دوره 12، شماره 5 - ( مرداد 1397 )
جلد 12 شماره 5 صفحات 52-44 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Ataei M, Motevaseli E, Modarressi M H, Sadroddiny E, Tavoosidana G. Cloning, Expression, and Purification of α, βa, and βb Subunits of Human Inhibin Protein in Escherichia coli. Qom Univ Med Sci J 2018; 12 (5) :44-52
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-1723-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-1723-fa.html
عطائی محمد، متوسلی الهه، مدرسی محمدحسین، صدرالدینی اسماعیل، طاوسی‌دانا غلامرضا. کلونینگ، بیان و خالص‌سازی زیرواحدهای α، βa و βb پروتئین اینهیبین انسانی در اشرشیاکلی. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1397; 12 (5) :44-52
محمد عطائی1 
، الهه متوسلی* 2، محمدحسین مدرسی3 ، اسماعیل صدرالدینی1 ، غلامرضا طاوسی‌دانا3
، الهه متوسلی* 2، محمدحسین مدرسی3 ، اسماعیل صدرالدینی1 ، غلامرضا طاوسی‌دانا3
1- دانشکده فناوری‌های نوین پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران.
2- گروه پزشکی مولکولی، دانشکده فناوری‌های نوین پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران. ،E-motevaseli@gmail.com
3- گروه پزشکی مولکولی، دانشکده فناوری‌های نوین پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران.
2- گروه پزشکی مولکولی، دانشکده فناوری‌های نوین پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران. ،
3- گروه پزشکی مولکولی، دانشکده فناوری‌های نوین پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران.
متن کامل [PDF 672 kb]
(1118 دریافت)
| چکیده (HTML) (5591 مشاهده)
متن کامل: (1097 مشاهده)
مقدمه
اینهیبین، یک هورمون گلیکوپروتئینی است که در مردان از سلول‌های سرتولی بیضه و در زنان از جفت، جسم زرد، گناد‌ها و غده هیپوفیز، تولید و ترشح می‌شود. مهم‌ترین عملکرد فیزیولوژیکی این پروتئین، مهار تولید هورمون محرک فولیکولی (FSH) به‌طور پسنورد از غده هیپوفیز است (3-1). همه اینهیبین‌ها کمپلکس‌های پروتئینی دایمری هستند و در ساختار آنها سه زیرواحد پروتئینی α، βa و βb دیده می‌شود (1). از کنار هم قرار‌گرفتن این زیرواحدها، اینهیبین A (α و βa) و اینهیبین B (α و βb) به‌صورت دایمر تشکیل می‌‌گردد. mRNA زیرواحد α دارای 2 اگزون، βa و βb به‌ترتیب 2 و3 اگزون دارند که طی فرآیند پردازش، اینترون‌ها حذف شده و در نهایت، صرف‌نظر از مناطق '5، '3 UTR و poly A، یک ناحیه CDS(توالی کدکننده) که در واقع کدکننده زنجیره پلی‌پپتید است باقی می‌ماند. ژن زیرواحد α و βa به‌ترتیب در ناحیه q35 و q14.2 کروموزوم 2 و ژن زیرواحد βb نیز در ناحیه p14.1 کروموزوم 7 قرار گرفته است. mRNA زیرواحدها پس از ترجمه به‌صورت پیش‌سازهایی درآمده که به‌صورت دایمر با پیوند دی‌سولفیدی به‌هم متصل می‌شوند. ابتدا زیرواحد α به‌صورت یک پیش‌ساز 366 اسید‌آمینه‌ای ساخته می‌شود، سپس با پیش‌ساز زیرواحد ß (a یا b) از طریق یک باند دی‌سولفیدی متصل می‌شوند. هرکدام از پیش‌سازها متشکل از نواحی sig-peptide، propeptide، ناحیه N-terminal و ناحیه C-terminal می‌باشند. ناحیه N-terminal فقط در پیش‌ساز زیرواحد α دیده می‌شود و ناحیه C-terminal نیز همان زنجیره اصلی موجود در فرم دایمر پروتئین است. این نواحی به‌وسیله مناطقی به‌نام Cleveage Site از هم جدا می‌شوند (4). این جایگاه در واقع فاصله بین دو اسید آمینه بوده که در آن زنجیره پیش‌ساز شکسته می‌شود. در ساختار زیرواحدهای α، βa و βb به ترتیب 4، 5 و 5 باند دی‌سولفید وجود دارد که یکی از آنها دارای نقش Interchain بوده و در اتصال دو زیرواحد و تشکیل فرم دایمر، نقشی اساسی ایفا می‌کند (جدول شماره 1).
جدول شماره 1: مشخصات آمینواسیدی و تغییرات پس از ترجمه زیرواحدهای اینهیبین
در زنان، میزان غلظت اینهیبین A در طول دوره بارداری افزایش می‌یابد و می‌توان استنباط کرد این هورمون از جفت و جنین تولید می‌شود و تقریباً در هفته‌های 8-6 افزایش آن را به‌خوبی می‌توان مشاهده کرد؛ از این‌رو جهت بررسی میزان اثربخشی و موفقیت IVF استفاده می‌شود (5). نکته قابل‌توجه اینکه در زنان دارای جنین چند قلو، میزان اینهیبین A به‌طور قابل‌توجهی نسبت به جنین تک‌قلو افزایش می‌یابد (6). در روش انتقال جنین، به‌علت اینکه تعدادی از زیگوت‌ها در همان ابتدای بارداری از بین می‌روند و این موضوع با روش‌های سونوگرافی و βhCG قابل‌شناسایی نبوده و تنها با اندازه‌گیری اینهیبین A می‌توان به سلامت جنین پی برد؛ اینهیبین A یک مارکر عالی برای مانیتوریگ IVF محسوب می‌شود (5). سطح سرمی اینهیبین در بسیاری از ناهنجاری‌های کروموزومی و بیماری‌های ژنتیکی، از قبیل سندرم داون و سرطان تخمدان به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای افزایش می‌یابد. سنجش میزان اینهیبین به کمک آنتی‌بادی مونوکلونال علیه این زیرواحدها، روشی مؤثر در تشخیص این بیماری‌ها می‌باشد (7،8). یکی از روش‌های تهیه آنتی‌بادی مونوکلونال علیه این هورمون، تکنیک هیبریدوما است. به‌دست آوردن آنتی‌بادی مونوکلونال با این روش، نیازمند مقادیر زیادی از این پروتئین جهت تزریق به موش نیز می‌باشد. از طرفی، به‌دلیل شباهت‌های زیاد این هورمون در انسان و موش، مقدار تزریق‌شده باید به اندازه‌ای باشد که بتواند سیستم ایمنی جانور را تحریک کند. تهیه آنتی‌بادی مونوکلونال علیه این هورمون، نیازمند زیرواحدهای پروتئینی خالص است (4). از آنجایی‌که جداسازی و تخلیص این زیرواحدها از سرم بسیار پرهزینه و ناکارآمد است (9)، لذا استفاده از تکنیک کلونینگ و بیان پروتئین نوترکیب می‌تواند روشی مؤثر برای تهیه زیرواحدهای پروتئینی این هورمون باشد (10). این مطالعه با هدف کلونینگ، بیان و تخلیص زیرواحدهای پروتئینی هورمون اینهیبین انجام شد.
روش بررسی
در این مطالعه، توالی کدکننده نواحی مورد نظر هریک از زیرواحدها از بانک اطلاعاتی استخراج و برای هرکدام یک جفت پرایمر طراحی گردید. توالی کدکننده فقط شامل یک اگزون بود که در نتیجه برای تکثیر آن از DNA ژنومی استفاده شد (11). جایگاه آنزیم‌های محدودکننده EcoRI و XhoI به ترتیب در '3 و '5 پرایمرها با استفاده از نرم‌افزار SnapGene V2.3 طراحی شدند. در انتهای '5 هریک از پرایمرها قبل از توالی مربوط به سایت آنزیمی، سه نوکلئوتید جهت اتصال صحیح آنزیم به رشته الیگونوکلئوتید اضافه شد. طول پرایمرهای طراحی‌شده بین 30 -27 نوکلئوتید بود و هریک از پرایمرها با استفاده از نرم‌افزار Oligo V12.0 از نظر وجود پرایمر دایمر و لوپ بررسی شدند. در تمامی پرایمرها لوپ‌هایی وجود داشت که دمای تشکیل آنها کمتر از دمای مرحله اتصالی بود، سپس برای جفت پرایمرهای مربوط به هر ژن با استفاده از پایگاه اطلاعاتی بیوتکنولوژی (NCBI)، بلاست انجام گرفت و اختصاصیت آنها تأیید گردید. پس از تأیید صحت پرایمرها، جهت سنتز به شرکت سیناکلون سفارش داده شدند (جدول شماره 2).
جدول شماره 2: لیست و جزئیات پرایمرهای طراحی‌شده
واکنش PCR برای ژن هریک از زیرواحدها به‌صورت جداگانه انجام گرفت و محصول هر واکنش پس از تفکیک روی ژل آگارز 1% با استفاده از کیت استخراج از ژل تخلیص شد.
هضم آنزیمی محصول PCR هریک از ژن‌ها، همچنین وکتور pET22b به‌وسیله آنزیم‌های محدودکننده EcoRI و XhoI انجام شد و واکنش لیگاسیون با نسبت 3:1 اینسرت/ وکتور با استفاده از آنزیم T4 DNA Ligase طبق پروتکل کارخانه صورت گرفت و پلاسمید‌های نوترکیب pET22b-INHA، pET22b-INHBa و pET22b-INHBb به دست آمد.
در ادامه، کشت سلولی از اشرشیاکلی (سویه BL21 ) تهیه گردید، سپس به 50 میلی‌لیتر محیط LB Broth منتقل و مدت 4 ساعت در انکوباتور شیکردار (با دور rpm250) انکوبه شد. پس از رسیدن به OD600=0.4، به کمک سانتریفوژ (با 2700 دور در دقیقه) رسوب سلولی جدا شد. سلول‌های مستعد با استفاده از 100 میلی‌مولار کلسیم کلرید تهیه گردید، سپس پلاسمید‌های نوترکیب با کمک شوک حرارتی به سلول‌های مستعد، ترانسفورم شدند. سلول‌های ترانسفورم‌شده روی محیط LB agar حاوی آمپی‌سیلین کشت داده شده و در مراحل بعدی کلنی‌های ترانسفورم‌شده از نظر وجود پلاسمید نوترکیب غربالگری شدند.
از کلنی‌های حاصل روی محیط کشت LB agar حاوی آمپی‌سیلین، 7 کلنی انتخاب و روی آنها Colony PCR انجام گرفت. در این مرحله کلنی‌های انتخاب‌شده از نظر اندازه متوسط بودند و بیشترین فاصله را از هم داشتند. در این فرآیند از پرایمرهای T7 promoter و T7 terminator طراحی‌شده روی وکتور استفاده گردید (12).
در مرحله بعد، از سلول‌های ترانسفورم‌شده با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، پلاسمید‌های نوترکیب استخراج و با استفاده از دو آنزیم محدودکننده EcoRI و XhoI، هضم دوگانه آنزیمی در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انجام گرفت، سپس محصول واکنش روی ژل آگارز 1% برده شد. پس از تفکیک روی ژل برای هرکدام از نمونه‌ها دو باند به دست آمد که به‌ترتیب قطعه بزرگتر مربوط به پلاسمید خطی و قطعه کوچکتر مربوط به اینسرت بود. پلاسمید‌های نوترکیب تکثیر‌یافته در سلول‌های ترانسفورم استخراج و برای تعیین توالی به شرکت سیناکلون فرستاده شدند، پس از توالی‌یابی وجود اینسرت در آن مورد تأیید قرار گرفت.
سلول‌های ترانسفورم‌شده (بیان‌کننده هریک از زیرواحدهای اینهیبین)، در 250 میلی‌لیتر محیط کشت LB Broth به‌طور جداگانه کشت داده شده و در انکوباتور شیکردار انکوبه شدند. پس از رسیدن به OD600=0.4 با(1Mm) IPTG القا شدند، سپس نمونه‌های 2 میلی‌لیتری در ساعت‌های 2، 4، 6، 10 و 16 پس از القا، از نمونه اصلی تهیه و پس از سونیکاسیون از نظر بیان پروتئین نوترکیب روی ژل %15 SDS-PAGE بررسی شدند.
پس از بررسی نمونه‌های ترانسفورم‌شده از نظر بیان پروتئین نوترکیب، بهترین نمونه انتخاب و در 25 میلی‌لیتر محیط کشت LB Broth کشت داده شد و 16 ساعت انکوبه گردید، سپس 5/2 میلی‌لیتر از نمونه اول به 250 میلی‌لیتر محیط کشت مایع اضافه و در انکوباتور شیکردار (با دور rpm250) انکوبه شد. پس از رسیدن به OD600=0.4 با(1Mm) IPTG القا و یک Overnight انکوبه گردید، سپس توده سلولی به‌وسیله سانتریفوژ (با دور g2700 به مدت 10 دقیقه) تهیه گردید. زیرواحدهای پروتیئنی با استفاده از روش کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTI طبق پروتکل کارخانه، استخراج و تخلیص شدند. در ادامه، پس از بررسی نمونه‌ها و تفکیک آنها در ژل پلی‌آکریلامید، باندهای پروتئینی به غشای PVDF منتقل شدند (13)؛ که بدین منظور از بافر انتقال (بیس - تریس، متانول و گلایسین) استفاده شد، سپس غشا در محلول بلوکه‌کننده (شیر 3% چربی) قرار گرفت و به مدت 1 ساعت در انکوباتور شیکردار (با دور rpm100) انکوبه شد. در مرحله بعد، His-Tag آنتی‌بادی موشی به آن اضافه و به مدت 1 ساعت در انکوباتور (با دور rpm100) قرار داده شد. پس از این مراحل آنتی‌بادی ثانویه به نمونه افزوده شد. پس از گذشت 1 ساعت انکوباسیون (در نتیجه واکنش H2O2 و دی‌آمینوبنزیدین)، باندهای پروتئینی ظاهر شدند (14).
توده سلولی حاصل، از 250 میلی‌لیتر محیط کشت مایع تهیه گردید و به آن 25 میلی‌لیتر بافر لیز‌کننده اضافه و به‌خوبی پیپتاژ شد. طی یک برنامه سونیکاسیون 6 مرحله‌ای، نمونه‌ها روی یخ سونیکه شدند. مایع رویی نمونه‌ها با استفاده از سانتریفوژ (با دور rpm12000) جمع‌آوری شد، سپس 20 میلی‌گرم از بیدهای نیکل به نمونه اضافه و پس از یک‌ساعت قرار گرفتن در دمای 4 درجه، سانتریفوژ و مایع رویی دور ریخته شد. مراحل شستوشو با بافر شستوشو، 3 مرتبه تکرار گردید و در نهایت، به رسوب حاصل از آخرین مرحله شستوشو، 300 میکرولیتر بافر الوشن افزوده و به مدت 40 دقیقه در دمای 4 درجه در شیکر قرار گرفت، سپس نمونه‌ها (با دور rpm12000 به مدت 2 دقیقه) سانتریفوژ شدند. مایع رویی (حاوی زیرواحدهای پروتئینی نوترکیب) در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد (15).
یافته‌ها
نتایج حاصل از PCR ژن زیرواحدهای اینهیبین نشان داد تکثیر این ژن در دمای 63 و 64 درجه به‌خوبی انجام شده است و این دمای بالا می‌تواند به‌علت وجود لوپ در ساختار پرایمرها باشد. همچنین تخلیص فرآورده PCR ژن زیرواحدهای اینهیبین با کیت استخراج از ژل بهدرستی انجام گرفت و باندهای 412، 363 و 360 کیلوبازی به ترتیب مربوط به زیرواحدهای α،βa و βb به دست آمد. تأیید فرآیند کلونینگ به روش هضم دوگانه آنزیمی با آنزیم‌های EcoRI و XhoI بهدرستی صورت گرفت که در این فرآیند قطعه بزرگتر مربوط به پلاسمید خطی‌شده و قطعه کوچکتر مربوط به اینسرت بود. شکل‌های شماره 1، 2 و 3 به ترتیب نشان‌دهنده بررسی بیان زیرواحدهای α، βa وβb اینهیبین در روش SDS-PAGE می‌باشند.
شکل شماره 1: بررسی بیان زیرواحد α اینهیبین روی ژل پلی‌آکریلامید 15% .
به ترتیب از راست به چپ: ستون 1 نشانگر پروتئینی، ستون 2 نمونه کنترل منفی و ستون‌های 7-3 نمونه‌های القا‌شده با IPTG(1Mm) در ساعات 2, 4, 6، 10 و 16 بعد از القا می‌باشد
شکل شماره 2: نتایج بررسی بیان زیرواحد βa روی ژل پلی‌آکریلامید 15%.
به ترتیب از راست به چپ: ستون 1 نشانگر پروتئینی، ستون 2 نشان‌دهنده نمونه کنترل منفی و ستون‌های 6-2 بیان پروتئین نوترکیب را پس از القای با PTG(1Mm) به‌ترتیب در ساعات 2، 4، 6، 10 و 16 پس از القا نشان می‌دهد
شکل شماره 3: بیان زیرواحد βb اینهیبین روی ژل پلی‌آکریلامید 15%.
به‌ترتیب: ستون 1 نشانگر پروتئینی، ستون 7 نمونه کنترل منفی و ستون‌های 6 – 2 بیان پروتئین نوترکیب در ساعات 2، 4، 6، 10 و 16 پس از القای با IPTG(1Mm) را نشان می‌دهد
همان‌طورکه در این شکل‌ها مشاهده می‌شود، زیرواحدهای اینهیبین به‌ترتیب با اوزان مولکولی 7/14، 13 و 13 کیلودالتون بیان شده‌اند.
در بررسی بیان زیرواحدهای اینهیبین به روش وسترن بلات باندهای پروتئینی زیرواحدهای اینهیبین روی غشای PVDF قابل‌ردیابی هستند (شکل شماره 4).
بحث
امروزه، هورمون اینهیبین به‌عنوان مارکری در تشخیص بیماری‌های ژنتیکی و ناهنجاری‌های جنینی شناخته شده است (16)، و سنجش دقیق آن در تشخیص بسیاری از این بیماری‌ها نقش مؤثری دارد (17). مهم‌ترین بیماری مرتبط با اینهیبین، سندرم داون است، به‌طوری‌که سطح سرمی آن در مادران با جنین مبتلا، افزایش معنی‌داری نشان می‌دهد. اندازه‌گیری اینهیبین در کنار سایر هورمون‌ها؛ از قبیل آلفافیتوپروتئین، گنادوتروپین جفتی و استروژن غیرکونژوگه در تأیید سندرم داون انجام می‌شود (18). علاوه بر این، سنجش میزان اینهیبین در خون زنان می‌تواند به‌عنوان مارکری برای تشخیص سرطان تخمدان استفاده گردد. در مردان نیز میزان اینهیبین نشان‌دهنده عملکرد اسپرماتوژنز و باروری است. در میان روش‌هایی که تاکنون برای سنجش میزان اینهیبین مورد استفاده قرار گرفته، روش‌های مبتنی بر آنتی‌بادی مونوکلونال از حساسیت بیشتری برخوردارند. در این روش‌ها با استفاده از آنتی‌بادی ساخته‌شده علیه زیرواحدهای اینهیبین می‌توان مقدار آن را به‌صورت کیفی (وسترن بلات) و یا کمّی (الایزا) اندازه‌گیری کرد. روش‌های مبتنی بر آنتی‌بادی مونوکلونال مانند وسترن بلات و الایزا نسبت به سایر روش‌ها در سنجش میزان اینهیبین دقت بالایی دارند (6). در بسیاری از این تست‌ها از آنتی‌بادی علیه سه زیرواحد اینهیبین استفاده می‌شود. زیرواحد α در هر دو اینهیبین A و B وجود دارد و آنتی‌بادی علیه آن می‌تواند برای اندازه‌گیری آنها استفاده گردد. آنتی‌بادی علیه زیرواحدهای ß نیز در افتراق اینهیبین A و B می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد. بخش‌هایی از زیرواحدهای اینهیبین که در پروتئین کامل در گردش خون وجود دارند می‌توانند به‌عنوان اهدافی برای تولید آنتی‌بادی مونوکلونال استفاده شوند. ساخت آنتی‌بادی علیه اینهیبین نیازمند پروتئین سالم، خالص و فراوان بوده که می‌توان به این منظور از تکنیک کلونینگ، بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب در میزبان پروکاریوتی استفاده کرد. پروتئین کامل اینهیبین دارای 2 جایگاه گلیکوزیله و 1 پیوند دی سولفیدی است، ولی به‌نظر می‌رسد باتوجه به مطالعات گذشته، وجود یا عدم وجود این موارد در ساخت آنتی‌بادی تأثیری نداشته و می‌توان از میزبان‌های پروکاریوتی نیز به این منظور استفاده کرد. در مطالعه حاضر، قطعات 134، 116 و 115 آمینواسیدی به‌ترتیب برای زیرواحدهای α، βa و βb جهت کلونینگ در نظر گرفته شدند و پس از کلون‌سازی در اشرشیاکلی، تولید و تخلیص شدند. در این طرح از میزبان اشرشیاکلی (سویه BL21) استفاده گردید که رشد سریعی داشته و می‌تواند مقادیر زیادی پروتئین نوترکیب تولید کند (19). همچنین با استفاده از وکتور pET22b به‌عنوان وکتور بیانی، توالی ژنی کدکننده هریک از زیرواحدهای پروتئین اینهیبین در آن کلون شد. مقادیر پروتئین نوترکیب تولیدشده در این طرح به‌طور قابل‌توجهی زیاد بود و محصول آن توانست در مطالعات دیگر برای ساخت آنتی‌بادی مونوکلونال استفاده گردد.
نتیجه‌گیری
هورمون اینهیبین با وجود داشتن ساختار گلیکوپروتئینی و باندهای دی‌سولفیدی، در میزبان پروکاریوتی قابل‌تولید است و با توجه به نتایج، اشرشیاکلی (سویه BL21)، میزبان مناسبی برای کلونینگ و تولید هورمون اینهیبین نوترکیب می‌باشد. به این ترتیب هورمون اینهیبین نوترکیب تولیدشده در این فرآیند به‌دلیل داشتن نواحی آنتی‌ژنیک هورمون بالغ، کاربردهای فراوانی جهت ساخت آنتی‌بادی مونوکلونال علیه اینهیبین خواهد داشت. همچنین کلون‌سازی هریک از زیرواحدهای اینهیبین در میزبان مجزا، امکان تخلیص هریک از آنها را به‌طور خالص فراهم کرده که این امر جهت ساخت آنتی‌بادی اختصاصی مناسب‌تر خواهد بود.
اینهیبین، یک هورمون گلیکوپروتئینی است که در مردان از سلول‌های سرتولی بیضه و در زنان از جفت، جسم زرد، گناد‌ها و غده هیپوفیز، تولید و ترشح می‌شود. مهم‌ترین عملکرد فیزیولوژیکی این پروتئین، مهار تولید هورمون محرک فولیکولی (FSH) به‌طور پسنورد از غده هیپوفیز است (3-1). همه اینهیبین‌ها کمپلکس‌های پروتئینی دایمری هستند و در ساختار آنها سه زیرواحد پروتئینی α، βa و βb دیده می‌شود (1). از کنار هم قرار‌گرفتن این زیرواحدها، اینهیبین A (α و βa) و اینهیبین B (α و βb) به‌صورت دایمر تشکیل می‌‌گردد. mRNA زیرواحد α دارای 2 اگزون، βa و βb به‌ترتیب 2 و3 اگزون دارند که طی فرآیند پردازش، اینترون‌ها حذف شده و در نهایت، صرف‌نظر از مناطق '5، '3 UTR و poly A، یک ناحیه CDS(توالی کدکننده) که در واقع کدکننده زنجیره پلی‌پپتید است باقی می‌ماند. ژن زیرواحد α و βa به‌ترتیب در ناحیه q35 و q14.2 کروموزوم 2 و ژن زیرواحد βb نیز در ناحیه p14.1 کروموزوم 7 قرار گرفته است. mRNA زیرواحدها پس از ترجمه به‌صورت پیش‌سازهایی درآمده که به‌صورت دایمر با پیوند دی‌سولفیدی به‌هم متصل می‌شوند. ابتدا زیرواحد α به‌صورت یک پیش‌ساز 366 اسید‌آمینه‌ای ساخته می‌شود، سپس با پیش‌ساز زیرواحد ß (a یا b) از طریق یک باند دی‌سولفیدی متصل می‌شوند. هرکدام از پیش‌سازها متشکل از نواحی sig-peptide، propeptide، ناحیه N-terminal و ناحیه C-terminal می‌باشند. ناحیه N-terminal فقط در پیش‌ساز زیرواحد α دیده می‌شود و ناحیه C-terminal نیز همان زنجیره اصلی موجود در فرم دایمر پروتئین است. این نواحی به‌وسیله مناطقی به‌نام Cleveage Site از هم جدا می‌شوند (4). این جایگاه در واقع فاصله بین دو اسید آمینه بوده که در آن زنجیره پیش‌ساز شکسته می‌شود. در ساختار زیرواحدهای α، βa و βb به ترتیب 4، 5 و 5 باند دی‌سولفید وجود دارد که یکی از آنها دارای نقش Interchain بوده و در اتصال دو زیرواحد و تشکیل فرم دایمر، نقشی اساسی ایفا می‌کند (جدول شماره 1).
جدول شماره 1: مشخصات آمینواسیدی و تغییرات پس از ترجمه زیرواحدهای اینهیبین
| Glycosylation | M/W (KDa) | S-S count | Cleavage site | C-ter (aa) | N-ter (aa) | Propeptide (Aa) | Signal Peptide (aa) | |
| 3 | 18 | 4 | 61-62 232-233 |
134 | 171 | 43 | 18 | α |
| 1 | 14 | 5 | 20-21 310-311 |
116 | - | 290 | 20 | βa |
| 1 | 14 | 5 | 28-29 292-293 |
115 | - | 264 | 28 | βb |
در زنان، میزان غلظت اینهیبین A در طول دوره بارداری افزایش می‌یابد و می‌توان استنباط کرد این هورمون از جفت و جنین تولید می‌شود و تقریباً در هفته‌های 8-6 افزایش آن را به‌خوبی می‌توان مشاهده کرد؛ از این‌رو جهت بررسی میزان اثربخشی و موفقیت IVF استفاده می‌شود (5). نکته قابل‌توجه اینکه در زنان دارای جنین چند قلو، میزان اینهیبین A به‌طور قابل‌توجهی نسبت به جنین تک‌قلو افزایش می‌یابد (6). در روش انتقال جنین، به‌علت اینکه تعدادی از زیگوت‌ها در همان ابتدای بارداری از بین می‌روند و این موضوع با روش‌های سونوگرافی و βhCG قابل‌شناسایی نبوده و تنها با اندازه‌گیری اینهیبین A می‌توان به سلامت جنین پی برد؛ اینهیبین A یک مارکر عالی برای مانیتوریگ IVF محسوب می‌شود (5). سطح سرمی اینهیبین در بسیاری از ناهنجاری‌های کروموزومی و بیماری‌های ژنتیکی، از قبیل سندرم داون و سرطان تخمدان به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای افزایش می‌یابد. سنجش میزان اینهیبین به کمک آنتی‌بادی مونوکلونال علیه این زیرواحدها، روشی مؤثر در تشخیص این بیماری‌ها می‌باشد (7،8). یکی از روش‌های تهیه آنتی‌بادی مونوکلونال علیه این هورمون، تکنیک هیبریدوما است. به‌دست آوردن آنتی‌بادی مونوکلونال با این روش، نیازمند مقادیر زیادی از این پروتئین جهت تزریق به موش نیز می‌باشد. از طرفی، به‌دلیل شباهت‌های زیاد این هورمون در انسان و موش، مقدار تزریق‌شده باید به اندازه‌ای باشد که بتواند سیستم ایمنی جانور را تحریک کند. تهیه آنتی‌بادی مونوکلونال علیه این هورمون، نیازمند زیرواحدهای پروتئینی خالص است (4). از آنجایی‌که جداسازی و تخلیص این زیرواحدها از سرم بسیار پرهزینه و ناکارآمد است (9)، لذا استفاده از تکنیک کلونینگ و بیان پروتئین نوترکیب می‌تواند روشی مؤثر برای تهیه زیرواحدهای پروتئینی این هورمون باشد (10). این مطالعه با هدف کلونینگ، بیان و تخلیص زیرواحدهای پروتئینی هورمون اینهیبین انجام شد.
روش بررسی
در این مطالعه، توالی کدکننده نواحی مورد نظر هریک از زیرواحدها از بانک اطلاعاتی استخراج و برای هرکدام یک جفت پرایمر طراحی گردید. توالی کدکننده فقط شامل یک اگزون بود که در نتیجه برای تکثیر آن از DNA ژنومی استفاده شد (11). جایگاه آنزیم‌های محدودکننده EcoRI و XhoI به ترتیب در '3 و '5 پرایمرها با استفاده از نرم‌افزار SnapGene V2.3 طراحی شدند. در انتهای '5 هریک از پرایمرها قبل از توالی مربوط به سایت آنزیمی، سه نوکلئوتید جهت اتصال صحیح آنزیم به رشته الیگونوکلئوتید اضافه شد. طول پرایمرهای طراحی‌شده بین 30 -27 نوکلئوتید بود و هریک از پرایمرها با استفاده از نرم‌افزار Oligo V12.0 از نظر وجود پرایمر دایمر و لوپ بررسی شدند. در تمامی پرایمرها لوپ‌هایی وجود داشت که دمای تشکیل آنها کمتر از دمای مرحله اتصالی بود، سپس برای جفت پرایمرهای مربوط به هر ژن با استفاده از پایگاه اطلاعاتی بیوتکنولوژی (NCBI)، بلاست انجام گرفت و اختصاصیت آنها تأیید گردید. پس از تأیید صحت پرایمرها، جهت سنتز به شرکت سیناکلون سفارش داده شدند (جدول شماره 2).
جدول شماره 2: لیست و جزئیات پرایمرهای طراحی‌شده
| جهت | طول (نوکلئوتید) | باز اضافه | آنزیم محدودکننده | سایت برش | سایت اتصالی پرایمر | نام پرایمر | ژن |
| F | 30 | CGC | EcoRI | GAATTC | TCAACTCCCCTGATGTCCTGG | E1/A | INHA |
| R | 30 | CCG | XhoI | CTCGAG | GATACAAGCACAGTGCTGCGT | X1/A | |
| F | 30 | CGC | EcoRI | GAATTC | GGCTTGGAGTGTGATGGCAAG | E1/BA | INHBa |
| R | 30 | CCG | XhoI | CTCGAG | TGAGCACCCACACTCCTCCAC | X1/BA | |
| F | 27 | CGC | EcoRI | GAATTC | GGCCTGGAGTGCGATGGC | E1/BB | INHBb |
| R | 29 | CCG | XhoI | CTCGAG | GGAGCAGCCGCACTCCTCCA | X1/BB |
واکنش PCR برای ژن هریک از زیرواحدها به‌صورت جداگانه انجام گرفت و محصول هر واکنش پس از تفکیک روی ژل آگارز 1% با استفاده از کیت استخراج از ژل تخلیص شد.
هضم آنزیمی محصول PCR هریک از ژن‌ها، همچنین وکتور pET22b به‌وسیله آنزیم‌های محدودکننده EcoRI و XhoI انجام شد و واکنش لیگاسیون با نسبت 3:1 اینسرت/ وکتور با استفاده از آنزیم T4 DNA Ligase طبق پروتکل کارخانه صورت گرفت و پلاسمید‌های نوترکیب pET22b-INHA، pET22b-INHBa و pET22b-INHBb به دست آمد.
در ادامه، کشت سلولی از اشرشیاکلی (سویه BL21 ) تهیه گردید، سپس به 50 میلی‌لیتر محیط LB Broth منتقل و مدت 4 ساعت در انکوباتور شیکردار (با دور rpm250) انکوبه شد. پس از رسیدن به OD600=0.4، به کمک سانتریفوژ (با 2700 دور در دقیقه) رسوب سلولی جدا شد. سلول‌های مستعد با استفاده از 100 میلی‌مولار کلسیم کلرید تهیه گردید، سپس پلاسمید‌های نوترکیب با کمک شوک حرارتی به سلول‌های مستعد، ترانسفورم شدند. سلول‌های ترانسفورم‌شده روی محیط LB agar حاوی آمپی‌سیلین کشت داده شده و در مراحل بعدی کلنی‌های ترانسفورم‌شده از نظر وجود پلاسمید نوترکیب غربالگری شدند.
از کلنی‌های حاصل روی محیط کشت LB agar حاوی آمپی‌سیلین، 7 کلنی انتخاب و روی آنها Colony PCR انجام گرفت. در این مرحله کلنی‌های انتخاب‌شده از نظر اندازه متوسط بودند و بیشترین فاصله را از هم داشتند. در این فرآیند از پرایمرهای T7 promoter و T7 terminator طراحی‌شده روی وکتور استفاده گردید (12).
در مرحله بعد، از سلول‌های ترانسفورم‌شده با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، پلاسمید‌های نوترکیب استخراج و با استفاده از دو آنزیم محدودکننده EcoRI و XhoI، هضم دوگانه آنزیمی در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انجام گرفت، سپس محصول واکنش روی ژل آگارز 1% برده شد. پس از تفکیک روی ژل برای هرکدام از نمونه‌ها دو باند به دست آمد که به‌ترتیب قطعه بزرگتر مربوط به پلاسمید خطی و قطعه کوچکتر مربوط به اینسرت بود. پلاسمید‌های نوترکیب تکثیر‌یافته در سلول‌های ترانسفورم استخراج و برای تعیین توالی به شرکت سیناکلون فرستاده شدند، پس از توالی‌یابی وجود اینسرت در آن مورد تأیید قرار گرفت.
سلول‌های ترانسفورم‌شده (بیان‌کننده هریک از زیرواحدهای اینهیبین)، در 250 میلی‌لیتر محیط کشت LB Broth به‌طور جداگانه کشت داده شده و در انکوباتور شیکردار انکوبه شدند. پس از رسیدن به OD600=0.4 با(1Mm) IPTG القا شدند، سپس نمونه‌های 2 میلی‌لیتری در ساعت‌های 2، 4، 6، 10 و 16 پس از القا، از نمونه اصلی تهیه و پس از سونیکاسیون از نظر بیان پروتئین نوترکیب روی ژل %15 SDS-PAGE بررسی شدند.
پس از بررسی نمونه‌های ترانسفورم‌شده از نظر بیان پروتئین نوترکیب، بهترین نمونه انتخاب و در 25 میلی‌لیتر محیط کشت LB Broth کشت داده شد و 16 ساعت انکوبه گردید، سپس 5/2 میلی‌لیتر از نمونه اول به 250 میلی‌لیتر محیط کشت مایع اضافه و در انکوباتور شیکردار (با دور rpm250) انکوبه شد. پس از رسیدن به OD600=0.4 با(1Mm) IPTG القا و یک Overnight انکوبه گردید، سپس توده سلولی به‌وسیله سانتریفوژ (با دور g2700 به مدت 10 دقیقه) تهیه گردید. زیرواحدهای پروتیئنی با استفاده از روش کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTI طبق پروتکل کارخانه، استخراج و تخلیص شدند. در ادامه، پس از بررسی نمونه‌ها و تفکیک آنها در ژل پلی‌آکریلامید، باندهای پروتئینی به غشای PVDF منتقل شدند (13)؛ که بدین منظور از بافر انتقال (بیس - تریس، متانول و گلایسین) استفاده شد، سپس غشا در محلول بلوکه‌کننده (شیر 3% چربی) قرار گرفت و به مدت 1 ساعت در انکوباتور شیکردار (با دور rpm100) انکوبه شد. در مرحله بعد، His-Tag آنتی‌بادی موشی به آن اضافه و به مدت 1 ساعت در انکوباتور (با دور rpm100) قرار داده شد. پس از این مراحل آنتی‌بادی ثانویه به نمونه افزوده شد. پس از گذشت 1 ساعت انکوباسیون (در نتیجه واکنش H2O2 و دی‌آمینوبنزیدین)، باندهای پروتئینی ظاهر شدند (14).
توده سلولی حاصل، از 250 میلی‌لیتر محیط کشت مایع تهیه گردید و به آن 25 میلی‌لیتر بافر لیز‌کننده اضافه و به‌خوبی پیپتاژ شد. طی یک برنامه سونیکاسیون 6 مرحله‌ای، نمونه‌ها روی یخ سونیکه شدند. مایع رویی نمونه‌ها با استفاده از سانتریفوژ (با دور rpm12000) جمع‌آوری شد، سپس 20 میلی‌گرم از بیدهای نیکل به نمونه اضافه و پس از یک‌ساعت قرار گرفتن در دمای 4 درجه، سانتریفوژ و مایع رویی دور ریخته شد. مراحل شستوشو با بافر شستوشو، 3 مرتبه تکرار گردید و در نهایت، به رسوب حاصل از آخرین مرحله شستوشو، 300 میکرولیتر بافر الوشن افزوده و به مدت 40 دقیقه در دمای 4 درجه در شیکر قرار گرفت، سپس نمونه‌ها (با دور rpm12000 به مدت 2 دقیقه) سانتریفوژ شدند. مایع رویی (حاوی زیرواحدهای پروتئینی نوترکیب) در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد (15).
یافته‌ها
نتایج حاصل از PCR ژن زیرواحدهای اینهیبین نشان داد تکثیر این ژن در دمای 63 و 64 درجه به‌خوبی انجام شده است و این دمای بالا می‌تواند به‌علت وجود لوپ در ساختار پرایمرها باشد. همچنین تخلیص فرآورده PCR ژن زیرواحدهای اینهیبین با کیت استخراج از ژل بهدرستی انجام گرفت و باندهای 412، 363 و 360 کیلوبازی به ترتیب مربوط به زیرواحدهای α،βa و βb به دست آمد. تأیید فرآیند کلونینگ به روش هضم دوگانه آنزیمی با آنزیم‌های EcoRI و XhoI بهدرستی صورت گرفت که در این فرآیند قطعه بزرگتر مربوط به پلاسمید خطی‌شده و قطعه کوچکتر مربوط به اینسرت بود. شکل‌های شماره 1، 2 و 3 به ترتیب نشان‌دهنده بررسی بیان زیرواحدهای α، βa وβb اینهیبین در روش SDS-PAGE می‌باشند.
شکل شماره 1: بررسی بیان زیرواحد α اینهیبین روی ژل پلی‌آکریلامید 15% .
به ترتیب از راست به چپ: ستون 1 نشانگر پروتئینی، ستون 2 نمونه کنترل منفی و ستون‌های 7-3 نمونه‌های القا‌شده با IPTG(1Mm) در ساعات 2, 4, 6، 10 و 16 بعد از القا می‌باشد
شکل شماره 2: نتایج بررسی بیان زیرواحد βa روی ژل پلی‌آکریلامید 15%.
به ترتیب از راست به چپ: ستون 1 نشانگر پروتئینی، ستون 2 نشان‌دهنده نمونه کنترل منفی و ستون‌های 6-2 بیان پروتئین نوترکیب را پس از القای با PTG(1Mm) به‌ترتیب در ساعات 2، 4، 6، 10 و 16 پس از القا نشان می‌دهد
شکل شماره 3: بیان زیرواحد βb اینهیبین روی ژل پلی‌آکریلامید 15%.
به‌ترتیب: ستون 1 نشانگر پروتئینی، ستون 7 نمونه کنترل منفی و ستون‌های 6 – 2 بیان پروتئین نوترکیب در ساعات 2، 4، 6، 10 و 16 پس از القای با IPTG(1Mm) را نشان می‌دهد
|
شکل شماره 4 : بیان زیرواحد βb اینهیبین روی ژل پلی‌آکریلامید 15%.
به‌ترتیب: ستون 1 نشانگر پروتئینی، ستون 7 نمونه کنترل منفی و ستون‌های 6 – 2 بیان پروتئین نوترکیب در ساعات 2، 4، 6، 10 و 16 پس از القای با PTG(1Mm) را نشان می‌دهد |
همان‌طورکه در این شکل‌ها مشاهده می‌شود، زیرواحدهای اینهیبین به‌ترتیب با اوزان مولکولی 7/14، 13 و 13 کیلودالتون بیان شده‌اند.
در بررسی بیان زیرواحدهای اینهیبین به روش وسترن بلات باندهای پروتئینی زیرواحدهای اینهیبین روی غشای PVDF قابل‌ردیابی هستند (شکل شماره 4).
بحث
امروزه، هورمون اینهیبین به‌عنوان مارکری در تشخیص بیماری‌های ژنتیکی و ناهنجاری‌های جنینی شناخته شده است (16)، و سنجش دقیق آن در تشخیص بسیاری از این بیماری‌ها نقش مؤثری دارد (17). مهم‌ترین بیماری مرتبط با اینهیبین، سندرم داون است، به‌طوری‌که سطح سرمی آن در مادران با جنین مبتلا، افزایش معنی‌داری نشان می‌دهد. اندازه‌گیری اینهیبین در کنار سایر هورمون‌ها؛ از قبیل آلفافیتوپروتئین، گنادوتروپین جفتی و استروژن غیرکونژوگه در تأیید سندرم داون انجام می‌شود (18). علاوه بر این، سنجش میزان اینهیبین در خون زنان می‌تواند به‌عنوان مارکری برای تشخیص سرطان تخمدان استفاده گردد. در مردان نیز میزان اینهیبین نشان‌دهنده عملکرد اسپرماتوژنز و باروری است. در میان روش‌هایی که تاکنون برای سنجش میزان اینهیبین مورد استفاده قرار گرفته، روش‌های مبتنی بر آنتی‌بادی مونوکلونال از حساسیت بیشتری برخوردارند. در این روش‌ها با استفاده از آنتی‌بادی ساخته‌شده علیه زیرواحدهای اینهیبین می‌توان مقدار آن را به‌صورت کیفی (وسترن بلات) و یا کمّی (الایزا) اندازه‌گیری کرد. روش‌های مبتنی بر آنتی‌بادی مونوکلونال مانند وسترن بلات و الایزا نسبت به سایر روش‌ها در سنجش میزان اینهیبین دقت بالایی دارند (6). در بسیاری از این تست‌ها از آنتی‌بادی علیه سه زیرواحد اینهیبین استفاده می‌شود. زیرواحد α در هر دو اینهیبین A و B وجود دارد و آنتی‌بادی علیه آن می‌تواند برای اندازه‌گیری آنها استفاده گردد. آنتی‌بادی علیه زیرواحدهای ß نیز در افتراق اینهیبین A و B می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد. بخش‌هایی از زیرواحدهای اینهیبین که در پروتئین کامل در گردش خون وجود دارند می‌توانند به‌عنوان اهدافی برای تولید آنتی‌بادی مونوکلونال استفاده شوند. ساخت آنتی‌بادی علیه اینهیبین نیازمند پروتئین سالم، خالص و فراوان بوده که می‌توان به این منظور از تکنیک کلونینگ، بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب در میزبان پروکاریوتی استفاده کرد. پروتئین کامل اینهیبین دارای 2 جایگاه گلیکوزیله و 1 پیوند دی سولفیدی است، ولی به‌نظر می‌رسد باتوجه به مطالعات گذشته، وجود یا عدم وجود این موارد در ساخت آنتی‌بادی تأثیری نداشته و می‌توان از میزبان‌های پروکاریوتی نیز به این منظور استفاده کرد. در مطالعه حاضر، قطعات 134، 116 و 115 آمینواسیدی به‌ترتیب برای زیرواحدهای α، βa و βb جهت کلونینگ در نظر گرفته شدند و پس از کلون‌سازی در اشرشیاکلی، تولید و تخلیص شدند. در این طرح از میزبان اشرشیاکلی (سویه BL21) استفاده گردید که رشد سریعی داشته و می‌تواند مقادیر زیادی پروتئین نوترکیب تولید کند (19). همچنین با استفاده از وکتور pET22b به‌عنوان وکتور بیانی، توالی ژنی کدکننده هریک از زیرواحدهای پروتئین اینهیبین در آن کلون شد. مقادیر پروتئین نوترکیب تولیدشده در این طرح به‌طور قابل‌توجهی زیاد بود و محصول آن توانست در مطالعات دیگر برای ساخت آنتی‌بادی مونوکلونال استفاده گردد.
نتیجه‌گیری
هورمون اینهیبین با وجود داشتن ساختار گلیکوپروتئینی و باندهای دی‌سولفیدی، در میزبان پروکاریوتی قابل‌تولید است و با توجه به نتایج، اشرشیاکلی (سویه BL21)، میزبان مناسبی برای کلونینگ و تولید هورمون اینهیبین نوترکیب می‌باشد. به این ترتیب هورمون اینهیبین نوترکیب تولیدشده در این فرآیند به‌دلیل داشتن نواحی آنتی‌ژنیک هورمون بالغ، کاربردهای فراوانی جهت ساخت آنتی‌بادی مونوکلونال علیه اینهیبین خواهد داشت. همچنین کلون‌سازی هریک از زیرواحدهای اینهیبین در میزبان مجزا، امکان تخلیص هریک از آنها را به‌طور خالص فراهم کرده که این امر جهت ساخت آنتی‌بادی اختصاصی مناسب‌تر خواهد بود.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
سلولی و مولکولی
دریافت: 1396/4/18 | پذیرش: 1396/6/7 | انتشار: 1397/4/24
دریافت: 1396/4/18 | پذیرش: 1396/6/7 | انتشار: 1397/4/24
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
