دوره 12، شماره 2 - ( اردیبهشت 1397 )
جلد 12 شماره 2 صفحات 18-11 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Rahmati M, Ghanbarzadeh M, Aghaei M H. The Effect of Decreased Activity in the Form of Neuropathic Pain on GSK-3β Gene Expression in Sciatic Nerve Fiber of Male Wistar Rats. Qom Univ Med Sci J 2018; 12 (2) :11-18
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-889-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-889-fa.html
رحمتی مسعود، قنبرزاده مختار، آقایی محمد حسن. تأثیر فعالیت کاهش‌یافته به شکل درد نوروپاتیک بر بیان ژن GSK-3β در عصب سیاتیک رت‌های نر ویستار. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1397; 12 (2) :11-18
مسعود رحمتی* 
1، مختار قنبرزاده2 ، محمد حسن آقایی3
1، مختار قنبرزاده2 ، محمد حسن آقایی3
1- گروه علوم ورزشی، دانشکده ادبیات و علوم انسانی، دانشگاه لرستان، خرم‌آباد، ایران. ، mo69ph@yahoo.com
2- مرکز تحقیقات فیزیولوژی و فارماکولوژی، دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کرمان، ایران.
3- 3گروه فیزیولوژی ورزشی، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران.
2- مرکز تحقیقات فیزیولوژی و فارماکولوژی، دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کرمان، ایران.
3- 3گروه فیزیولوژی ورزشی، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران.
متن کامل [PDF 698 kb]
(1109 دریافت)
| چکیده (HTML) (5079 مشاهده)
متن کامل: (1669 مشاهده)
مقدمه
درد نوروپاتیک، شکلی از درد مزمن است که به‌صورت درد ناشی از آسیب یا بیماری سیستم حسی - پیکری تعریف شده و به شکل آلوداینیا، پردردی و درد خودبه‌خود مشاهده می‌شود (1). درد نوروپاتیک علاوه بر تغییر سیستم عصبی، موجب کاهش سطح فعالیت‌های جسمانی و روزانه می‌شود. این درد ممکن است به‌صورت مستقیم و غیرمستقیم بر ساختار و عملکرد سلول‌های عصبی از طریق کاهش قابلیت سنتز پروتئین تأثیر بگذارد (2). در شرایط پاتولوژیکی نظیر درد نوروپاتی، تخریب عصبی از نوزایش عصبی پیشی می‌گیرد. علاوه بر تغییر سیستم عصبی، درد نوروپاتیک موجب کاهش سطح فعالیت جسمانی و آمادگی حرکتی نیز می‌شود (2،3). از این‌رو این بیماران در خطر فقر حرکتی و عوارض ناشی از آن مانند چاقی قرار دارند که خود آن‌ها نیز می‌توانند سبب وخیم‌ترکردن بیماری و کاهش بیشتر فعالیت بدنی شود. در این راستا، مطالعات بسیاری نشان می‌دهند اختلالات پروتئین کینازهای عصبی، یکی از کاندیدهای سازوکارهای بیماری‌های عصبی می‌باشند (4). گلیکوژن سنتاز کیناز-3 بتا (GSK-3β)، یکی از این پروتئین‌ها می‌باشد و GSK-3β نیز یک کیناز سرین/ترئونین بوده که بهعنوان یکی از اهداف درمانی در بیماری‌های تخریب عصبی مطرح است (5).
GSK-3 از اهمیت زیادی برخوردار است؛ زیرا درصورت وجود نقص تنظیمی در مسیرهایی که GSK-3 بهعنوان یک تنظیم‌کننده عمل می‌کند، پیشرفت بیماری‌هایی نظیر دیابت، آلزایمر، اسکلروز جانبی آمیوتروفیک، پارکینسون، سرطان و دیگر اختلالات عصبی مشاهده می‌شود. همچنین مهار این آنزیم در افزایش بقای نورونی، مؤثر گزارش شده است (6).
به دلیل شرکت داشتن این آنزیم در بسیاری از فرآیندها و بیماری‌ها، GSK-3 بهعنوان یکی از اهداف درمانی و توسعه داروسازی مطرح است؛ بهعنوان مثال گزارش شده است در بیماری آلزایمر، افزایش غیرطبیعی سطوح و فعالیت GSK-3β علاوه برکاهش عملکرد شناختی با مرگ نورونی، سکته مغزی، اختلالات آکسونی و پروتئین تائو همراه است (7).
از طرفی، تغییر در سبک زندگی مانند تغذیه سالم، افزایش فعالیت بدنی و ورزش می‌تواند به میزان قابل‌ملاحظه‌ای شیوع برخی بیماری‌های عصبی و عوارض ناشی از آن را کاهش دهد (8)، به‌طوری‌که تغییرات ایجادشده در اثر تمرین ورزشی در نورون‌ها بازتابی از تغییرات ایجادشده در متابولیسم انرژی، فعالیت لیزوزومی، بیوسنتز RNA، افزایش انتقال آکسوپلاسمی استیل‌کولین و افزایش نرخ جوانه‌زنی در پی برش عصبی است. همچنین تمرینات ورزشی منظم می‌تواند شکل‌پذیری مغز، سیستم ضداکسایشی و تنظیم افزایشی نوروتروفین‌ها را ارتقا بخشد و از آپوپتوزیز سلول‌های عصبی نیز جلوگیری کند. همچنین ورزش می‌تواند بیوسنتز RNA، افزایش انتقال آکسونی و افزایش میزان جوانه‌زنی عصبی در پی برش عصبی را به همراه داشته باشد (9)
به‌طورکلی، با توجه به نقش GSK-3β در عصب سیاتیک، اختلال عملکرد و ساختار عصب سیاتیک در درد نوروپاتیک، این احتمال می‌رود که بیان GSK-3β در شرایط فعالیت کاهش‌یافته و به شکل درد نوروپاتیک و لیگاتوربندی نخاع، در عصب سیاتیک نیز دچار اختلال گردد. در پژوهش حاضر تأثیر 6 هفته فعالیت کاهش‌یافته به شکل درد نوروپاتیک بر بیان GSK-3β در عصب سیاتیک رت‌های نر ویستار دارای درد نوروپاتیک بررسی گردید.
روش بررسی
در این مطالعه تجربی، 12 سر رت صحرایی بالغ نر 10 هفته‌ای از نژاد ویستار (با محدوده وزنی 30±250 گرم) از بخش پرورش حیوانات مرکز تحقیقات رازی تهیه شد و به آزمایشگاه حیوانات دانشگاه تربیت مدرس منتقل گردید. تمامی رت‌ها در شرایط استاندارد محیطی (با میانگین دمای 3±22 درجه سانتیگراد، چرخه روشنایی - تاریکی 12:12 ساعت، رطوبت نسبی 40%) و دسترسی آزاد به آب و غذا (مخصوص موش‌ها) نگهداری شدند. در این پژوهش کلیه اصول اخلاقی کار با حیوانات مورد تأیید کمیته اخلاق دانشگاه تربیت مدرس، در طول انجام تحقیق رعایت گردید.
پس از 2 هفته آشناسازی و سازگاری حیوانات با محیط جدید، پروتکل‌های آزمایشی و تمرینی آغاز گردید. جهت لیگاسیون ابتدا رت‌ها با سدیم پنتوباربیتول (دوز 60 میلی‌گرم در هر کیلوگرم) به‌صورت درون صفاقی بیهوش شدند، سپس عصب پنجم کمری نخاعی آن‌ها براساس روش Kim و Chang به‌طور محکم گره زده شد (7). به‌طور خلاصه، عضلات بین‌مهره‌ای در سطح مهره 4 کمری و 2 خاجی را جدا و زائده عرضی ششمین مهره کمری برداشته شد. عصب پنجم کمری سمت چپ نخاع، مشخص و با ظرافت از اعصاب مجاور جدا گردید. سپس عصب پنجم کمری به‌طور محکم با استفاده از نخ مخصوص، دقیقاً در انتهای دیستال جهت اطمینان از ایجاد اختلال در تمام فیبرها گره زده شد. همچنین، جهت اجتناب از آسیب به عصب چهارم کمری، دقت بالایی مبذول گردید. در گروه کنترل نیز فرآیند جراحی مشابهی بجز آسیب و لیگاسیون عصب پنجم کمری انجام شد. تنها حیواناتی در ادامه آزمایش لحاظ شدند که درد نوروپاتی را در آزمون‌های رفتاری نشان داده بودند. سپس رت‌ها به 2 گروه 6 تایی شامل: گروه کنترل سالم (C) و گروه درد نوروپاتی (SNL) تقسیم شدند. پس از 6 هفته، رت‌ها جهت استخراج نمونه با تزریق درون صفاقی کتامین (90 میلی‌گرم در هر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلی‌گرم در هر کیلوگرم) بیهوش و نمونه بافت عصب سیاتیک برای تجزیه و تحلیل‌های بعدی در نیتروژن 80- قرار داده شد.
برای سنجش هایپرآلژزیا حرارتی از دستگاه Radiation Heat استفاده شد که در آن بخش میانی کف پای حیوان از میان سطح پلکسی گلاس در معرض تشعشع ثابت حرارتی قرار گرفت و زمان آستانه پس کشیدن پنجه (PWTs) محاسبه گردید. تحریکات گرمایی 3 مرتبه و با فواصل 10-5 دقیقه تکرار می‌شد. برای سنجش هایپرآلجزیا مکانیکی، مجدداً حیوان بر روی شبکه سیمی قرار داده شد و 5 بار متوالی کف پای حیوان (به فاصله 15 ثانیه و مدت یک ثانیه) با وارد نمودن نیرو به‌وسیله Pin Prick تحریک گردید. چنانچه حیوان پای خود را بلند می‌کرد، بهعنوان پاسخ مثبت و در غیر این صورت بهعنوان پاسخ منفی در نظرگرفته می‌شد. درصد پاسخ از طریق محاسبه نسبت تعداد پاسخ مثبت حیوان به کل تعداد تحرکات محاسبه گردید.
جهت سنجش آلوداینای مکانیکی، حیوان بر روی یک شبکه سیمی و در داخل یک محفظه پلکسی گلاس (به ابعاد 20×20 و ارتفاع 30 سانتی‌متر) قرار گرفت. پس از سازگاری حیوان با محیط جدید، از فیبرهای Von Frey در محدوده وزنی 60-2گرم (2-4-6-8-15-26-60) ساخت شرکت StoltingInc استفاده شد. آزمایش با سبک‌ترین فیبر شروع و درصورت عدم پاسخ، به ترتیب از فیبرهای سنگین‌تر استفاده گردید. برای ایجاد تحریک هر فیبر، سه بار متوالی (به فاصله 5 ثانیه و هربار به مدت یک ثانیه) به کف پای حیوان فشار وارد شد. چنانچه 2 بار متوالی پاسخ (بلند کردن پا توسط حیوان) مشاهده می‌شد، همان وزن فیبر بهعنوان آستانه پاسخ در نظرگرفته می‌شد. چنانچه حیوان به هیچ‌یک از فیبرها پاسخ نمی‌داد، عدد 60 بهعنوان آستانه پاسخ در تلقی می‌گردید (8).
استخراج RNA به‌وسیله QIAzol® Lysis Reagent (Qiagen، آلمان) و کلروفرم (Qiagen، آلمان) به روش دستی و طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. بدین صورت که حدود 50 میلی‌گرم بافت عصبی به‌طور جداگانه، برای استخراج RNA کل به نسبت 1 به 10 در QIAzol® LysisReagent به روش هاون‌کوبی همگن شد و به‌منظور برداشتن اجزای پروتئینی، عمل سانتریفوژ (در 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه، با دور 12000) انجام شد. سپس به نسبت 1 به 5/0 با کلروفرم مخلوط و به‌مدت 15 ثانیه، به‌شدت تکان داده شد. محصول در 4 درجه سانتیگراد (به مدت 15 دقیقه و با دور 12000) سانتریفوژ و بخش معدنی و آبی از هم جدا شدند، بخش محتوی RNA برداشته و با نسبت 1 به 5/0 با ایزوپروپانول مخلوط و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق رها شد، سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد (به مدت 10 دقیقه و با دور 12000 ) سانتریفوژ گردید. Pellet حاوی RNA در اتانول شست‌وشو و در 20 میکرولیتر آب RNas-Free حل شد. در ادمه، غلظت RNA اندازه‌گیری (Eppendorff، آلمان) و نسبت 260 به 280 بین 2-8/1 بهعنوان تلخیص مطلوب تعریف گردید. سنتز cDNA با استفاده از QuantiTectReverseTranscription kit (Qiagen، آلمان) و براساس دستورالعمل شرکت سازنده صورت گرفت.
برای اندازه‌گیری سطوح بیان mRNA GSK-3β، روش کمّی Real-Time PCR با استفاده از Primix Syber GreenII به کار برده شد (Applied Biosystems Step One، آمریکا). مخلوط واکنش در حجم نهایی 20 میکرولیتر (شامل 1 میکرولیتر cDNA، 1 میکرولیتر آغازگر جلویی، 1 میکرولیتر آغازگر برگشتی، 7 میکرولیتر آب DEPC، 10 میکرولیتر Syber Green و هر واکنش به‌صورت مضاعف انجام شد. طراحی آغازگرها براساس ژن‌های GSK-3β و
(Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase) GAPDH در بانک ژنی NCBI و توسط شرکت Qiagen (آلمان) انجام گرفت. توالی آغازگرهای مورد استفاده در جدول شماره 1 گزارش شده است؛ ضمن اینکه از GAPDH بهعنوان ژن مرجع استفاده شد. برنامه دمایی مورد استفاده در Realtime-PCR شامل: 95 درجه سانتیگراد، به مدت 10 دقیقه؛ 95 درجه سانتیگراد، به مدت 15 ثانیه؛ 60 درجه سانتیگراد، به مدت 1 دقیقه (تکرار 40 چرخه) بود. نمودارهای ذوب برای بررسی درستی داده‌ها و نمودارهای استاندارد به‌منظور بهینه‌سازی شرایط آزمایش ترسیم و بررسی شدند و بیان داده‌ها توسط نسبت بیان ژن GSK-3β به ژن مرجع محاسبه گردید. میزان بیان ژن‌های مورد نظر نیز با روش 2-∆∆CT اندازه‌گیری شد (9).
داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 16، تحلیل واریانس دو طرفه با اندازه‌گیری مکرر (جهت مقایسه آزمون‌های رفتاری در دو گروه در طول مطالعه) و آزمون تی مستقل (برای بررسی تغییرات بیان ژن)تحلیل شدند. برای انجام آزمون‌های تکمیلی، آزمون تعقیبی LSD (Least Significant Difference) به عمل آمد. سطح معنی‌داری، 05/0a= در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
در این مطالعه، لیگاسیون عصب پنجم کمری منجر به کاهش معنی‌دار زمان پس کشیدن پنجه در گروه SNL شد (05/0p≤)، و این مسئله تا پایان هفته ششم نیز ادامه یافت (نمودار شماره 1). این یافته نشان می‌دهد لیگاسیون عصب پنجم کمری پاسخ پردردی حرارتی را در گروه SNL به همراه دارد.
نمودار شماره 1: تغییرات درد نوروپاتیک (هایپرآلژزیای حرارتی)، * اختلاف معنی‌داری نسبت به گروه کنترل.
همچنین، لیگاسیون عصب پنجم کمری منجر به کاهش معنی‌دار آستانه پس‌کشیدن پنجه در گروه SNL شد (05/0p≤)، که این مسئله تا پایان هفته ششم نیز ادامه یافت (نمودار شماره 2). این یافته نشان می‌دهد لیگاسیون عصب پنجم کمری پاسخ آلودانیای مکانیکی را در گروه SNL به همراه دارد. به‌طورکلی، مشاهده پاسخ‌های پردردی حرارتی و آلودینیای مکانیکی در گروه SNL تا پایان هفته ششم، نشان‌دهنده اثبات مدل فعالیت کاهش‌یافته به شکل لیگاسیون عصب پنچم کمری در این تحقیق می‌باشد.
نمودار شماره 2: تغییرات درد نوروپاتیک (آلودانیای مکانیکی)، * اختلاف معنی‌داری نسبت به گروه کنترل.
به‌علاوه، پس از 6 هفته فعالیت کاهش‌یافته به شکل لیگاسیون عصب پنجم کمری، نتایج تجزیه و تحلیل Real-Time PCR جهت سنجش میزان بیان ژن GSK-3β حاکی از افزایش معنی‌دار بیان این ژن درگروه SNL نسبت به گروه کنترل بود (05/0p≤) (نمودار شماره 3).
نمودار شماره 3: تغییرات بیان ژن GSK-3β، *اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل.
بحث
در پژوهش حاضر، آزمون آلودنیای مکانیکی و هایپرآلژزیای حرارتی، در اثر لیگاتوربندی یا همان مدل SNL منجر به ظهور درد نوروپایتک گردید، از عوامل آن می‌توان به آتروفی آکسونی (10) و تارعصبی (12) در پی بستن عصب نخاع نام برد که از اوایل دوره در آزمودنی‌ها احتمالاً رخ داده بود. بنابراین، می‌توان گفت فعالیت کاهش‌یافته و افزایش‌یافته به نوعی دارای دو اثر متضاد بر عملکرد نورونی هستند. در همین راستا، Sharma و همکاران گزارش کردند 3 هفته تمرین هوازی ملایم بر روی نوارگردان می‌تواند پردردی مکانیکی را بهبود بخشد (13). همچنین Rahmati و همکاران، بهبود درد نوروپاتیک را در آزمون‌های رفتاری در پی یک دوره تمرین استقامتی در رت‌های نر ویستار نشان دادند (14). تمامی این موارد بیانگر آن است که فعالیت افزایش‌یافته به شکل تمرین ورزشی بر بهبود درد نوروپاتیک مؤثر می‌باشد که عکس موارد نام‌برده‌شده در فعالیت کاهش‌یافته در ظهور درد نوروپاتیک است، لذا نتایج پژوهش حاضر می‌تواند نتایج ارزشمندی را در اهمیت فعالیت ورزشی در بهبود درد نوروپاتیک نشان دهد؛ زیرا درد نوروپاتی یکی از بیماری‌های تخریب عصب بوده که با اختلالات عملکردی در سیستم عصبی مرکزی و محیطی همراه است (1) و علاوه بر آن، موجب کاهش سطح فعالیت جسمانی و حرکتی افراد مبتلا به این بیماری می‌شود (10).
مطالعات در سال‌های اخیر نشان داده است GSK-3β بهعنوان یک اندوژن مهم در تنظیم فعالیت گلیال و تولید سایتوکاین‌های پیش‌التهابی در سیستم عصبی، بیانگر نقش آن در پاتوژنر درد می‌باشد (15،16). مشاهده شده است در نمونه‌های موش، بازداری از فعالیت GSK-3β توسط مداخلات دارویی منجر به پاسخ درد خفیف ایجادشده با اسید استیک و یا تزریق فرمالین می‌شود (17). در پژوهش حاضر، همان‌طورکه انتظار می‌رفت مشخص گردید ظهور درد نوروپاتیکی در گروه SNL در آزمون‌های رفتاری همسو با افزایش پاتولوژیکی بیان ژن GSK-3β بوده است که با توجه به مبانی نظری فوق مبنی بر عدم تعادل در کارکرد GSK-3β و پیامدهای آن، ازجمله بروز درد نوروپاتیک، منجر به ظهور درد نوروپاتیک در گروه آزمودنی مورد نظر شد.
GSK-3β آنزیم منحصر به‌فرد و چندکاره‌ای است که در فرآیندهای بی‌شمار سلولی درگیر است. جدای از نقش متابولیسمی آن، GSK-3β در پیام‌رسانی بقا، توسعه نورون، گسترش دندریتی و شکل‌پذیری سیناپسی نیز مشارکت می‌کند (11). در سلول‌های عصبی،GSK-3β از اهمیت زیادی برخوردار است؛ زیرا در صورت وجود نقص در تنظیم سطوح و فعالیت آن، شاهد توسعه بیماری‌هایی نظیر دیابت ملیتوس، آلزایمر، سرطان، التهاب (12،13) و دیگر اختلالات عصب حرکتی نظیر اسکلوروزیس جانبی آمیوتروفیک (Amyotrophic Lateral Sclerosis) (ALS) خواهیم بود (14). همچنین ارتباط زیادی بین سطوح GSK-3β و فعالیت افزایش‌یافته با اختلالات سیستم عصبی وجود دارد (5). ظاهرا GSK-3β با وقایعی همچون دینامیک میکروتوبول، دیستروفی آکسون و دیگر وقایع مرتبط با تخریب عصب درگیر است (15). مطالعات نشان می‌دهند با مهار فعالیت GSK-3β می‌توان به یک استراتژی درمانی قابل‌قبول در مبارزه با بیماری آلزایمر دست یافت (14،16). همچنین گزارش شده است مهار GSK-3β سبب کاهش شدت و میزان بیماری ALS می‌شود (17). همسو با تحقیقات انجام‌شده، در مطالعه حاضر مشاهده گردید درد نوروپاتی و فعالیت کاهش‌یافته با افزایش بیان ژن GSK-3β همراه است. از سوی دیگر، بهعنوان یک روش درمانی غیردارویی ممکن است فعالیت افزایش‌یافته به شکل تمرینات ورزشی بتواند از میزان افزایش‌یافته GSK-3β و اختلالات حاصل ازآن در حالت درد نوروپاتی جلوگیری کند. همچنین مشخص نیست فعالیت کاهش یا افزایش‌یافته با چه سازوکاری بتوانند سبب تغییر فعالیت و سطوح GSK-3β در سیستم عصبی شوند. درک این پدیده موضوعی جالب برای تحقیقات آینده به‌نظر می‌رسد.
نتیجه‌گیری
با توجه به نتایج پژوهش حاضر مشخص گردید در سطوح سلولی با افزایش پاتولوژیکی، بیان ژن GSK-3β بهعنوان یک عامل کلیدی و تنظیم‌کننده در نورون‌ها و کارکرد آن‌ها، این افزایش منجر به تسریع عوارض مخرب در پی یک دوره فعالیت کاهش‌یافته با مدل SNL می‌شود که در این مطالعه فواید فعالیت افزایش‌یافته (ورزشی) بیش از پیش مشخص شد. در واقع، می‌توان نتیجه گرفت فعالیت کاهش‌یافته و افزایش‌یافته در دو سوی میدان با تغییرات در سطوح سلولی و آنزیمی نورون‌ها می‌توانند منجر به ظهور شرایط تخریب عصبی، آپوپتوز،آتروفی عصبی و یا منجر به بهبود رشد و جوانه‌زنی نورونی در شبکه نورونی و جلوگیری از روند آپوپتوز و آتروفی عصبی شوند که اهمیت فعالیت بدنی را بیش از پیش نمایان می‌سازد.
References:
درد نوروپاتیک، شکلی از درد مزمن است که به‌صورت درد ناشی از آسیب یا بیماری سیستم حسی - پیکری تعریف شده و به شکل آلوداینیا، پردردی و درد خودبه‌خود مشاهده می‌شود (1). درد نوروپاتیک علاوه بر تغییر سیستم عصبی، موجب کاهش سطح فعالیت‌های جسمانی و روزانه می‌شود. این درد ممکن است به‌صورت مستقیم و غیرمستقیم بر ساختار و عملکرد سلول‌های عصبی از طریق کاهش قابلیت سنتز پروتئین تأثیر بگذارد (2). در شرایط پاتولوژیکی نظیر درد نوروپاتی، تخریب عصبی از نوزایش عصبی پیشی می‌گیرد. علاوه بر تغییر سیستم عصبی، درد نوروپاتیک موجب کاهش سطح فعالیت جسمانی و آمادگی حرکتی نیز می‌شود (2،3). از این‌رو این بیماران در خطر فقر حرکتی و عوارض ناشی از آن مانند چاقی قرار دارند که خود آن‌ها نیز می‌توانند سبب وخیم‌ترکردن بیماری و کاهش بیشتر فعالیت بدنی شود. در این راستا، مطالعات بسیاری نشان می‌دهند اختلالات پروتئین کینازهای عصبی، یکی از کاندیدهای سازوکارهای بیماری‌های عصبی می‌باشند (4). گلیکوژن سنتاز کیناز-3 بتا (GSK-3β)، یکی از این پروتئین‌ها می‌باشد و GSK-3β نیز یک کیناز سرین/ترئونین بوده که بهعنوان یکی از اهداف درمانی در بیماری‌های تخریب عصبی مطرح است (5).
GSK-3 از اهمیت زیادی برخوردار است؛ زیرا درصورت وجود نقص تنظیمی در مسیرهایی که GSK-3 بهعنوان یک تنظیم‌کننده عمل می‌کند، پیشرفت بیماری‌هایی نظیر دیابت، آلزایمر، اسکلروز جانبی آمیوتروفیک، پارکینسون، سرطان و دیگر اختلالات عصبی مشاهده می‌شود. همچنین مهار این آنزیم در افزایش بقای نورونی، مؤثر گزارش شده است (6).
به دلیل شرکت داشتن این آنزیم در بسیاری از فرآیندها و بیماری‌ها، GSK-3 بهعنوان یکی از اهداف درمانی و توسعه داروسازی مطرح است؛ بهعنوان مثال گزارش شده است در بیماری آلزایمر، افزایش غیرطبیعی سطوح و فعالیت GSK-3β علاوه برکاهش عملکرد شناختی با مرگ نورونی، سکته مغزی، اختلالات آکسونی و پروتئین تائو همراه است (7).
از طرفی، تغییر در سبک زندگی مانند تغذیه سالم، افزایش فعالیت بدنی و ورزش می‌تواند به میزان قابل‌ملاحظه‌ای شیوع برخی بیماری‌های عصبی و عوارض ناشی از آن را کاهش دهد (8)، به‌طوری‌که تغییرات ایجادشده در اثر تمرین ورزشی در نورون‌ها بازتابی از تغییرات ایجادشده در متابولیسم انرژی، فعالیت لیزوزومی، بیوسنتز RNA، افزایش انتقال آکسوپلاسمی استیل‌کولین و افزایش نرخ جوانه‌زنی در پی برش عصبی است. همچنین تمرینات ورزشی منظم می‌تواند شکل‌پذیری مغز، سیستم ضداکسایشی و تنظیم افزایشی نوروتروفین‌ها را ارتقا بخشد و از آپوپتوزیز سلول‌های عصبی نیز جلوگیری کند. همچنین ورزش می‌تواند بیوسنتز RNA، افزایش انتقال آکسونی و افزایش میزان جوانه‌زنی عصبی در پی برش عصبی را به همراه داشته باشد (9)
به‌طورکلی، با توجه به نقش GSK-3β در عصب سیاتیک، اختلال عملکرد و ساختار عصب سیاتیک در درد نوروپاتیک، این احتمال می‌رود که بیان GSK-3β در شرایط فعالیت کاهش‌یافته و به شکل درد نوروپاتیک و لیگاتوربندی نخاع، در عصب سیاتیک نیز دچار اختلال گردد. در پژوهش حاضر تأثیر 6 هفته فعالیت کاهش‌یافته به شکل درد نوروپاتیک بر بیان GSK-3β در عصب سیاتیک رت‌های نر ویستار دارای درد نوروپاتیک بررسی گردید.
روش بررسی
در این مطالعه تجربی، 12 سر رت صحرایی بالغ نر 10 هفته‌ای از نژاد ویستار (با محدوده وزنی 30±250 گرم) از بخش پرورش حیوانات مرکز تحقیقات رازی تهیه شد و به آزمایشگاه حیوانات دانشگاه تربیت مدرس منتقل گردید. تمامی رت‌ها در شرایط استاندارد محیطی (با میانگین دمای 3±22 درجه سانتیگراد، چرخه روشنایی - تاریکی 12:12 ساعت، رطوبت نسبی 40%) و دسترسی آزاد به آب و غذا (مخصوص موش‌ها) نگهداری شدند. در این پژوهش کلیه اصول اخلاقی کار با حیوانات مورد تأیید کمیته اخلاق دانشگاه تربیت مدرس، در طول انجام تحقیق رعایت گردید.
پس از 2 هفته آشناسازی و سازگاری حیوانات با محیط جدید، پروتکل‌های آزمایشی و تمرینی آغاز گردید. جهت لیگاسیون ابتدا رت‌ها با سدیم پنتوباربیتول (دوز 60 میلی‌گرم در هر کیلوگرم) به‌صورت درون صفاقی بیهوش شدند، سپس عصب پنجم کمری نخاعی آن‌ها براساس روش Kim و Chang به‌طور محکم گره زده شد (7). به‌طور خلاصه، عضلات بین‌مهره‌ای در سطح مهره 4 کمری و 2 خاجی را جدا و زائده عرضی ششمین مهره کمری برداشته شد. عصب پنجم کمری سمت چپ نخاع، مشخص و با ظرافت از اعصاب مجاور جدا گردید. سپس عصب پنجم کمری به‌طور محکم با استفاده از نخ مخصوص، دقیقاً در انتهای دیستال جهت اطمینان از ایجاد اختلال در تمام فیبرها گره زده شد. همچنین، جهت اجتناب از آسیب به عصب چهارم کمری، دقت بالایی مبذول گردید. در گروه کنترل نیز فرآیند جراحی مشابهی بجز آسیب و لیگاسیون عصب پنجم کمری انجام شد. تنها حیواناتی در ادامه آزمایش لحاظ شدند که درد نوروپاتی را در آزمون‌های رفتاری نشان داده بودند. سپس رت‌ها به 2 گروه 6 تایی شامل: گروه کنترل سالم (C) و گروه درد نوروپاتی (SNL) تقسیم شدند. پس از 6 هفته، رت‌ها جهت استخراج نمونه با تزریق درون صفاقی کتامین (90 میلی‌گرم در هر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلی‌گرم در هر کیلوگرم) بیهوش و نمونه بافت عصب سیاتیک برای تجزیه و تحلیل‌های بعدی در نیتروژن 80- قرار داده شد.
برای سنجش هایپرآلژزیا حرارتی از دستگاه Radiation Heat استفاده شد که در آن بخش میانی کف پای حیوان از میان سطح پلکسی گلاس در معرض تشعشع ثابت حرارتی قرار گرفت و زمان آستانه پس کشیدن پنجه (PWTs) محاسبه گردید. تحریکات گرمایی 3 مرتبه و با فواصل 10-5 دقیقه تکرار می‌شد. برای سنجش هایپرآلجزیا مکانیکی، مجدداً حیوان بر روی شبکه سیمی قرار داده شد و 5 بار متوالی کف پای حیوان (به فاصله 15 ثانیه و مدت یک ثانیه) با وارد نمودن نیرو به‌وسیله Pin Prick تحریک گردید. چنانچه حیوان پای خود را بلند می‌کرد، بهعنوان پاسخ مثبت و در غیر این صورت بهعنوان پاسخ منفی در نظرگرفته می‌شد. درصد پاسخ از طریق محاسبه نسبت تعداد پاسخ مثبت حیوان به کل تعداد تحرکات محاسبه گردید.
جهت سنجش آلوداینای مکانیکی، حیوان بر روی یک شبکه سیمی و در داخل یک محفظه پلکسی گلاس (به ابعاد 20×20 و ارتفاع 30 سانتی‌متر) قرار گرفت. پس از سازگاری حیوان با محیط جدید، از فیبرهای Von Frey در محدوده وزنی 60-2گرم (2-4-6-8-15-26-60) ساخت شرکت StoltingInc استفاده شد. آزمایش با سبک‌ترین فیبر شروع و درصورت عدم پاسخ، به ترتیب از فیبرهای سنگین‌تر استفاده گردید. برای ایجاد تحریک هر فیبر، سه بار متوالی (به فاصله 5 ثانیه و هربار به مدت یک ثانیه) به کف پای حیوان فشار وارد شد. چنانچه 2 بار متوالی پاسخ (بلند کردن پا توسط حیوان) مشاهده می‌شد، همان وزن فیبر بهعنوان آستانه پاسخ در نظرگرفته می‌شد. چنانچه حیوان به هیچ‌یک از فیبرها پاسخ نمی‌داد، عدد 60 بهعنوان آستانه پاسخ در تلقی می‌گردید (8).
استخراج RNA به‌وسیله QIAzol® Lysis Reagent (Qiagen، آلمان) و کلروفرم (Qiagen، آلمان) به روش دستی و طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. بدین صورت که حدود 50 میلی‌گرم بافت عصبی به‌طور جداگانه، برای استخراج RNA کل به نسبت 1 به 10 در QIAzol® LysisReagent به روش هاون‌کوبی همگن شد و به‌منظور برداشتن اجزای پروتئینی، عمل سانتریفوژ (در 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه، با دور 12000) انجام شد. سپس به نسبت 1 به 5/0 با کلروفرم مخلوط و به‌مدت 15 ثانیه، به‌شدت تکان داده شد. محصول در 4 درجه سانتیگراد (به مدت 15 دقیقه و با دور 12000) سانتریفوژ و بخش معدنی و آبی از هم جدا شدند، بخش محتوی RNA برداشته و با نسبت 1 به 5/0 با ایزوپروپانول مخلوط و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق رها شد، سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد (به مدت 10 دقیقه و با دور 12000 ) سانتریفوژ گردید. Pellet حاوی RNA در اتانول شست‌وشو و در 20 میکرولیتر آب RNas-Free حل شد. در ادمه، غلظت RNA اندازه‌گیری (Eppendorff، آلمان) و نسبت 260 به 280 بین 2-8/1 بهعنوان تلخیص مطلوب تعریف گردید. سنتز cDNA با استفاده از QuantiTectReverseTranscription kit (Qiagen، آلمان) و براساس دستورالعمل شرکت سازنده صورت گرفت.
برای اندازه‌گیری سطوح بیان mRNA GSK-3β، روش کمّی Real-Time PCR با استفاده از Primix Syber GreenII به کار برده شد (Applied Biosystems Step One، آمریکا). مخلوط واکنش در حجم نهایی 20 میکرولیتر (شامل 1 میکرولیتر cDNA، 1 میکرولیتر آغازگر جلویی، 1 میکرولیتر آغازگر برگشتی، 7 میکرولیتر آب DEPC، 10 میکرولیتر Syber Green و هر واکنش به‌صورت مضاعف انجام شد. طراحی آغازگرها براساس ژن‌های GSK-3β و
(Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase) GAPDH در بانک ژنی NCBI و توسط شرکت Qiagen (آلمان) انجام گرفت. توالی آغازگرهای مورد استفاده در جدول شماره 1 گزارش شده است؛ ضمن اینکه از GAPDH بهعنوان ژن مرجع استفاده شد. برنامه دمایی مورد استفاده در Realtime-PCR شامل: 95 درجه سانتیگراد، به مدت 10 دقیقه؛ 95 درجه سانتیگراد، به مدت 15 ثانیه؛ 60 درجه سانتیگراد، به مدت 1 دقیقه (تکرار 40 چرخه) بود. نمودارهای ذوب برای بررسی درستی داده‌ها و نمودارهای استاندارد به‌منظور بهینه‌سازی شرایط آزمایش ترسیم و بررسی شدند و بیان داده‌ها توسط نسبت بیان ژن GSK-3β به ژن مرجع محاسبه گردید. میزان بیان ژن‌های مورد نظر نیز با روش 2-∆∆CT اندازه‌گیری شد (9).
داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 16، تحلیل واریانس دو طرفه با اندازه‌گیری مکرر (جهت مقایسه آزمون‌های رفتاری در دو گروه در طول مطالعه) و آزمون تی مستقل (برای بررسی تغییرات بیان ژن)تحلیل شدند. برای انجام آزمون‌های تکمیلی، آزمون تعقیبی LSD (Least Significant Difference) به عمل آمد. سطح معنی‌داری، 05/0a= در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
در این مطالعه، لیگاسیون عصب پنجم کمری منجر به کاهش معنی‌دار زمان پس کشیدن پنجه در گروه SNL شد (05/0p≤)، و این مسئله تا پایان هفته ششم نیز ادامه یافت (نمودار شماره 1). این یافته نشان می‌دهد لیگاسیون عصب پنجم کمری پاسخ پردردی حرارتی را در گروه SNL به همراه دارد.
نمودار شماره 1: تغییرات درد نوروپاتیک (هایپرآلژزیای حرارتی)، * اختلاف معنی‌داری نسبت به گروه کنترل.
همچنین، لیگاسیون عصب پنجم کمری منجر به کاهش معنی‌دار آستانه پس‌کشیدن پنجه در گروه SNL شد (05/0p≤)، که این مسئله تا پایان هفته ششم نیز ادامه یافت (نمودار شماره 2). این یافته نشان می‌دهد لیگاسیون عصب پنجم کمری پاسخ آلودانیای مکانیکی را در گروه SNL به همراه دارد. به‌طورکلی، مشاهده پاسخ‌های پردردی حرارتی و آلودینیای مکانیکی در گروه SNL تا پایان هفته ششم، نشان‌دهنده اثبات مدل فعالیت کاهش‌یافته به شکل لیگاسیون عصب پنچم کمری در این تحقیق می‌باشد.
نمودار شماره 2: تغییرات درد نوروپاتیک (آلودانیای مکانیکی)، * اختلاف معنی‌داری نسبت به گروه کنترل.
به‌علاوه، پس از 6 هفته فعالیت کاهش‌یافته به شکل لیگاسیون عصب پنجم کمری، نتایج تجزیه و تحلیل Real-Time PCR جهت سنجش میزان بیان ژن GSK-3β حاکی از افزایش معنی‌دار بیان این ژن درگروه SNL نسبت به گروه کنترل بود (05/0p≤) (نمودار شماره 3).
نمودار شماره 3: تغییرات بیان ژن GSK-3β، *اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل.
بحث
در پژوهش حاضر، آزمون آلودنیای مکانیکی و هایپرآلژزیای حرارتی، در اثر لیگاتوربندی یا همان مدل SNL منجر به ظهور درد نوروپایتک گردید، از عوامل آن می‌توان به آتروفی آکسونی (10) و تارعصبی (12) در پی بستن عصب نخاع نام برد که از اوایل دوره در آزمودنی‌ها احتمالاً رخ داده بود. بنابراین، می‌توان گفت فعالیت کاهش‌یافته و افزایش‌یافته به نوعی دارای دو اثر متضاد بر عملکرد نورونی هستند. در همین راستا، Sharma و همکاران گزارش کردند 3 هفته تمرین هوازی ملایم بر روی نوارگردان می‌تواند پردردی مکانیکی را بهبود بخشد (13). همچنین Rahmati و همکاران، بهبود درد نوروپاتیک را در آزمون‌های رفتاری در پی یک دوره تمرین استقامتی در رت‌های نر ویستار نشان دادند (14). تمامی این موارد بیانگر آن است که فعالیت افزایش‌یافته به شکل تمرین ورزشی بر بهبود درد نوروپاتیک مؤثر می‌باشد که عکس موارد نام‌برده‌شده در فعالیت کاهش‌یافته در ظهور درد نوروپاتیک است، لذا نتایج پژوهش حاضر می‌تواند نتایج ارزشمندی را در اهمیت فعالیت ورزشی در بهبود درد نوروپاتیک نشان دهد؛ زیرا درد نوروپاتی یکی از بیماری‌های تخریب عصب بوده که با اختلالات عملکردی در سیستم عصبی مرکزی و محیطی همراه است (1) و علاوه بر آن، موجب کاهش سطح فعالیت جسمانی و حرکتی افراد مبتلا به این بیماری می‌شود (10).
مطالعات در سال‌های اخیر نشان داده است GSK-3β بهعنوان یک اندوژن مهم در تنظیم فعالیت گلیال و تولید سایتوکاین‌های پیش‌التهابی در سیستم عصبی، بیانگر نقش آن در پاتوژنر درد می‌باشد (15،16). مشاهده شده است در نمونه‌های موش، بازداری از فعالیت GSK-3β توسط مداخلات دارویی منجر به پاسخ درد خفیف ایجادشده با اسید استیک و یا تزریق فرمالین می‌شود (17). در پژوهش حاضر، همان‌طورکه انتظار می‌رفت مشخص گردید ظهور درد نوروپاتیکی در گروه SNL در آزمون‌های رفتاری همسو با افزایش پاتولوژیکی بیان ژن GSK-3β بوده است که با توجه به مبانی نظری فوق مبنی بر عدم تعادل در کارکرد GSK-3β و پیامدهای آن، ازجمله بروز درد نوروپاتیک، منجر به ظهور درد نوروپاتیک در گروه آزمودنی مورد نظر شد.
GSK-3β آنزیم منحصر به‌فرد و چندکاره‌ای است که در فرآیندهای بی‌شمار سلولی درگیر است. جدای از نقش متابولیسمی آن، GSK-3β در پیام‌رسانی بقا، توسعه نورون، گسترش دندریتی و شکل‌پذیری سیناپسی نیز مشارکت می‌کند (11). در سلول‌های عصبی،GSK-3β از اهمیت زیادی برخوردار است؛ زیرا در صورت وجود نقص در تنظیم سطوح و فعالیت آن، شاهد توسعه بیماری‌هایی نظیر دیابت ملیتوس، آلزایمر، سرطان، التهاب (12،13) و دیگر اختلالات عصب حرکتی نظیر اسکلوروزیس جانبی آمیوتروفیک (Amyotrophic Lateral Sclerosis) (ALS) خواهیم بود (14). همچنین ارتباط زیادی بین سطوح GSK-3β و فعالیت افزایش‌یافته با اختلالات سیستم عصبی وجود دارد (5). ظاهرا GSK-3β با وقایعی همچون دینامیک میکروتوبول، دیستروفی آکسون و دیگر وقایع مرتبط با تخریب عصب درگیر است (15). مطالعات نشان می‌دهند با مهار فعالیت GSK-3β می‌توان به یک استراتژی درمانی قابل‌قبول در مبارزه با بیماری آلزایمر دست یافت (14،16). همچنین گزارش شده است مهار GSK-3β سبب کاهش شدت و میزان بیماری ALS می‌شود (17). همسو با تحقیقات انجام‌شده، در مطالعه حاضر مشاهده گردید درد نوروپاتی و فعالیت کاهش‌یافته با افزایش بیان ژن GSK-3β همراه است. از سوی دیگر، بهعنوان یک روش درمانی غیردارویی ممکن است فعالیت افزایش‌یافته به شکل تمرینات ورزشی بتواند از میزان افزایش‌یافته GSK-3β و اختلالات حاصل ازآن در حالت درد نوروپاتی جلوگیری کند. همچنین مشخص نیست فعالیت کاهش یا افزایش‌یافته با چه سازوکاری بتوانند سبب تغییر فعالیت و سطوح GSK-3β در سیستم عصبی شوند. درک این پدیده موضوعی جالب برای تحقیقات آینده به‌نظر می‌رسد.
نتیجه‌گیری
با توجه به نتایج پژوهش حاضر مشخص گردید در سطوح سلولی با افزایش پاتولوژیکی، بیان ژن GSK-3β بهعنوان یک عامل کلیدی و تنظیم‌کننده در نورون‌ها و کارکرد آن‌ها، این افزایش منجر به تسریع عوارض مخرب در پی یک دوره فعالیت کاهش‌یافته با مدل SNL می‌شود که در این مطالعه فواید فعالیت افزایش‌یافته (ورزشی) بیش از پیش مشخص شد. در واقع، می‌توان نتیجه گرفت فعالیت کاهش‌یافته و افزایش‌یافته در دو سوی میدان با تغییرات در سطوح سلولی و آنزیمی نورون‌ها می‌توانند منجر به ظهور شرایط تخریب عصبی، آپوپتوز،آتروفی عصبی و یا منجر به بهبود رشد و جوانه‌زنی نورونی در شبکه نورونی و جلوگیری از روند آپوپتوز و آتروفی عصبی شوند که اهمیت فعالیت بدنی را بیش از پیش نمایان می‌سازد.
References:
- Treede RD, Jensen TS, Campbell J, Cruccu G, Dostrovsky J, Griffin J, et al. Neuropathic pain redefinition and a grading system for clinical and research purposes. Neurology 2008;70(18):1630-5. PubMed
- Barkin RL, Barkin SJ, Barkin DS. Perception, assessment, treatment, and management of pain in the elderly. Clin Geriatr Med 2005;21(3):465-90. PubMed
- van den Berg-Emons RJ, Schasfoort FC, de Vos LA, Bussmann JB, Stam HJ. Impact of chronic pain on everyday physical activity. Eur J Pain 2007;11(5):587-93. PubMed
- Wang LH, Besirli CG, Johnson Jr EM. Mixed-lineage kinases: a target for the prevention of neurodegeneration. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2004;44:451-74. PubMed
- Bhat RV, Budd Haeberlein SL, Avila J. Glycogen synthase kinase 3: A drug target for CNS therapies. J Neurochem 2004;89(6):1313-7. PubMed
- Hooper C, Killick R, Lovestone S. The GSK3 hypothesis of Alzheimer’s disease. J Neurochem 2008;104(6):1433-9. PubMed
- Kim S, Chung J. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain 1992;50(3):355-63. PubMed
- Cruccu G, Sommer C, Anand P, Attal N, Baron R, Garcia-Larrea L, et al. EFNS guidelines on neuropathic pain assessment. Eur J Neurol 2010;17(8):1010-8. PubMed
- Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic Acids Res 2001;29(9):e45. PubMed
- Zaza C, Baine N. Cancer pain and psychosocial factors: a critical review of the literature. J Pain Symptom Manage 2002;24(5):526-42. PubMed
- Bradley CA, Peineau S, Taghibiglou C, Nicolas CS, Whitcomb DJ, Bortolotto ZA, et al. A pivotal role of GSK-3 in synaptic plasticity. Front Mol Neurosci 2012 15;5:13. PubMed
- Centeno C, Repici M, Chatton J, Riederer B, Bonny C, Nicod P, et al. Role of the JNK pathway in NMDA-mediated excitotoxicity of cortical neurons. Cell Death Differ 2007;14(2):240-53. PubMed
- Martinez A, Castro A, Dorronsoro I, Alonso M. Glycogen synthase kinase 3 (GSK‐3) inhibitors as new promising drugs for diabetes, neurodegeneration, cancer, and inflammation. Med Res Rev 2002;22(4):373-84. PubMed
- Rahmati M, Gharakhanlou R, Movahedin M, Mowla SJ, Khazani A, Fouladvand M, Jahani Golbar S. Treadmill training modifies KIF5B motor protein in the STZ-induced diabetic rat spinal cord and sciatic nerve. Arch Iran Med. 2015;18 (2) 94–101. PubMed
- Kaytor MD, Orr HT. The GSK-3β signaling cascade and neurodegenerative disease. Curr Opin Neurobiol 2002;12(3):275-8. PubMed
- Aschenbach WG, Ho RC, Sakamoto K, Fujii N, Li Y, Kim YB, et al. Regulation of dishevelled and β-catenin in rat skeletal muscle: an alternative exercise-induced GSK-3β signaling pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab 2006;291(1):E152-8. PubMed
- Chen G, Huang LD, Jiang YM, Manji HK. The mood stabilizing agent valproate inhibits the activity of glycogen synthase kinase‐3. J neurochem 1999;72(3):1327-30. PubMed
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
فیزیولوژی ورزشی
دریافت: 1395/3/11 | پذیرش: 1395/10/20 | انتشار: 1397/1/26
دریافت: 1395/3/11 | پذیرش: 1395/10/20 | انتشار: 1397/1/26
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
