر بود که هیچ‌کدام از نمونه‌ها، فراتر از استاندارد (50 نانوگرم بر لیتر) نبودند. ایوب وهمکاران در سال 2011 در مطالعه‌ای به بررسی و تعیین آفلاتوکسینM1 در محصولات لبنی محلی پرداختند. از 141 نمونه محصول لبنی (شیر خام، شیر پاستوریزه، شیر خشک، ماست، پنیر فتا) که مورد آزمون قرار گرفت نتایج نشان داد 6/54 درصد از شیر و محصولات لبنی آلوده به آفلاتوکسین M1 بودند [23] که در این مطالعه 100 درصد نمونه‌ها به آفلاتوکسین آلوده بودند.
مشابه سایر آفلاتوکسین‌ها، آفلاتوکسینM1  در گروه 1 به‌عنوان سرطان‌زا برای انسان طبقه‌بندی‌ شده است، زیرا شواهد کافی برای سرطان‌زایی کبدی در انسان وجود دارد. تقریباً 5/0 تا 5 درصد آفلاتوکسینB1 که در خوراک دام می‌باشد، به‌صورت آفلاتوکسین M1 در شیر منتقل می‌شود. مطالعات نشان داده است که آفلاتوکسین M1 می‌تواند به سرعت (در عرض 12 ساعت) پس از مصرف آفلاتوکسینB1 توسط گاوهای شیرده ظاهر شود و غلظت آن به‌تدریج به زیر حد تشخیص در طی 72 ساعت پس از حذف خوراک‌های آلوده به آفلاتوکسینB1 کاهش یابد [24].
مطالعات تاجیک و همکاران در سال 2007 بر روی میزان افلاتوکسین M1 در شهرستان ارومیه نشان داد که از 72 نمونه انتخاب‌شده، تمامی نمونه‌ها به آفلاتوکسین آلوده هستند که 25/6 درصد از نمونه‌ها فراتر از استانداردهای ملی بودند [25] که با نتایج حاصل از این مطالعه درخصوص درصد آلودگی همسو بود، اما در مطالعه حاضر، در هر 3 نمونه شیر خام، سنتی و پاستوریزه آلودگی کمتر از میزان استاندارد بود. در مطالعه کامکار و همکاران در سال 2005 از مجموع 111 نمونه انجام‌شده مشخص شد که 6/76 درصد از آلودگی به افلاتوکسین گزارش شد که از این میزان آلودگی، همه آن‌ها در محدوده مجاز می‌باشند [26] که درخصوص محدوده غلظت سم، با مطالعه حاضر ارتباط دارد. نتایج به‌دست‌آمده از تحقیق باطنی و صمدزاده در سال 1380 در زنجان بر روی شیرخام و پنیرهای محلی نشان داد که از 108 نمونه پنیر مورد آزمون (1/77 درصد) و 134 نمونه شیر (3/84 درصد) ازنظر اشرشیاکلی مثبت هستند و کلیه نمونه‌ها بار میکربی توتال بیش از حد استاندارد را داشتند [27] که در مطالعه حاضر بیشترین رنج آلودگی در شیر خام بود.
در مطالعه شیونگ و همکاران در سال 2018 بر روی رخداد افلاتوکسین در شیرخام و فراورده‌های لنبی مشخص شد که از مجموع 111 نمونه مورد آزمایش، تقریباً 6/73 درصد از نمونه‌های شیر خام برای آفلاتوکسینM1 با میانگین 0/100 نانوگرم در لیتر مثبت بودند. محتوای آفلاتوکسینM1 در 8/1 درصد از نمونه‌های شیر استریلیزه و در 5/59 درصد از نمونه‌های شیر پاستوریزه، بالاتر از حد قانونی اتحادیه اروپا 50 نانوگرم در لیتر بود، درحالی‌که تمام نمونه‌های شیر در چین کمتر از حد قانونی 500 نانوگرم در لیتر بودند [28]. در این مطالعه در هیچ‌کدام از نمونه‌ها آلودگی فراتر از استاندارد گزارش نشد. در مطالعه دیگری از فلاح و همکاران در یزد در سال 2016 بر روی بررسی رخداد آفلاتوکسین M1 در شیرهای خام، به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان آلودگی مربوط به شیر گاو با 5/46 درصد بود. سپس به‌ترتیب گوسفند، بز و شتر با درصدهای 6/21، 1/20 و 03/4 درصد به افلاتوکسین آلوده بودند [29]. در مطالعه حاضر به بررسی آلودگی شیر خام، سنتی و صنعتی گاو پرداخته شد و مشخص شد میزان آلودگی به آفلاتوکسین M1 پائین‌تر از محدوده استاندارد است.
مطالعه عبادی و همکاران بر روی تقلبات شیر خام تحویلی به کارخانه‌ها گزارش دادند که به هیچ‌کدام از شیرهای خام تحویل‌داده‌شده به کارخانه‌ها آب اضافه نشده بود [13]، درحالی‌که در این مطالعه 58 نمونه از 60 نمونه شیر خام بدون تقلب بود. شیرهای پاستوریزه فاقد تقلب بودند و شیرهای سنتی 4 مورد تقلب داشتند. در مطالعه محمودی و همکاران مشخص شد که به 40 درصد از شیرهای سنتی آب اضافه شده است [30] که با نتایج این مطالعه رابطه‌ای ندارد. مطالعات چندا و همکاران بر روی تقلبات شیر نشان داد که هیچ‌کدام از شیرهای خام عرضه‌شده در مراکز عرضه، تقلب (اضافه کردن آب) نداشته است [31] که با مطالعه حاضر تا حدودی درخصوص شیر سنتی همسو است. در مطالعه‌ای مشابه در شهر فیصل‌آباد پاکستان نشان دادند که به 70 درصد از شیرهای خام عرضه‌شده آب اضافه شده است [32]که با نتایج این تحقیق مطابقتی ندارد.
امروزه افزایش میزان تقلبات در شیرهای خام به یک امر مهم برای سازمان‌های نظارتی و بهداشتی تبدیل شده است. به‌علت میزان بالای تولید شیر و عدم وجود امکانات نگهداری شیر خام و نقل‌وانتقال مناسب آن، در مواردی تولیدکنندگان و مراکز جمع‌آوری شیر برای آنکه از فساد شیر جلوگیری شود و یا شیر را تازه نشان دهند، موادی را به شیر اضافه می‌کنند. آب یکی از این موارد است که باتوجه‌به قیمت ارزان آن می‌تواند گردش مالی قابل توجهی را برای شخص خاطی درپی داشته باشد.
برای مقابله با آفلاتوکسین M1 در شیر و فرآورده‌های لبنی، توجه به حساس‌ترین مراحل تولید خوراک گاوهای شیرده ضروری است. برای جلوگیری از تلفات محصول و خطرات برای سلامت انسان و دام، مراقبت از این مراحل که می‌تواند نقطه بحرانی برای رشد قارچ و تولید مایکوتوکسین در سیستم کشاورزی ارگانیک باشد، ضروری است. ازآنجایی‌که این ترکیبات به‌طور قابل توجهی منابع غذایی حیوانات را آلوده می‌کنند، نگرانی بیشتری در مورد آلودگی مواد غذایی در سایر مناطق جهان به‌ویژه منابع غذایی که توسط انسان مصرف می‌شود، وجود دارد‌. براساس برآوردهای سازمان بهداشت جهانی، سالیانه یک‌چهارم محصولات تولیدشده تحت تأثیر سموم قارچی قرار می‌گیرند و میزان زیان‌های ناشی از حذف مواد غذایی آلوده و خسارات وارده به محصولات کشاورزی در آمریکا در هر سال حدود 100 میلیون دلار برآورد می‌شود. بارندگی زیاد و مداوم در مناطق پر باران، محصول برنج را به‌ویژه در مناطق گرم، مستعد آلودگی و تهاجم قارچی و باکتری می‌کند. با وجود تلاش کشاورزان برای خشک کردن محصول، این فرآیند به‌طور مطلوب انجام نشده و رطوبت دانه‌ها به میزان قابل قبولی کاهش نمی‌یابد و نتیجه آن آلودگی و عفونت قارچی در زمان برداشت یا طی دوره انبارداری خواهد بود [33-35].
شیرهایی که در این مطالعه آزمایش شده‌اند، ازنظر آلودگی آفلاتوکسینM1 برای مصرف بی‌خطر هستند. نظارت مستمر بر ارزیابی مداوم سطوح آفلاتوکسینM1 در جیره دام‌ها و همچنین آفلاتوکسینM1 در شیر گاوداری‌ها لازم است و این امر به‌ویژه برای کشورهایی که در معرض خطر بالا برای وقوع آفلاتوکسینM1 در نظر گرفته می‌شوند، بیشتر است.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه در کمیته اخلاق دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد شهرکرد (کد: IR.IAU.QOMREC.1402.005) تأیید شده است.

حامی مالی
این پژوهش با بودجه دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انجام شده است.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در آماده‌سازی این مقاله مشارکت داشتند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از ریاست دانشگاه آزاد شهرکرد تشکر می‌کنند.