مقدمه
گیاهان دارویی جزء منابع بالقوه‌ای هستند که از نظر طب سنتی حایز اهمیت بوده و از دیر‌باز خواص درمانی و دارویی آن‌ها مورد توجه محققین بوده است (1). در واقع، گیاهان دارویی مخازن غنی از متابولیت‌های ثانویه و مؤثره دارویی هستند که کمتر از 1% وزن خشک گیاه را تشکیل می‌دهند، یکی از این ترکیبات دارای خواص دارویی، اسانس‌های گیاهی می‌باشد (2،3). اسانس گیاهان دارویی، ترکیبات فرّار و معطری هستند که در اندام‌های مختلف گیاه وجود دارند و یکی از نقش‌های آن محافظت از گیاه در برابر عفونت‌های میکروبی است (4،5). دلیل اصلی تشکیل اسانس‌ها به‌خوبی مشخص نیست، ولی این ترکیبات به‌طورکلی بازمانده‌های ناشی از فرآیندهای اصلی متابولیسم گیاهان بوده که تحت تأثیر تنش‌ها می‌باشند و از نظر شیمیایی همگن نبوده و به‌اشکال مختلف اغلب با منشأ ترپنی مشاهده می‌شوند (6،7). سالیان درازی است که خواص ضدمیکروبی و ضدسرطانی اسانس‌ها در حال بررسی است، همچنین تمایل محققان طی این سال‌ها جهت شناسایی ترکیبات سازنده اسانس‌های گیاهی و اثرات بیولوژیکی آن‌ها مانند اثرات ضدسرطانی بیشتر شده است (8،9). مطالعات نشان می‌دهد سرطان عامل اصلی مرگ‌و‌میر در کشورهای پیشرفته است و تا چندسال آینده تخمین زده می‌شود میزان شیوع آن به چند برابر برسد (10). سرطان کولون به رشد بیش از حد سلول‌های روده بزرگ گفته می‌شود که ممکن است به بافت‌های دیگر هم متاستاز دهد. مطالعات اپیدمیولوژیک نشان داده است سرطان کولون سالانه باعث مرگ بسیاری از افراد در کل جهان می‌شود و این نوع سرطان در مردان پس از سرطان ریه به‌عنوان شایع‌ترین نوع سرطان شناخته شده است (11،12). به‌منظور درمان سرطان از روش‌هایی مانند جراحی، پرتودرمانی و شیمی‌درمانی استفاده می‌شود؛ درحالی‌که این نوع سرطان به اکثر داروها مقاوم بوده و درمان آن با موفقیت چندانی همراه نبوده است (13). یکی از روش‌هایی که اخیراً مطالعات زیادی بر روی آن‌ها انجام شده، استفاده از گیاهان و اسانس‌های آن‌ها برای درمان سرطان است، محققان نیز در حال یافتن ترکیبات دارویی با منشأ گیاهی بدون اثرات جانبی هستند (14). همچنین از نقطه نظر بالینی، استفاده بی‌رویه از آنتی‌بیوتیک‌ها جهت درمان بیماری‌های باکتریایی منجر به پیدایش ایزوله‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک شده که هر روز بر تعداد آن‌ها افزوده می‌شود (15). پیدایش سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک، تلاش برای یافتن به عوامل ضد‌میکروبی جدید را ضروری می‌کند. به‌منظور دستیابی به ترکیبات ضدمیکروبی جدید، از ترکیبات طبیعی مانند اسانس گیاهان دارویی استفاده می‌شود. هزینه پایین تولید و عدم بروز مشکلات زیست‌محیطی ازجمله مزایایی است که گیاهان دارویی را به‌عنوان یکی از کاندیداهای مناسب برای مهار سویه‌های باکتریایی معرفی کرده است (16). گیاه گل بی‌مرگ یا Helichrysum artemisiodes از گیاهان بومی کشور ایران در استان مرکزی بوده و از خانواده آستراسه است. این گیاه علفی چندساله با ارتفاع 40-15 سانتی‌متر، در ماه‌های خرداد تا مرداد به گل‌دهی می‌رسد. این گیاه منبع با ارزشی از ترکیبات ثانویه بوده که از آن می‌توان جهت درمان سنگ کلیه، اختلالات ادراری، دل درد، یرقان، اسهال و تنگی‌نفس استفاده کرد (17،18). تاکنون مطالعه‌ای در زمینه بررسی ترکیبات شیمیایی، اثرات بیولوژیک اسانس گیاه H. artemisiodes انجام نشده است. بنابراین، این مطالعه با هدف بررسی ترکیبات شیمیایی تشکیل‌دهنده اسانس گیاه H. artemisiodes، اثرات ضدباکتریایی، سمّیت سلولی و آپوپتوز بر روی رده سلول سرطانی روده بزرگ (HT29)، همچنین آنالیز بیان ژن‌های آپوپتوزی Bax و Bcl2 در سلول‌های HT29 انجام شد.
 
روش بررسی
در این مطالعه تجربی، ابتدا گیاه H. artemisiodes از مرکز ذخایر زیستی ایران تهیه گردید، سپس مواد گیاهی جمع‌آوری‌شده پس از تمیز شدن، در سایه خشک، به‌وسیله آسیاب پودر و در شرایط بهینه و مناسب نگهداری شدند. جهت استخراج اسانس گیاه، از روش تقطیر با آب و دستگاه اسانس‌گیری کلونجر استفاده شد؛ بدین ترتیب که ابتدا 100 گرم از برگ خشک گیاه خرد و به بالن 2 لیتری کلونجر منتقل گردید و مقدار 1 لیتر آب مقطر به آن اضافه شد. عملیات اسانس‌گیری به‌مدت 4 ساعت ادامه یافت. در خلال عملیات، اسانس گیاه به‌علت فرّار بودن همراه بخارآب تقطیر و در لوله جمع‌آوری‌کننده کلونجر، جمع‌آوری شد. باتوجه به اینکه چگالی اسانس از چگالی آب کمتر است؛ بنابراین اسانس استخراج‌شده روی فاز آبی قرار گرفت و به‌راحتی به‌وسیله شیر تخلیه جداسازی شد. عمل آبگیری از اسانس حاصل با سولفات سدیم بدون آب (Na₂SO₄) انجام گرفت. از آنجایی‌که اسانس‌ها نسبت به نور، اکسیژن و دما حساسند و در چنین شرایطی ترکیبات آن‌ها دچار تغییر و تحول می‌‌شود؛ لذا بلافاصله اسانس استخراج‌شده به یک شیشه تیره دربسته منتقل و تا مراحل بعدی کار در یخچال نگهداری شد. به‌منظور جداسازی و شناسایی ترکیبات فیتوشیمیایی عصاره گیاه H. artemisiodes، از دستگاه کروماتوگرافی گازی متصل‌شده به طیف‌سنج جرمی GC/MS (مدل Agilent 6890، ساخت کشور آمریکا) استفاده گردید. طول ستون 30 متر و قطر داخلی 25/0 میلی‌متر بود و برای ردیابی از سامانه پونیزاسیون الکترونی با انرژی eV70 استفاده شد. برنامه حرارتی دستگاه به این صورت بود که دما از 50 درجه سانتیگراد شروع و تا 250 درجه سانتیگراد ادامه پیدا می‌کرد. از حامل هلیوم 99/99%، مقدار تزریق 1 میکرولیتر و سرعت جریان گاز 15 میلی‌لیتر در دقیقه تنظیم شده بود. حجم 1 میکرولیتر از اسانس گیاه به دستگاه GC/MS تزریق شد، سپس نتایج به‌دست‌آمده از دستگاه، براساس اندیس کواتس و مراجعه به فرهنگ طبیعی ترکیبات طبیعی شناسایی گردید. برای شناسایی و تعیین مقدار ترکیبات فیتوشیمیایی عصاره گیاه H. artemisiodes، از سطح زیر پیک GC/MS و اطلاعات موجود در بانک اطلاعاتی (National Institute Standard and Technology) NIST استفاده شد.
در این مرحله، خاصیت ضدمیکروبی اسانس با روش حداقل غلظت مهاری (MIC) بررسی گردید. MIC به کمترین غلظت از ترکیبات که رشد میکروارگانیسم را مهار می‌کند، اطلاق می‌‌شود. در این مطالعه، از باکتری‌های Listeria monocytogenes ATCC 35152، Staphylococcus aureus ATCC 29213، Salmonella typhimurium ATCC 14028 و Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 استفاده شد. بدین منظور، ابتدا باکتری‌های مدنظر در محیط کشت مایع (به‌مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد) انکوبه و در پی آن با استفاده لوله 5/0 مک‌فارلند رقیق شدند. سپس رقت‌های متوالی از اسانس گیاه H. artemisiodes در محدوده غلظت از 500-9/3 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر (9/3، 8/7، 62/15، 25/31، 5/62، 125، 250، 500) تهیه گردید. بعد از آن، پلیت‌های 96 خانه‌ای به کمک توزیع 95 میکرولیتر از محیط مولرهینتون براث، 5 میکرولیتر از تلقیح میکروبی و 100 میکرولیتر از اسانس با غلظت‌های مختلف مورد استفاده قرار گرفتند. چاهک آخر شامل 95 میکرولیتر محیط مولر هینتون براث با 5 میکرولیتر از باکتری‌های منتخب در هر ردیف به‌منزله نمونه شاهد در نظر گرفته شد. محتویات هر چاهک روی شیکر (به‌مدت 60 ثانیه با دور rpm 100) مخلوط شد، سپس در دمای 37 درجه به‌مدت 24 ساعت انکوبه شدند. بعد از این مدت، میزان رشد میکروبی با میزان جذب در طول موج 620 نانومترخوانده و میزان MIC تعیین گردید.
سلول‌های رده سلولی سرطان کولون (HT29 cell line) و نرمال L929 از بخش کشت سلولی انستیتوپاستور ایران به‌صورت فلاسک تهیه گردید و در محیط کشت RPMI₁₆₄₀ (Biosera, USA) با 3/7 =pH کشت داده شد. لازم به ذکر است محیط کشت RPMI₁₆₄₀ با نسبت 200 میکروگرم برمیلی‌لیتر پنی‌سیلین G، استرپتومایسین و 10% سرم جنین گاوی (Fetal Bovine Serum: FBS) غنی شده بود.
به‌منظور انجام تست سمّیت سلولی اسانس گیاه H. artemisiodes، روش MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) به کار برده شد. به‌طور خلاصه، تعداد 5 هزار سلول در هر چاهک 96تایی پلیت سلولی اضافه شد و غلظت‌های 78/0، 56/1، 125/3، 25/6، 12، 25، 50 و 100 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر از اسانس در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت بر روی رده سلولی سرطانی کولون (HT29) و نرمال L929 افزوده شد. بعد از گذشت مدت زمان مورد نظر، محلول رویی محیط کشت دور ریخته شد و سلول‌ها با رنگ MTT (محلول 5/0 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر در PBS) به‌مدت 4 ساعت تحت شرایط دی‌اکسیدکربن 5% و دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از محلول‌سازی فرمازان با 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید، جذب نوری در طول‌موج 570 نانومتر به‌وسیله دستگاه قرائت‌خوان الایزا (ELISA reader, Oraganon Teknika، ساخت هلند) خوانده شد.
سپس رنگ MTT، جداسازی و کریستال‌های فورمازان تولیدشده باسلول‌های زنده در ایزوپروپانول حل شدند. در نهایت، میزان کشندگی سلول به‌کمک فرمول زیر محاسبه گردید.
100´(جذب نوری سلول‌های کنترل/جذب نوری سلول‌های تیمار شده)= میزان بقای سلولی
همچنین میزان دوز 50% کشندگی (IC₅₀ Half maximal inhibitory concentration,) نیز محاسبه شد.
به‌منظور بررسی میزان بیان ژن‌های آپوپتوزی Bax و Bcl2 در سطح mRNA، از روش Real Time PCR استفاده گردید؛ بدین ترتیب که ابتدا کل RNA سلول‌های تحت تیمار و غیرتیمار با عصاره، با کیت استخراج RNA (کیاژن، امریکا، طبق دستورالعمل آن)، استخراج شدند، سپس غلظت آن به‌وسیله دستگاه نانودراپ (IMPLEN GmbH، ساخت آلمان) تعیین گردید. در پی آن، برای سنتز cDNA از مولکول‌های RNA استخراج‌شده، از کیت Revert AidTM First strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas، لیتوانی) بدین ترتیب: 5 میکرولیتر بافر x5، یک میکروگرم RNA، 5/0 میکرولیتر پرایمرهای Random hexamer، 5/0 میکرولیتر از پرایمر Oligo dT، 2 میکرولیتر dNTPs، 1 میکرولیتر RNase inhibitor، 1 میکرولیتر Reverse Transcriptase (20 واحد برمیکرولیتر) و آب مقطر 2 بار تقطیر (تا حجم نهایی 20 میکرولیتر) استفاده گردید. در سنتز cDNA، از برنامه دمایی 5 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد، 60 دقیقه در دمای 42 درجه سانتیگراد، 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد و 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد استفاده شد. پرایمرهای مورد استفاده برای ژن‌های هدف Bax، Bcl2 بود و ژن GAPDH به‌عنوان کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. توالی آغازگرهای رفت و برگشتی ژن هدف Bax به‌صورت 5'- TTGCTTCAGGGTTTCATCCAG -3' و 5'- AGCTTCTTGGTGGACGCATC -3' بودند. همچنین توالی آغازگرهای رفت‌وبرگشت ژن هدف Bcl2 به‌صورت 5'- TGTGGATGACTGAGTACCTGAACC -3' و 5'- CAGCCAGGAGAAATCAAACAGAG -3' و برای ژن مرجع GAPDH به‌صورت 5'-CGTCTGCCCTATCAACTTTCG-3' رفت، و 5'-CGTTTCTCAGGCTCCCTCT-3' برگشتی بود. در نهایت برای بررسی بیان ژن‌ها، روش Real Time PCR (Bioneer، کره) به کار برده شد (26).
نتایج حاصل در این مطالعه با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 20 و آنالیز واریانس (با اندازه‌گیری‌های مکرر) تحلیل شدند. سطح معنی‌داری،
 (05/0p<) در نظر گرفته شد. تمامی تست‌ها به‌صورت 3 بار تکرار انجام گرفت.
 
یافته‌ها
آنالیز کروماتوگرام GC-MS اسانس گیاه H. artemisiodes، 55 پیک را نشان داد که بیانگر وجود ترکیبات فیتو‌شیمیایی موجود در گیاه بود. با مقایسه طیف‌ها با اطلاعات کتابخانه NIST، 55 ترکیب شیمیایی شناسایی گردید. از میان ترکیبات شناسایی‌شده، (12/585%) Carvacrol و
 (12/5%) 1R-α-Pinene دارای بیشترین درصد مواد تشکیل‌دهنده بودند.
نتایج حاصل از بررسی میزان اثرات ضدباکتریایی اسانس علیه باکتری‌های L. monocytogenes، S. aureus، S. typhimurium  و P. aeroginosa نشان داد این اسانس، بیشترین تأثیر را روی باکتری‌های گرم مثبت (S. aureus و L. monocytogenes ) و کمترین را بر روی دو باکتری دیگر که گرم منفی بوده‌اند، داشته است (جدول شماره 1).
جدول شماره 1. نتایج MIC اسانس گیاه H. artemisiodes در سویه‌های باکتریایی منتخب.

نام باکتری	MIC (میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر)
سالمونلا تیفی موریوم	5/62
سودوموناس آئروژینوزا	62/15
استافیلوکوکوس اورئوس	8/7
لیستریا مونوسیتوژنز	8/7

 
بررسی میزان سمّیت سلولی اسانس با استفاده از روش MTT در غلظت‌های 78/0، 56/1، 125/3، 25/6، 12، 25، 50 و 100 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر بر روی رده سلولی HT29 انجام گرفت و داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 16و آزمون آنالیز واریانس با اندازه‌گیری‌های مکرر آنالیز شدند. نتایج حاصل از مقایسه تست سمّیت سلولی بین غلظت‌های مختلف اسانس در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت در رده سلولی HT29 نشان داد اسانس در مدت زمان 72 ساعت و غلظت 100 میلی‌گرم بیشترین تأثیر سمّیت سلولی را داشته (0001/0p<) و در مقابل، در مدت زمان 24 ساعت و غلظت 78/0 میلی‌گرم، کمترین تأثیر را بر روی سلول‌ها داشته است که از لحاظ آماری در مقایسه با گروه کنترل معنی‌دار نبود (05/0 P>) (فارسی شود). همچنین میزان IC50 این اسانس در مدت زمان 24، 48 و 72 ساعت به ترتیب برابر با 5/31، 08/6 و 9/2 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر بود. با مقایسه این نتایج می‌توان نتیجه گرفت بیشترین میزان سمّیت سلولی اسانس مربوط به غلظت 100 میلی‌گرم در زمان 72 ساعت بوده و کمترین تأثیر بر روی سلول را این اسانس در زمان 24 ساعت داشته است (جدول شماره 2).
جدول شماره 2. اثر غلظت‌های مختلف اسانس گیاه H. artemisiodes بر روی رده سلولی HT29.

زمان ساعت	78/0 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	56/1 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	125/3 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	25/6 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	12 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	25 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	50 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	100 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر
24	2/0±5/94	5/0±89	7/0±80	4/0±5/68	* 3/0±5/60	** 2/0±7/53	** 5/0±5/40	4/0±75/32 ***
48	6/0±3/85 *	4/0±5/72 *	5/0±5/66 **	5/0±5/50 **	3/0±5/39 ***	3/0±31 ***	3/0±7/20 ***	2/0±75/16 ***
72	4 /0±2/73*	2/0±5/59 **	3/0±2/51 **	3/0±5/41 ***	5/0±5/29 ***	4/0±23 ***	2/0±8/10 ***	1/0±7/1 ***

نتایج به‌صورت درصد بقا در مقایسه با نمونه‌های کنترل و به صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش شد.
 05/0>p معنی‌دار در نظر گرفته شد. (*:05/0­p<، **:01/0(p<، *** 001/0p<).
 
تیمار سلول‌های نرمال L929 با غلظت‌های مختلف اسانس 78/0، 56/1، 125/3، 25/6، 12، 25، 50 و 100 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر با استفاده از تست MTT طی مدت زمان 24، 48 و 72 ساعت انجام شد. همچنین اسانس در غلظت 100 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر، بیشترین مهار تکثیر سلولی را داشت و اختلاف فاحشی با گروه کنترل نشان داد که از لحاظ آماری معنی‌دار بود (001/0P<). درحالی‌که در غلظت‌های کمتر از 5/12 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی‌داری را نشان نداد و از نظر آماری معنی‌دار نبود (05/0P>) (جدول شماره 3). لازم به ذکر است میزان IC50 این اسانس در رده سلولی L929 در مدت زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت به ترتیب برابر با 225، 186 و 157 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر بود.
 
 
 
 
 
 
 
جدول شماره 3: اثر غلظت‌های مختلف اسانس گیاه H. artemisiodes بر روی رده سلولی L929.

زمان ساعت	78/0 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	56/1 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	125/3 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	25/6 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	12 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	25 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	50 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر	100 میلی‌گرم برمیلی‌لیتر
24	2/0±2/97	2/0±94	3/0±2/92	4/0± 7/91	3/1±88	7/0±7/81	5/0±74	6/0±7/63 **
48	8 /0±3/98	1/1±2/93	6/0±2/91	9/0±90	9/0±87	8/0±7/78	6/0±5/70	7/0±59 **
72	9/0±95	9/0±7/88	7/0±2/86	8/0±5/84	5/0±81	7/0±2/74	5/0±65 *	6/0±54 **

نتایج به صورت درصد بقا در مقایسه با نمونه‌های کنترل و به صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش شد
. 05/0>p معنی‌دار در نظر گرفته شد. (*:05/0p<، **:01/0> (p، *** 001/0p<).
 
بررسی میزان القای بیان ژن‌های آپوپتوزی Bax و Bcl2 در سلول‌های سرطانی کولون (HT29) تیمارشده با غلظت IC50 اسانس با استفاده از روش Real Time PCR بعد از 24 ساعت ارزیابی شد. نتایج Real Time PCR نشان داد ژن‌های Bax و Bcl2 نسبت به ژن مرجع در رده سلولی سرطانی کولون تیمار‌شده طی 24 ساعت به میزان 2/0±9/2 (05/0p<) افزایش و 7/0±2/0 (05/0p<) کاهش داشته‌اند (نمودار).

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
نمودار: میزان بیان ژن‌های Bax و Bcl2 نسبت به ژن کنترل (GAPDH).
نسبت بیان ژن‌های Bax و Bcl2 به ژن کنترل در رده سلولی سرطانی کولون تیمارشده طی 24 ساعت به میزان 2/0±9/2 (05/0p<) افزایش و 7/0± 2/0 (05/0p<) کاهش یافته است.
 
بحث
از نقطه‌نظر طب سنتی، استفاده از عصاره‌ و اسانس‌های گیاهی جهت درمان عفونت‌های باکتریایی و سرطانی، همچنین شناسایی ترکیبات تشکیل‌دهنده آن‌ها از دیرباز حایز اهمیت بوده و انجام مطالعات اخیر در جهت جایگزین‌کردن ترکیبات طبیعی به جای داروهای شیمیایی جهت درمان بیماری‌ها می‌باشد (19). در این مطالعه یکی از گیاهان بومی کشور ایران به‌نام H. artemisiodes جهت بررسی ترکیبات شیمیایی تشکیل‌دهنده آن مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آنالیز شیمیایی اسانس این گیاه به‌وسیله روش GC-MS، 55 ترکیب را نشان داد که از میان ترکیبات شناسایی‌شده، دو ترکیب (12/585%) Carvacrol و
 (12/5%) 1R-α-Pinene دارای بیشترین درصد مواد تشکیل‌دهنده اسانس بودند. Carvacrol یک ترکیب شیمیایی با جرم مولی
 217/150 گرم برمول، از خانواده ترکیبات فنولی و مونوترپنی می‌باشد. این ترکیب به‌عنوان جزء مهم ترکیب موجود در اسانس‌های برخی از گیاهان خانواده آستراسه، دارای خاصیت ضدباکتریایی است (20). 1R-α-Pinene نیز از ترکیبات شیمیایی مهم اسانس‌های گیاهی به فرمول C₁₀H₁₆ است. مطالعات نشان می‌دهد این ترکیب دارای طیف میکروب‌کشی وسیعی است (21). مطالعات مختلفی در زمینه بررسی ترکیبات شیمیایی جنس Helichrysum انجام شده است. Javidnia و همکاران ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه Helichrysum leucocephalum Boiss. را با روش GC-MS شناسایی کردند. نتایج این مطالعه نشان داد 22/3%)) Rosifoliol، (10/1%) β-caryophyllene و 9%)) α-humulene بیشتر ترکیب تشکیل‌دهنده اسانس بوده‌اند (22). Mastelić  و همکاران ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه H. italicum را با روش GC-MS شناسایی کردند. نتایج این مطالعه نشان داد
 (12/8%) alpha-pinen و ) (11/1% 2-methyl-cyclohexyl pentanoate، بیشترین ترکیب موجود در اسانس این گیاه بوده‌اند (23). با توجه به نتایج این پژوهش و سایر مطالعات به‌نظر می‌رسد یکی از دلایل تفاوت ترکیبات شیمیایی اسانس‌های گیاه یک جنس می‌تواند به‌علت نوع منطقه جغرافیایی و محل رشد این گیاه باشد. یکی دیگر از اهداف این مطالعه بررسی خواص ضدباکتریایی اسانس گیاه H. artemisiodes بر روی برخی از باکتری‌های پاتوژن بود. در مطالعه حاضر اسانس گیاه مدنظر، بیشترین تأثیر را بر روی باکتری‌های گرم مثبت داشت. با توجه به تعداد ترکیبات شیمیایی شناسایی‌شده در این گیاه، نمی‌توان مکانیسم واحدی برای اثرات ضدباکتریایی آن در نظر گرفت؛ بلکه آن‌ها اهداف متعددی را در سلول باکتری خواهند داشت. یکی از ویژگی‌های اسانس‌ها و اجزای تشکیل‌دهنده آن‌ها خاصیت آب‌گریزی است که موجب نفوذ این مواد به لیپیدهای غشای سلول باکتری شده و سبب اختلال در ساختمان سلولی و ایجاد نفوذ‌پذیری بیشتر می‌‌گردد. این مسئله موجب خروج، نشت یون‌ها و دیگر محتویات سلولی می‌شود (24). به‌طورکلی، هرچه مواد فنولیک دارای ساختارهای حلقه‌ای عامل‌دار، بیشتر باشد، خواص ضدباکتریایی آن‌ها نیز بیشتر است (25). از میان 55 ترکیب شناسایی‌شده از اسانس گیاه H. artemisiodes به‌نظر می‌رسد ترکیباتی مانند 1R-α-Pinene، Benzene, 1-methyl-3-(1-methylethyl)، Cyclohexene, 1-(2-nitro-2-propenyl)، 4-Terpineol و Carvacrol دارای اثرات ضدباکتریایی هستند.
به‌منظور بررسی اثرات سیتوتوکسیک اسانس گیاه H. artemisiodes، از روش MTT استفاده شد. نتایج نشان داد میزان اثرات سمّیت سلولی اسانس، وابسته به دوز و زمان است؛ به‌طوری‌که در غلظت‌های بالاتر و در مدت زمان بیشتر، میزان سمّیت سلولی بیشتر می‌شود. همچنین اسانس این گیاه دارای اثرات سمّیت سلولی کمتری در سلول نرمال L929 نسبت به سلول سرطانی HT29 می‌باشد. به‌نظر می‌رسد اسانس این گیاه به‌علت وجود ترکیبان فنلی، به‌خصوص فلاونوئیدها اثر مهاری نشان می‌دهند. در واقع، اسانس این گیاه دارای ماهیت چربی‌دوست بوده و از عرض غشای سلولی عبور می‌کند و وارد سلول می‌شود. مطالعات نشان می‌دهد اسانس‌ها باعث تداخل بار غشای میتوکندری، غشای سلولی و کانال‌های یونی می‌شوند و پتانسیل غشایی را برهم زده و در نهایت، باعث مهار پمپ پروتونی و تولید ATP می‌شوند (26). برخی مطالعات نشان داده‌اند اسانس‌های گیاهی با تخریب پمپ‌های یونی غشایی منجر به نشت یون‌ها (کلسیم) و پروتئین‌های سلولی شده و آپوپتوز را القا می‌کنند (27). مطالعات مختلفی اثرات سمّیت سلولی اسانس گیاهان جنس Helichrysum را نشان داده‌اند.Afoulous  و همکاران، اثرات سمّیت سلولی اسانس گیاه Helichrysum gymnocephalum را روی رده سلولی سرطان سینه مورد بررسی قرار دادند. نتایج این مطالعه نشان داد اسانس این گیاه دارای اثرات چشمگیر ضدسرطانی علیه این سلول است (28). Bigović  و همکاران با بررسی اثرات ضدسرطانی اسانس گیاه Helicrysum plicatum بر روی سه رده سلول سرطانی رحم، پروستات و کبد نشان دادند بین اسانس این گیاه با خاصیت سمّیت سلولی، ارتباط معنی‌داری وجود دارد (29). در واقع، نتایج مطالعه حاضر در زمینه اثرات سمّیت سلولی اسانس گیاه H. artemisiodes با سایر مقالات منتشره همخوانی داشت.
یکی دیگر از اثرات بیولوژیک اسانس‌های گیاهی، القای آپوپتوز در مرگ سلولی است. به‌طور‌کلی، القای مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی یکی از رویکردهای جذاب در درمان سرطان به شمار می‌رود. مسیر مرگ سلولی می‌تواند شامل فعال‌سازی رویدادهای پروآپوپتوتیک در سلول باشد که با نفوذپذیری غشای اندامک میتوکندری به‌وسیله پروتئین‌های Bax و Bak شروع شده و موجب آزاد سازی سیتوکروم c از آن و در نهایت، فعال‌شدن کاسپاز – 9، سپس کاسپاز- 3 می‌شود. علاوه بر این، پروتئین‌های Bcl2 و Bclxl با قرار گرفتن در سطح شبکه اندوپلاسمی، میتوکندری و هسته، از کنار هم قرارگرفتن پروتئین‌های Bax و Bak جلوگیری کرده و فعالیت آپوپتوزی نشان می‌دهند. در این مطالعه دو ژن مهم درگیر با فرآیند آپوپتوز ( Bax و Bcl2 ) در سلول‌های تیمارشده با اسانس بررسی شدند (30). در مطالعه حاضر سمّیت سلولی سلول‌های سرطانی کولون (HT29) مرتبط با فرایند آپوپتو بود که نتیجه امیدوارکنندگی داشت. همچنین در این مطالعه اثرات اسانس گیاه در افزایش بیان ژن پروآپوپتوتیک Bax و کاهش بیان ژن Bcl2 در سلول‌های سرطانی کولون و القای مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی نشان داده شد؛ بنابراین بررسی‌های بیشتری لازم است تا بتوان اثبات کرد "آیا پروفایل بیانی mRNA این ژن‌ها می‌تواند مدرکی برای نقش آن در پیشگویی اختصاصی و دقیق‌تر پاسخ سرطان به درمان باشد؟ " باید توجه داشت بیشتر مطالعات سال‌های اخیر در جهت یافتن داروهای ضدسرطانی می‌باشد تا بتوان با استفاده از این دارو‌ها آپوپتوز را در سلول‌های سرطانی القا و بدون ایجاد التهاب آنها را فاگوسیته کرده و در نهایت از بین برد.
 
نتیجه‌گیری
به‌طورکلی، نتایج این مطالعه نشان داد اسانس گیاه H. artemisiodes دارای اثرات بیولوژیک چشمگیر ضدباکتریایی و ضدسرطانی است. بنابراین، پیشنهاد می‌شود مطالعات بیشتری در مورد خواص زیستی ترکیبات شناسایی‌شده انجام گیرد تا اهمیت پزشکی این گیاه بیشتر مشخص گردد و به‌عنوان یک ترکیب ضدسرطانی و ضدباکتریایی امیدبخش به مراکز دارویی پیشنهاد شود.
 
تشکر و قدردانی
این مطالعه حاصل بخشی از پایان‌نامه دانشجویی سپیده پیروزمند واحد علوم دارویی، دانشگاه آزاد اسلامی می‌باشد که از اردیبهشت تا مهرماه سال 1395 انجام گرفت. بدین‌وسیله از تلاش همکاران، به‌خصوص جناب آقای حسن نوربازرگان و تمام کسانی‌که در انجام این پروژه همکاری نموده‌اند، تشکر و قدردانی می‌نماییم.
References:

1-Petrovska BB. Historical review of medicinal plants' usage. Pharmacogn Rev 2012;6(11):1–5.

2- Kong JM, Goh NK, Chia LS, Chia TF. Recent advances in traditional plant drugs and orchids. Acta Pharmacol Sin 2003;24(1):7-21.

3-Hossain MM. Therapeutic orchids: traditional uses and recent advances--an overview. Fitoterapia 2011;82(2):102-40.

4-Hansen SC, Stolter C, Imholt C, Jacob J. Plant secondary metabolites as rodent repellents: A systematic review. J Chem Ecol 2016;42(9):970-83.

5-Perricone M, Arace E, Corbo MR, Sinigaglia M, Bevilacqua A. Bioactivity of essential oils: A review on their interaction with food components. Front Microbiol 2015;6:76.

6-Solórzano-Santos F, Miranda-Novales MG. Essential oils from aromatic herbs as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol 2012;23(2):136-41.

7-Bassolé IH, Juliani HR. Essential oils in combination and their antimicrobial properties. Molecules 2012;17(4):3989-4006.

8-Radulović NS, Blagojević PD, Stojanović-Radić ZZ, Stojanović NM. Antimicrobial plant metabolites: structural diversity and mechanism of action. Curr Med Chem 2013;20(7):932-52.

9- Tariq A, Mussarat S, Adnan M. Review on ethnomedicinal, phytochemical and pharmacological evidence of Himalayan anticancer plants. J Ethnopharmacol. 2015;22;164:96-119.

10-Migliore L, Migheli F, Spisni R, Coppedè F. Genetics, cytogenetics, and epigenetics of colorectal cancer. J Biomed Biotechnol 2011;2011:792362.

11-Tariq K, Ghias K. Colorectal cancer carcinogenesis: a review of mechanisms. Cancer Biol Med 2016;13(1):120-35.

12-Al-Sohaily S, Biankin A, Leong R, Kohonen-Corish M, Warusavitarne J. Molecular pathways in colorectal cancer. J Gastroenterol Hepatol 2012;27(9):1423-31.

13-Sudhakar A. History of cancer, ancient and modern treatment methods. J Cancer Sci Ther 2009;1(2):1-4.

14-Greenwell M, Rahman PK. Medicinal plants: Their use in anticancer treatment. Int J Pharm Sci Res 2015;6(10):4103-12.

15-Gillings MR, Paulsen IT, Tetu SG. Genomics and the evolution of antibiotic resistance. Ann N Y Acad Sci 2017;1388(1):92-107.

16-Arif T, Bhosale JD, Kumar N, Mandal TK, Bendre RS, Lavekar GS, et al. Natural products--antifungal agents derived from plants. J Asian Nat Prod Res 2009;11(7):621-38.

17-Leonardi M, Ambryszewska KE, Melai B, Flamini G, Cioni PL, Parri F, et al. Essential-oil composition of Helichrysum italicum (ROTH) G.DON ssp. italicum from Elba Island (Tuscany, Italy). Chem Biodivers 2013;10(3):343-55.

18-Antunes Viegas D, Palmeira-de-Oliveira A2, Salgueiro L3, Martinez-de-Oliveira J4, Palmeira-de-Oliveira R. Helichrysum italicum: from traditional use to scientific data. J Ethnopharmacol 2014;151(1):54-65.

19.Bhalla Y, Gupta VK, Jaitak V. Anticancer activity of essential oils: A review. J Sci Food Agric 2013;93(15):3643-53.

20.Du E, Gan L, Li Z, Wang W, Liu D, Guo Y. In vitro antibacterial activity of thymol and carvacrol and their effects on broiler chickens challenged with Clostridium perfringens. J Anim Sci Biotechnol 2015;6:58.

21.Rivas da Silva AC, Lopes PM, Barros de Azevedo MM, Costa DC, Alviano CS, Alviano DS. Biological activities of α-pinene and β-pinene enantiomers. Molecules 2012;17(6):6305-16.

22.Javidnia K, Miri R, Soltani M, Khosravi AR. Essential oil composition of two Iranian Endemic Helichrysum Miller. Species (H. leucocephalum Boiss. and H. artemisioides Boiss. et Hausskn.). J Essent Oil Res 2009;21(1):11-20.

23.Mastelić J, Politeo O, Jerković I. Contribution to the analysis of the essential oil of Helichrysum italicum (Roth) G. Don. Determination of ester bonded acids and phenols. Molecules 2008;13(4):795-803.

24.Freires IA, Denny C, Benso B, de Alencar SM, Rosalen PL. Antibacterial activity of essential oils and their isolated constituents against cariogenic bacteria: A systematic review. Molecules 2015;20(4):7329-58.

 

25.Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods--a review. Int J Food Microbiol 2004;94(3):223-53.

26.Lesgards JF, Baldovini N, Vidal N, Pietri S. Anticancer activities of essential oils constituents and synergy with conventional therapies: A review. Phytother Res 2014;28(10):1423-46.

27.Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D, Idaomar M. Biological effects of essential oils--a review. Food Chem Toxicol 2008;46(2):446-75.

28.Afoulous S, Ferhout H, Raoelison EG, Valentin A, Moukarzel B, Couderc F, et al. Helichrysum gymnocephalum essential oil: chemical composition and cytotoxic, antimalarial and antioxidant activities, attribution of the activity origin by correlations. Molecules 2011;16(10):8273-91.

29.Bigović D, Savikin K, Janković T, Menković N, Zdunić G, Stanojković T, et al. antiradical and cytotoxic activity of different helichrysum plicatum flower extracts. Nat Prod Commun 2011;6(6):819-22.

30.Bilia AR, Guccione C, Isacchi B, Righeschi C, Firenzuoli F, Bergonzi MC. Essential oils loaded in nanosystems: A developing strategy for a successful therapeutic approach. Evid Based Complement Alternat Med 2014;2014:651593.