دوره 12، شماره 12 - ( اسفند 1397 )
جلد 12 شماره 12 صفحات 52-42 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Rahnamaei Yahyaabadi. S, Honari H, Abdollahi M, Aghaie S M, Ebrahimi M. Subcloning and Expression of ML1-stxB Fusion Gene of Mistletoe Lectin in E. coli and Production of its Antibody in Mouse. Qom Univ Med Sci J 2019; 12 (12) :42-52
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-1920-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-1920-fa.html
رهنمایی یحیی آبادی سهیلا، هنری حسین، عبدالهی مسعود، آقایی سید مجتبی، ابراهیمی محمد علی. زیرهمسانه‌سازی و بیان ژن ممزوجی ML1-stxB دارواش در E. Coli و تولید آنتی‌بادی آن در موش سوری. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1397; 12 (12) :42-52
1- دانشگاه پیام نور
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام‌حسین(ع) ،honari.hosein@gmail.com
3- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام‌حسین(ع)
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام‌حسین(ع) ،
3- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام‌حسین(ع)
متن کامل [PDF 1145 kb]
(1107 دریافت)
| چکیده (HTML) (4644 مشاهده)
روش بررسی
ترادف ژن ML1 ( Mistletoe (Viscum album Lاز بانک ژنی NCBI با شماره AY377891.1 استخراج گردید. با توجه به بررسی داده‌های موجود، ناحیه ژنی (ناحیهN-ترمینال (از نوکلئوتید 874-113 (762 نوکلئوتید) انتخاب گردید. پلاسمیدpUC57 حاوی ژن ML1 از شرکت ندای فن تهیه شد.
وکتور بیانی pET28a(+)-ipaD-Linker-stxB و سوش‌های DH5α وE. coli BL21(DE3) از آزمایشگاه گروه زیست‌شناسی دانشگاه تهیه شد.
وکتور بیانی pET28a(+)-ipaD-Linker-stxB[8]و ژن ML1از وکتور با آنزیم‌های برشی محدودالاثر SalI و NdeI هضم و از روی ژل آگارز تخلیص و جداسازی شدند، سپس قطعه ژنی ML1 و pET28a(+)-Linker-stxB با آنزیم T4 DNA Ligase(Fermentas) به مدت یک‌ساعت در دمای 22 درجه ممزوج شد. در نهایت، پلاسمید نوترکیب pET28a(+)-ML1-Linker-stxB در میزبان بیانی
E. coli BL21 (DE3) تراریخت گردید.
عمل ترانسفورماسیون به روش کلسیم کلراید و شوک حرارتی، انجام و از کلنی‌های رشدیافته کشت تهیه گردید و تخلیص پلاسمید صورت گرفت. پلاسمیدهای استخراج‌شده با ژل آگارز، مطالعه و به‌وسیله PCR و هضم آنزیمی تأیید شدند (12).
جهت انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و تکثیر قطعات ژنی مورد نظر، از دستگاه BIO RAD با حجم 25 میکرولیتر (واجد 5/2 میکرولیتر PCR buffer 10X، 1 میلی‌مول MgCl2، 150 میکرومول dNTP، 400 پیکومول از زوج
پرایمر‌های F،R For5’GCAGCCATCATCATCATCATC3’Rev5’ATCTCAGTGGTGGTGGTGG3’))
در این مرحله، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymease و یک میکرولیتر از DNA مربوط به هر نمونه استفاده شد. برنامه حرارتی مورد استفاده جهت تکثیر قطعه موردنظر از یک سیکل 94 درجه به‌مدت 3 دقیقه، 30 سیکل تکراری 95 درجه به‌مدت 45 ثانیه، 60 درجه به‌مدت 50 ثانیه، 72 درجه به‌مدت 60 ثانیه و یک سیکل انتهایی 72 درجه به‌مدت 5 دقیقه و از آنزیم‌های NdeI، SalI برای هضم آنزیمی استفاده شد.
از کشت شبانه کلون‌های جداسازی‌شده، میزان 100 میکرولیتر به 5 میلی‌لیتر محیط LB مایع تلقیح و پس از رسیدن
(Optical density)OD به 6/0 در طول‌موج 600 نانومتر، ماده القاکننده پروموتر (IPTG) با غلظت 1 میلی‌مولار به محیط کشت افزوده شد و به‌مدت 5 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه و رسوب سلولی تهیه شد (13).
سلول‌های باکتریایی جمع‌آوری‌شده در مرحله فوق به روش دناتوره تیمار شدند. در این روش، سلول‌ها با 500 میکرولیتر بافر لیزکننده B مخلوط و از طریق سونیکاسیون شکسته شدند، سپس نمونه‌ها به مدت 20 دقیقه با سرعت rpm14000 سانتریفوژ شدند و محلول رویی با نسبت یک (بافر نمونه) به پنج (نمونه) با سمپل بافر دارای غلظت x5 مخلوط و به مدت 5 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد جوشانده شد. در نهایت، نمونه‌های تیمارشده با ژل الکتروفورز (SDS-PAGE) 12% از لحاظ بیان پروتئین‌های نوترکیب بررسی شدند.
برای تهیه محلول ژل، درصد آکریل آمید و بیس اکریل آمید متناسب با اندازه پروتئین انتخاب شد. با توجه به اینکه پروتئین بیان‌شده در حدود 41 کیلو دالتون وزن داشت؛ از ژل 12% استفاده شد. نمونه‌های قبل و بعد از القای IPTG، همراه با مارکر پروتئینی (سیناژن) تحت شرایط دناتوره الکتروفورز شدند. غلظت ژل 12% با جریان ثابت 25 میلی‌آمپر بود. برای مشاهده باندهای پروتئین، از روش رنگ‌آمیزی با کوماسی بلو استفاده گردید. برای تأیید پروتئین نوترکیب، از تکنیک وسترن‌بلات استفاده شد. بلاتینگ نمونه‌ها روی کاغذ نیتروسلولز انجام گرفت؛ به این منظور ابتدا نمونه خالص پروتئین هدف به مقدار30 میکروگرم در الکتروفورز پلی آکریل آمید 12% ران شد و از پروتئین BSA(به همان مقدار پروتئین هدف) به‌عنوان کنترل منفی استفاده گردید. سپس ژل از کاست الکتروفورز جدا شده و در بافر بلاتینگ (شامل: تریس 25 میلی‌مولار، گلیسین 192 میلی‌مولار و اتانول 20%) شست‌وشو داده شد. پس از شست‌وشو، ژل در ساندویج وسترن‌بلات بسته‌بندی و در تانک وسترن قرار گرفت. فرآیند بلاتینگ در ولتاژ 100 میلی‌ولت به مدت یک‌ساعت و نیم انجام شد، سپس به‌منظور پرکردن جایگاه‌های خالی (بلاکینگ)، کاغذ نیتروسلولز به‌مدت یک شب در محلول 3% ژلاتین در PBST (Phosphat-Buffered Salin-Tween) در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد، سپس سه مرتبه با PBST شست‌وشو داده شد. کاغذ با آنتی‌بادی‌های پلی‌کلونال موشی با رقت‌های مشخص‌شده توسط شرکت سازنده در 37 درجه گرماگذاری شد. فرآیند شست‌وشو با PBST سه بار انجام گرفت. کونژوگه موشی با رقت 1:2500 به‌عنوان آنتی‌بادی تشخیص‌دهنده به‌کار رفت. همانند مرحله قبل گرماگذاری انجام شد. فرآیند شست‌وشو نیز همانند مراحل قبلی صورت گرفت. در نهایت، کاغذ نیتروسلولز در محلول سوبسترای رنگزای DAB (Diaminobenzidine) (60 میلی‌گرم در 100 میلی‌لیتر بافر تریس، 50 میلی‌مولار با pH برابر 8) تا ظهور باند پروتئینی گذاشته شد. برای توقف واکنش، کاغذ در آب مقطر قرار گرفت (7،13).
تمام مراحل تخلیص در اتاق سرما با دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شد و پروتئین به‌دست‌آمده بلافاصله در دمای 20- درجه سانتیگراد ذخیره گردید. مقدار 25 میکرولیتر از محلول‌های خروجی ستون برداشته شد تا پس از تیمار با سمپل بافر، با ژل الکتروفورز
SDS- PAGE بررسی شوند.
غلظت پروتئین بیان‌شده به کمک روش برادفورد و با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA) (سیناژن) به‌عنوان استاندارد انجام گرفت.
به‌منظور بررسی پاسخ ایمنی، از 5 عدد موش سوری به‌عنوان تست و 5 عدد به‌عنوان نمونه کنترل استفاده گردید. برای هر موش، 20 میکروگرم پروتئین تخلیص‌شده با PBS استریل به حجم 500 میکرولیتر رسانده شد. جهت آماده‌سازی نمونه‌ها برای تزریق، هم حجم آن ادجوان کامل فروند اضافه گردید (حجم نهایی 1 میلی‌لیتر)، سپس محتویات همگن شدند. در پایان، به هر موش تست 200 میکرولیتر از نمونه تهیه‌شده (حاوی 20 میکروگرم آنتی ژن مورد نظر)، به‌صورت صفاقی در چهار نوبت با فاصله زمانی 14 روز تزریق گردید (7،13).
در این مرحله، جهت تعیین تیتر آنتی‌بادی موجود در سرم حیوان، از روش ELISA به شرح زیر استفاده شد:
الف) تثبیت پروتئین نوترکیب به‌عنوان آنتی‌ژن در کف میکروپلیت؛ ب) شست‌وشوی چاهک‌ها؛ ج) مسدود کردن محل‌های خالی از آنتی‌ژن در کف چاهک‌ها؛ د) تهیه سریال رقت از سرم حیوانات تست و کنترل؛ ح) افزودن کانژوگه موشی؛ و) افزودن سوبسترا و توقف آزمایش.
در سه چاهک کنترل مثبت، کنترل منفی و نمونه، مقدار 8 ماکرولیتر از سرم موش با بافر PBST به حجم100 ماکرولیتر رسید و به‌عنوان Capture Antibody تثبیت گردید، سپس بعد از بلاکینگ در چاهک کنترل مثبت، 5/3 میکروگرم از ML1 نوترکیب و در چاهک نمونه، 10میکرولیتر از ذخیره ML1 طبیعی و در چاهک کنترل منفی فقط بافر PBST اضافه شد (حجم نهایی با بافر PBST به 100 ماکرولیتر رسید). در ادامه، به هر چاهک 1 میکرولیتر سرم موش سوری در 99 ماکرولیتر بافر PBST به‌عنوان Detection Antibody افزوده شد. در پایان، کانژوگه موش سوری، سپس سوبسترا اضافه و جذب چاهک‌ها قرائت گردید. در بین تمام این مراحل، شست‌وشو با بافر PBST صورت گرفت (7،13).
یافته‌ها
ترادف ژنی ML1 گیاه دارواش، از بانک ژنیNCBI با شماره AY377891.1 استخراج گردید. با توجه به بررسی داده‌های موجود که در مقدمه به آن پرداخته شد؛ بهترین ناحیه ژن از نوکلئوتید 919– 158 (762 نوکلئوتید) انتخاب و به کمک نرم‌افزار Gene Script بهینه گردید. همچنین به‌منظور تأیید حضور قطعه مورد نظر در وکتورpUC57، از هضم آنزیمی به‌وسیله آنزیم محدودالأثر NdeI و SalI (شکل شماره1، الف ) استفاده شد که در این حالت ژن ML1 که حدود bp774 طول دارد، از وکتور خارج شد. برای به دست آوردن قطعه pET28a(+)-Linker-stxB بر روی وکتور بیانی pET28a(+)-ipaD-Linker-stxB، از هضم آنزیمی محدودالأثرNdeI و SalI (شکل1. ب ) استفاده گردید که در این حالت قطعه با طول حدود bp5600 pET28a(+)-Linker-stxB به دست آمد.
(الف) (ب)
شکل شماره 1: الف) تصویر حاصل از پلاسمید ژن صناعی روی ژل آگارز 1%؛ ب) هضم دوگانه پلاسمید pET28a(+)-Linker-stxB.
الف) ستون 1: نشانگر مولکولیDNA؛ ستون2: برش آنزیمی PUC57با آنزیم NdeI و SalI،
ب) ستون 1: نشانگر مولکولیDNA؛ ستون2: برش آنزیمی pET28a(+)-ipaD-Linker-stxB باآنزیم‌های NdeI و SalI،
پس از برش آنزیمی قطعات ژنی ML1 و pET28a(+)-Linker-stxB با آنزیم‌هایNdeI و SalI و تخلیص آنها از روی ژل آگارز، این قطعات به‌وسیله آنزیم T4 DNA Ligase (Fermentas) به یکدیگر ممزوج و در نهایت،
پلاسمید نوترکیب pET28a(+)-ML1-Linker-stxB در میزبان بیانی E. coli BL21 (DE3) ترانسفورم گردید. برای تأیید قطعه ممزوج، وکتور نوترکیب پس از استخراج پلازمید، عمل PCR بر روی آن انجام شد ( شکل شماره 2، ب). سپس با آنزیم‌های‌های برشی محدودالاثر XhoI و NdeI عمل برش صورت گرفت و قطعه‌ای در حدود bp996 ( شکل شماره 2، الف) مشاهده گردید.
(الف) (ب)
شکل شماره 2: برش آنزیمی وکتور نوترکیب pET28a(+)-ML1-Linker-stxB.
الف) چاهک1: مارکر اسید نوکلئیک (#SM0313) و چاهک 2: محصول برش آنزیمی
ب) چاهک 1: مارکر اسید نوکلئیک (#SM0313) و چاهک 2 و 3: محصول PCR.
کلنی انتخاب‌شده در محیط کشت LB مایع در 37 درجه سانتیگراد کشت داده شد. پس از رسیدن به رشد کافی، به‌منظور بیان پروتئین، IPTG با غلظت 1 میلی‌مولار اضافه گردید و به مدت 5 ساعت در دمای 37 درجه با سرعت 150دور در دقیقه انکوبه شد. سپس برای بررسی بیان و کیفیت آن، روی ژل SDS-PAGE 12% برده شد. باند پروتئینی مدنظر در جایگاه حدود 41 کیلودالتونی قرار گرفت؛ درحالی‌که در کنترل هیچ باندی مشاهده نشد.
شکل شماره 3: الکتروفورز روی ژل SDS-PAGE، به‌منظور بررسی بیان پروتئین مورد نظر.
ردیف شماره 1: مارکر پروتئینی (#PR0602-S)؛ ردیف شماره 2 و 3: نمونه القاشده با ماده IPTG؛ ردیف شماره 4 و 5: نمونه بدون القا با ماده IPTG.
به‌منظور تأیید محصول پروتئینی، تکنیک Western Blotting به کار برده شد. در این روش از آنتی‌بادی پلی‌کلونال ضد STxB کامل استفاده شد. در ستون تست که مربوط به نمونه القاشده با IPTG است؛ یک باند در نزدیکی kDa41 (شکل شماره 5) مشاهده شد. در ستون شاهد که تحت القای IPTG نبوده، هیچ باندی مشاهده نشد.
شکل شماره 5: لکه‌گذاری وسترن.
ردیف 1: مارکر پروتئینی؛ ردیف 2: نمونه تست القاشده با IPTG؛ ردیف 3: نمونه شاهد القانشده با IPTG.
به‌منظور ارزیابی آنتی‌بادی تولیدشده و محاسبه میزان آن در هر مرحله تزریق، از روش الایزای غیرمستقیم استفاده شد. یک‌هفته بعد از هر تزریق، از موش‌های تست و شاهد خونگیری به عمل آمد و بعد ازجداسازی سرم آنها، آزمایش ELISA انجام شد. نتایج نشان داد دو تزریق جهت بررسی تیتر آنتی‌بادی موشی برای آنتی‌ژن MLI-STxB کفایت می‌کند (نمودار).
نمودار: بررسی تیتر آنتی‌بادی موش با استفاده از تکنیک ELISA.
نتایج با استفاده از نرم‌افزار آماری R نسخه 1، 3، 4 با رابط کاربری R Studio آزمون واریانس یک‌طرفه (برای اندازه‌گیری‌های مکرر) بررسی شدند. سطح معنی‌داری، 05/0>p در نظر گرفته شد.
بحث
پروتئین‌های غیرفعال‌کننده ریبوزومی (RIP)، سمومی هستند که خواص N - گلیکوزیداز دارند. آنها اساساً به‌وسیله گیاهان تولید میشوند و به‌عنوان RIPهای نوع 1 و RIPهای نوع 2 طبقه‌بندی شده‌اند. پروتئین‌های غیرفعال‌کننده ریبوزومی به دلیل فعالیت
N-گلیکوزیدازی، از سنتز پروتئین به‌وسیله شکافتن یک باقیمانده آدنین مخصوص (A4324) از28SrRNA مربوط به زیرواحد بزرگ 60S ریبوزومی جلوگیری می‌کنند (12،14). بعضی از RIPهای معین می‌توانند آدنین را از DNA و سایر پلی‌نوکلئوتیدهای دیگر جدا کنند که به‌همین دلیل، آنها به‌عنوان آدنوزین پلی نوکلئوتیدگلیکوزیداز شناخته شده‌اند (1). سموم دارواش شامل دو زنجیره پلی‌پپتیدی (B وA) است که معمولاً با یک پل دی‌سولفیدی به‌هم متصل میشوند. زنجیره A دارای عملکرد آنزیمی بوده و زنجیره B خاصیت لکتینی (Lectin) دارد که قادر است پروتئین‌هایشان را به باقیمانده گالاکتوز در روی سطح سلولی متصل کند. این خصوصیات، ورود زنجیره A به سلول را تسهیل می‌کند (18-15). RIPها فعالیت‌های آنزیمی کیتینازی (19)، سوپراکسیدیسموتازی (20)، Dnaseای (21) و لیپازی (22) را نشان می‌دهند. RIPها به سبب فعالیت N-گلیکوزیدی روی RNA ویروسی دارای اثر ضدویروسی هستند. فعالیت‌های آنزیمی RIPها می‌تواند مرتبط با نقش دفاع گیاهان در برابر شکارچیان و قارچ‌ها باشد (23،24). در کشاورزی، تحقیقاتی در زمینه افزایش مقاومت در مقابل ویروس‌ها با استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب انجام شده است. در پزشکی نیز برای معالجه امراض HIV، تحقیقات وارد فاز مطالعاتی II شده است (25)، ولی اکثر تحقیقات کاربردی مربوط بهRIPها، متوجه درمان سرطان بوده که منجر به هدایتRIPها به‌طور گزینشی به سمت سلول‌های توموری بدخیم برای حذف آنها میشود.
به‌علت وفور بیان گیرندهSTB (Gb3) بر سطح سلول‌های سرطانی، از STB برای انتقال دارو به سلول‌های سرطانی استفاده میگردد. کمپلکس STB نیز به همراه دارو به Gb3 در سطح سلول‌های سرطانی متصل میشود. یکی از اهداف مهم شیمی‌درمانی در بیماران سرطانی، به حداقل رساندن عوارض جانبی داروها بر دیگر سلول‌های بدن است؛ به‌همین منظور، STB می‌تواند داروی ضدسرطان را مستقیماً وارد سلول سرطانی کند بدون اینکه بر سلول‌های دیگر تأثیر داشته باشد یا حداقل اثر کمتری داشته باشد. امروزه، از وزیکول‌های چندلایه لیپیدی به‌نام Spherulit به‌عنوان مخزنی برای انتقال داروها استفاده میگردد. این وزیکول‌ها را می‌توان با STB ممزوج کرده و آنها را مستقیماً به سمت Gb3 فرستاد. اتصال داروها به STB عموماً از ناحیه C ترمینال STB به‌واسطه یک پیوند گوگرددار و به‌واسطه اسیدآمینه Cys انجام می‌گیرد. امروزه، داروهای مختلفی را جهت شیمی‌درمانی سرطان توسط STB به سلول‌های سرطانی می‌فرستند (26). براساس مطالعاتی‌که بر روی لینکرهای مختلف انجام شده است، در این مطالعه از لینکر فورینی که غنی از آرژنین و انعطاف‌پذیر بود و از طرفی، این امکان را به پروتئین نوترکیب می‌داد تا در سطح سلول‌های دارای گیرنده Gb3 به دو قسمت تقسیم شود؛ استفاده گردید تا اپی‌توپ‌های پروتئین تولیدشده به شکل مناسبی به سلول‌های ایمنی عرضه شوند. عملکرد این لینکر، ناشی از خصوصیت اسیدآمینه‌های به کار رفته در ساخت آن که اغلب آرژنین است، می‌باشد که موجب جداسازی موتیف‌های مختلف پروتئین فیوژن‌شده میشود. در گذشته، از این نوع لینکر برای انتقال دارو به سلول‌های سرطانی استفاده می‌شد. در پژوهشی در مورد انتقال داروهای مختلف به سلول‌های سرطانی، به این نتیجه رسیدند که استفاده از لینکرهای فورینی نسبت به لینکرهای بدون انعطاف، مؤثرتر عمل می‌کنند (27). در مجموع لینکرهای دارای آرژنین، فورینی به حساب می‌آیند؛ مانند لینکرهای RR، RXK و... که توسط فورین برش می‌خورند. لینکر مورد استفاده در این پژوهش (RARR)، که یک توالی غنی از آرژنین بوده، انتخاب گردید. این توالی لینکری، اقتباس‌شده از آنتی‌ژن PA باسیلوس آنتراسیس است (8،28).
تزریق پروتئین‌های نوترکیب ممزوجی به حیوان آزمایشگاهی، باعث افزایش تیتر آنتی‌بادی علیه پروتئین‌ها میشوند. حسین هنری و همکاران (سال 1393) در مطالعه‌ای با هدف «بیان پروتئین نوترکیب IpaD-STxB و بررسی ایمنی‌زایی آن در موش سوری و خوکچه هندی» نشان داد تیتر آنتی‌بادی علیه پروتئین IpaD-STxB در موش، افزایش محسوسی داشته است (7،13). مهدی باران‌وند و همکاران در سال 1394 با بررسی ایمنی‌زایی آنتی‌ژن‌هایSTxB و IpaD-STxB به‌صورت نازال در رت‌های آزمایشگاهی، مشاهده کردند با ممزوج شدن IpaD بهSTxB ، میزان تیتر آنتی‌بادی نسبت به تیتر آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن STxBافزایش یافته است، در مطالعه فوق جهت بررسی تیتر آنتی‌بادی در حیوانات آزمایشگاهی، 4 مرتبه با فاصله 15 روز تزریق انجام گرفت (29). پروتئین‌های غیرفعال‌کننده ریبوزومی دارای خاصیت یاوری می‌باشند و با تزریق یک یا حداکثر دو مرتبه به حیوان آزمایشگاهی به اندازه کافی آنتی‌بادی تولید می‌کنند که از خصوصیات بارز پروتئین‌های غیرفعال‌کننده ریبوزومی است. آزمایش‌های مربوط به کمّیت تیتر آنتی‌بادی نشان می‌دهد مقدار آنتی‌بادی خونگیری دوم و سوم با هم اختلاف معنی‌داری ندارند. عبدالهی و همکاران در سال 1396، کمّیت آنتی‌بادی پلی‌کلونال پروتئین نوترکیب SO6 را در رت مطالعه کردند که میزان آنتی‌بادی خونگیری اول، دوم و سوم با هم اختلاف چندانی نداشت (30).
در این تحقیق، با توجه به شناسایی آنتی‌ژن (MLI) به‌وسیله آنتی‌بادی MLI-STxB و خاصیت آنزیمی کتینازی، سوپراکسید دسموتازی، DNasای، لیپازی و اثر ضدویروسی و خواص ضدسرطانی پروتئین‌های غیرفعال‌کننده ریبوزومی، همچنین خاصیت ایمنی‌زایی، یاوری، حاملی پروتئین STxB و بیان زیاد Gb3 در سطح سلول‌های سرطانی انسان، تلاش گردید تا پروتئین نوترکیبی با ممزوج کردن ژن‌های MLI و stxB تولید شود. پروتئین ساخته‌شده می‌تواند به‌عنوان یک کاندید واکسن، و یک ترکیب ضدسرطان، ضدویروس و ضدقارچ مطرح باشد. پروتئین غیرفعال‌کننده ریبوزومیML1 بسیار پایدار بوده و با توجه به فعالیت حاملی و یاوری STxB، از آنتی‌بادی این ترکیبات، به‌عنوان کیت تشخیصی سم گیاه دارواش و باکتری شیگلا می‌توان استفاده کرد. تحلیل آماری نتایج، فرض یکسان بودن تیتر آنتی‌بادی در نمونه‌گیری‌ها را رد کرده و تولید افزایشی آنتی‌بادی (001/0=p) را تأیید می‌کند.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله از تمامی اساتید، پژوهشگران و همکاران محترم در دانشگاه جامع امام حسین(ع) که در به نتیجه رسیدن این تحقیق تلاش فراوان کردند، تشکر و سپاسگزاری میشود.
متن کامل: (960 مشاهده)
روش بررسی
ترادف ژن ML1 ( Mistletoe (Viscum album Lاز بانک ژنی NCBI با شماره AY377891.1 استخراج گردید. با توجه به بررسی داده‌های موجود، ناحیه ژنی (ناحیهN-ترمینال (از نوکلئوتید 874-113 (762 نوکلئوتید) انتخاب گردید. پلاسمیدpUC57 حاوی ژن ML1 از شرکت ندای فن تهیه شد.
وکتور بیانی pET28a(+)-ipaD-Linker-stxB و سوش‌های DH5α وE. coli BL21(DE3) از آزمایشگاه گروه زیست‌شناسی دانشگاه تهیه شد.
وکتور بیانی pET28a(+)-ipaD-Linker-stxB[8]و ژن ML1از وکتور با آنزیم‌های برشی محدودالاثر SalI و NdeI هضم و از روی ژل آگارز تخلیص و جداسازی شدند، سپس قطعه ژنی ML1 و pET28a(+)-Linker-stxB با آنزیم T4 DNA Ligase(Fermentas) به مدت یک‌ساعت در دمای 22 درجه ممزوج شد. در نهایت، پلاسمید نوترکیب pET28a(+)-ML1-Linker-stxB در میزبان بیانی
E. coli BL21 (DE3) تراریخت گردید.
عمل ترانسفورماسیون به روش کلسیم کلراید و شوک حرارتی، انجام و از کلنی‌های رشدیافته کشت تهیه گردید و تخلیص پلاسمید صورت گرفت. پلاسمیدهای استخراج‌شده با ژل آگارز، مطالعه و به‌وسیله PCR و هضم آنزیمی تأیید شدند (12).
جهت انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و تکثیر قطعات ژنی مورد نظر، از دستگاه BIO RAD با حجم 25 میکرولیتر (واجد 5/2 میکرولیتر PCR buffer 10X، 1 میلی‌مول MgCl2، 150 میکرومول dNTP، 400 پیکومول از زوج
پرایمر‌های F،R For5’GCAGCCATCATCATCATCATC3’Rev5’ATCTCAGTGGTGGTGGTGG3’))
در این مرحله، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymease و یک میکرولیتر از DNA مربوط به هر نمونه استفاده شد. برنامه حرارتی مورد استفاده جهت تکثیر قطعه موردنظر از یک سیکل 94 درجه به‌مدت 3 دقیقه، 30 سیکل تکراری 95 درجه به‌مدت 45 ثانیه، 60 درجه به‌مدت 50 ثانیه، 72 درجه به‌مدت 60 ثانیه و یک سیکل انتهایی 72 درجه به‌مدت 5 دقیقه و از آنزیم‌های NdeI، SalI برای هضم آنزیمی استفاده شد.
از کشت شبانه کلون‌های جداسازی‌شده، میزان 100 میکرولیتر به 5 میلی‌لیتر محیط LB مایع تلقیح و پس از رسیدن
(Optical density)OD به 6/0 در طول‌موج 600 نانومتر، ماده القاکننده پروموتر (IPTG) با غلظت 1 میلی‌مولار به محیط کشت افزوده شد و به‌مدت 5 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه و رسوب سلولی تهیه شد (13).
سلول‌های باکتریایی جمع‌آوری‌شده در مرحله فوق به روش دناتوره تیمار شدند. در این روش، سلول‌ها با 500 میکرولیتر بافر لیزکننده B مخلوط و از طریق سونیکاسیون شکسته شدند، سپس نمونه‌ها به مدت 20 دقیقه با سرعت rpm14000 سانتریفوژ شدند و محلول رویی با نسبت یک (بافر نمونه) به پنج (نمونه) با سمپل بافر دارای غلظت x5 مخلوط و به مدت 5 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد جوشانده شد. در نهایت، نمونه‌های تیمارشده با ژل الکتروفورز (SDS-PAGE) 12% از لحاظ بیان پروتئین‌های نوترکیب بررسی شدند.
برای تهیه محلول ژل، درصد آکریل آمید و بیس اکریل آمید متناسب با اندازه پروتئین انتخاب شد. با توجه به اینکه پروتئین بیان‌شده در حدود 41 کیلو دالتون وزن داشت؛ از ژل 12% استفاده شد. نمونه‌های قبل و بعد از القای IPTG، همراه با مارکر پروتئینی (سیناژن) تحت شرایط دناتوره الکتروفورز شدند. غلظت ژل 12% با جریان ثابت 25 میلی‌آمپر بود. برای مشاهده باندهای پروتئین، از روش رنگ‌آمیزی با کوماسی بلو استفاده گردید. برای تأیید پروتئین نوترکیب، از تکنیک وسترن‌بلات استفاده شد. بلاتینگ نمونه‌ها روی کاغذ نیتروسلولز انجام گرفت؛ به این منظور ابتدا نمونه خالص پروتئین هدف به مقدار30 میکروگرم در الکتروفورز پلی آکریل آمید 12% ران شد و از پروتئین BSA(به همان مقدار پروتئین هدف) به‌عنوان کنترل منفی استفاده گردید. سپس ژل از کاست الکتروفورز جدا شده و در بافر بلاتینگ (شامل: تریس 25 میلی‌مولار، گلیسین 192 میلی‌مولار و اتانول 20%) شست‌وشو داده شد. پس از شست‌وشو، ژل در ساندویج وسترن‌بلات بسته‌بندی و در تانک وسترن قرار گرفت. فرآیند بلاتینگ در ولتاژ 100 میلی‌ولت به مدت یک‌ساعت و نیم انجام شد، سپس به‌منظور پرکردن جایگاه‌های خالی (بلاکینگ)، کاغذ نیتروسلولز به‌مدت یک شب در محلول 3% ژلاتین در PBST (Phosphat-Buffered Salin-Tween) در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد، سپس سه مرتبه با PBST شست‌وشو داده شد. کاغذ با آنتی‌بادی‌های پلی‌کلونال موشی با رقت‌های مشخص‌شده توسط شرکت سازنده در 37 درجه گرماگذاری شد. فرآیند شست‌وشو با PBST سه بار انجام گرفت. کونژوگه موشی با رقت 1:2500 به‌عنوان آنتی‌بادی تشخیص‌دهنده به‌کار رفت. همانند مرحله قبل گرماگذاری انجام شد. فرآیند شست‌وشو نیز همانند مراحل قبلی صورت گرفت. در نهایت، کاغذ نیتروسلولز در محلول سوبسترای رنگزای DAB (Diaminobenzidine) (60 میلی‌گرم در 100 میلی‌لیتر بافر تریس، 50 میلی‌مولار با pH برابر 8) تا ظهور باند پروتئینی گذاشته شد. برای توقف واکنش، کاغذ در آب مقطر قرار گرفت (7،13).
تمام مراحل تخلیص در اتاق سرما با دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شد و پروتئین به‌دست‌آمده بلافاصله در دمای 20- درجه سانتیگراد ذخیره گردید. مقدار 25 میکرولیتر از محلول‌های خروجی ستون برداشته شد تا پس از تیمار با سمپل بافر، با ژل الکتروفورز
SDS- PAGE بررسی شوند.
غلظت پروتئین بیان‌شده به کمک روش برادفورد و با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA) (سیناژن) به‌عنوان استاندارد انجام گرفت.
به‌منظور بررسی پاسخ ایمنی، از 5 عدد موش سوری به‌عنوان تست و 5 عدد به‌عنوان نمونه کنترل استفاده گردید. برای هر موش، 20 میکروگرم پروتئین تخلیص‌شده با PBS استریل به حجم 500 میکرولیتر رسانده شد. جهت آماده‌سازی نمونه‌ها برای تزریق، هم حجم آن ادجوان کامل فروند اضافه گردید (حجم نهایی 1 میلی‌لیتر)، سپس محتویات همگن شدند. در پایان، به هر موش تست 200 میکرولیتر از نمونه تهیه‌شده (حاوی 20 میکروگرم آنتی ژن مورد نظر)، به‌صورت صفاقی در چهار نوبت با فاصله زمانی 14 روز تزریق گردید (7،13).
در این مرحله، جهت تعیین تیتر آنتی‌بادی موجود در سرم حیوان، از روش ELISA به شرح زیر استفاده شد:
الف) تثبیت پروتئین نوترکیب به‌عنوان آنتی‌ژن در کف میکروپلیت؛ ب) شست‌وشوی چاهک‌ها؛ ج) مسدود کردن محل‌های خالی از آنتی‌ژن در کف چاهک‌ها؛ د) تهیه سریال رقت از سرم حیوانات تست و کنترل؛ ح) افزودن کانژوگه موشی؛ و) افزودن سوبسترا و توقف آزمایش.
در سه چاهک کنترل مثبت، کنترل منفی و نمونه، مقدار 8 ماکرولیتر از سرم موش با بافر PBST به حجم100 ماکرولیتر رسید و به‌عنوان Capture Antibody تثبیت گردید، سپس بعد از بلاکینگ در چاهک کنترل مثبت، 5/3 میکروگرم از ML1 نوترکیب و در چاهک نمونه، 10میکرولیتر از ذخیره ML1 طبیعی و در چاهک کنترل منفی فقط بافر PBST اضافه شد (حجم نهایی با بافر PBST به 100 ماکرولیتر رسید). در ادامه، به هر چاهک 1 میکرولیتر سرم موش سوری در 99 ماکرولیتر بافر PBST به‌عنوان Detection Antibody افزوده شد. در پایان، کانژوگه موش سوری، سپس سوبسترا اضافه و جذب چاهک‌ها قرائت گردید. در بین تمام این مراحل، شست‌وشو با بافر PBST صورت گرفت (7،13).
یافته‌ها
ترادف ژنی ML1 گیاه دارواش، از بانک ژنیNCBI با شماره AY377891.1 استخراج گردید. با توجه به بررسی داده‌های موجود که در مقدمه به آن پرداخته شد؛ بهترین ناحیه ژن از نوکلئوتید 919– 158 (762 نوکلئوتید) انتخاب و به کمک نرم‌افزار Gene Script بهینه گردید. همچنین به‌منظور تأیید حضور قطعه مورد نظر در وکتورpUC57، از هضم آنزیمی به‌وسیله آنزیم محدودالأثر NdeI و SalI (شکل شماره1، الف ) استفاده شد که در این حالت ژن ML1 که حدود bp774 طول دارد، از وکتور خارج شد. برای به دست آوردن قطعه pET28a(+)-Linker-stxB بر روی وکتور بیانی pET28a(+)-ipaD-Linker-stxB، از هضم آنزیمی محدودالأثرNdeI و SalI (شکل1. ب ) استفاده گردید که در این حالت قطعه با طول حدود bp5600 pET28a(+)-Linker-stxB به دست آمد.
(الف) (ب)
شکل شماره 1: الف) تصویر حاصل از پلاسمید ژن صناعی روی ژل آگارز 1%؛ ب) هضم دوگانه پلاسمید pET28a(+)-Linker-stxB.
الف) ستون 1: نشانگر مولکولیDNA؛ ستون2: برش آنزیمی PUC57با آنزیم NdeI و SalI،
ب) ستون 1: نشانگر مولکولیDNA؛ ستون2: برش آنزیمی pET28a(+)-ipaD-Linker-stxB باآنزیم‌های NdeI و SalI،
پس از برش آنزیمی قطعات ژنی ML1 و pET28a(+)-Linker-stxB با آنزیم‌هایNdeI و SalI و تخلیص آنها از روی ژل آگارز، این قطعات به‌وسیله آنزیم T4 DNA Ligase (Fermentas) به یکدیگر ممزوج و در نهایت،
پلاسمید نوترکیب pET28a(+)-ML1-Linker-stxB در میزبان بیانی E. coli BL21 (DE3) ترانسفورم گردید. برای تأیید قطعه ممزوج، وکتور نوترکیب پس از استخراج پلازمید، عمل PCR بر روی آن انجام شد ( شکل شماره 2، ب). سپس با آنزیم‌های‌های برشی محدودالاثر XhoI و NdeI عمل برش صورت گرفت و قطعه‌ای در حدود bp996 ( شکل شماره 2، الف) مشاهده گردید.
(الف) (ب)
شکل شماره 2: برش آنزیمی وکتور نوترکیب pET28a(+)-ML1-Linker-stxB.
الف) چاهک1: مارکر اسید نوکلئیک (#SM0313) و چاهک 2: محصول برش آنزیمی
ب) چاهک 1: مارکر اسید نوکلئیک (#SM0313) و چاهک 2 و 3: محصول PCR.
کلنی انتخاب‌شده در محیط کشت LB مایع در 37 درجه سانتیگراد کشت داده شد. پس از رسیدن به رشد کافی، به‌منظور بیان پروتئین، IPTG با غلظت 1 میلی‌مولار اضافه گردید و به مدت 5 ساعت در دمای 37 درجه با سرعت 150دور در دقیقه انکوبه شد. سپس برای بررسی بیان و کیفیت آن، روی ژل SDS-PAGE 12% برده شد. باند پروتئینی مدنظر در جایگاه حدود 41 کیلودالتونی قرار گرفت؛ درحالی‌که در کنترل هیچ باندی مشاهده نشد.
شکل شماره 3: الکتروفورز روی ژل SDS-PAGE، به‌منظور بررسی بیان پروتئین مورد نظر.
ردیف شماره 1: مارکر پروتئینی (#PR0602-S)؛ ردیف شماره 2 و 3: نمونه القاشده با ماده IPTG؛ ردیف شماره 4 و 5: نمونه بدون القا با ماده IPTG.
به‌منظور تأیید محصول پروتئینی، تکنیک Western Blotting به کار برده شد. در این روش از آنتی‌بادی پلی‌کلونال ضد STxB کامل استفاده شد. در ستون تست که مربوط به نمونه القاشده با IPTG است؛ یک باند در نزدیکی kDa41 (شکل شماره 5) مشاهده شد. در ستون شاهد که تحت القای IPTG نبوده، هیچ باندی مشاهده نشد.
شکل شماره 5: لکه‌گذاری وسترن.
ردیف 1: مارکر پروتئینی؛ ردیف 2: نمونه تست القاشده با IPTG؛ ردیف 3: نمونه شاهد القانشده با IPTG.
به‌منظور ارزیابی آنتی‌بادی تولیدشده و محاسبه میزان آن در هر مرحله تزریق، از روش الایزای غیرمستقیم استفاده شد. یک‌هفته بعد از هر تزریق، از موش‌های تست و شاهد خونگیری به عمل آمد و بعد ازجداسازی سرم آنها، آزمایش ELISA انجام شد. نتایج نشان داد دو تزریق جهت بررسی تیتر آنتی‌بادی موشی برای آنتی‌ژن MLI-STxB کفایت می‌کند (نمودار).
نمودار: بررسی تیتر آنتی‌بادی موش با استفاده از تکنیک ELISA.
نتایج با استفاده از نرم‌افزار آماری R نسخه 1، 3، 4 با رابط کاربری R Studio آزمون واریانس یک‌طرفه (برای اندازه‌گیری‌های مکرر) بررسی شدند. سطح معنی‌داری، 05/0>p در نظر گرفته شد.
بحث
پروتئین‌های غیرفعال‌کننده ریبوزومی (RIP)، سمومی هستند که خواص N - گلیکوزیداز دارند. آنها اساساً به‌وسیله گیاهان تولید میشوند و به‌عنوان RIPهای نوع 1 و RIPهای نوع 2 طبقه‌بندی شده‌اند. پروتئین‌های غیرفعال‌کننده ریبوزومی به دلیل فعالیت
N-گلیکوزیدازی، از سنتز پروتئین به‌وسیله شکافتن یک باقیمانده آدنین مخصوص (A4324) از28SrRNA مربوط به زیرواحد بزرگ 60S ریبوزومی جلوگیری می‌کنند (12،14). بعضی از RIPهای معین می‌توانند آدنین را از DNA و سایر پلی‌نوکلئوتیدهای دیگر جدا کنند که به‌همین دلیل، آنها به‌عنوان آدنوزین پلی نوکلئوتیدگلیکوزیداز شناخته شده‌اند (1). سموم دارواش شامل دو زنجیره پلی‌پپتیدی (B وA) است که معمولاً با یک پل دی‌سولفیدی به‌هم متصل میشوند. زنجیره A دارای عملکرد آنزیمی بوده و زنجیره B خاصیت لکتینی (Lectin) دارد که قادر است پروتئین‌هایشان را به باقیمانده گالاکتوز در روی سطح سلولی متصل کند. این خصوصیات، ورود زنجیره A به سلول را تسهیل می‌کند (18-15). RIPها فعالیت‌های آنزیمی کیتینازی (19)، سوپراکسیدیسموتازی (20)، Dnaseای (21) و لیپازی (22) را نشان می‌دهند. RIPها به سبب فعالیت N-گلیکوزیدی روی RNA ویروسی دارای اثر ضدویروسی هستند. فعالیت‌های آنزیمی RIPها می‌تواند مرتبط با نقش دفاع گیاهان در برابر شکارچیان و قارچ‌ها باشد (23،24). در کشاورزی، تحقیقاتی در زمینه افزایش مقاومت در مقابل ویروس‌ها با استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب انجام شده است. در پزشکی نیز برای معالجه امراض HIV، تحقیقات وارد فاز مطالعاتی II شده است (25)، ولی اکثر تحقیقات کاربردی مربوط بهRIPها، متوجه درمان سرطان بوده که منجر به هدایتRIPها به‌طور گزینشی به سمت سلول‌های توموری بدخیم برای حذف آنها میشود.
به‌علت وفور بیان گیرندهSTB (Gb3) بر سطح سلول‌های سرطانی، از STB برای انتقال دارو به سلول‌های سرطانی استفاده میگردد. کمپلکس STB نیز به همراه دارو به Gb3 در سطح سلول‌های سرطانی متصل میشود. یکی از اهداف مهم شیمی‌درمانی در بیماران سرطانی، به حداقل رساندن عوارض جانبی داروها بر دیگر سلول‌های بدن است؛ به‌همین منظور، STB می‌تواند داروی ضدسرطان را مستقیماً وارد سلول سرطانی کند بدون اینکه بر سلول‌های دیگر تأثیر داشته باشد یا حداقل اثر کمتری داشته باشد. امروزه، از وزیکول‌های چندلایه لیپیدی به‌نام Spherulit به‌عنوان مخزنی برای انتقال داروها استفاده میگردد. این وزیکول‌ها را می‌توان با STB ممزوج کرده و آنها را مستقیماً به سمت Gb3 فرستاد. اتصال داروها به STB عموماً از ناحیه C ترمینال STB به‌واسطه یک پیوند گوگرددار و به‌واسطه اسیدآمینه Cys انجام می‌گیرد. امروزه، داروهای مختلفی را جهت شیمی‌درمانی سرطان توسط STB به سلول‌های سرطانی می‌فرستند (26). براساس مطالعاتی‌که بر روی لینکرهای مختلف انجام شده است، در این مطالعه از لینکر فورینی که غنی از آرژنین و انعطاف‌پذیر بود و از طرفی، این امکان را به پروتئین نوترکیب می‌داد تا در سطح سلول‌های دارای گیرنده Gb3 به دو قسمت تقسیم شود؛ استفاده گردید تا اپی‌توپ‌های پروتئین تولیدشده به شکل مناسبی به سلول‌های ایمنی عرضه شوند. عملکرد این لینکر، ناشی از خصوصیت اسیدآمینه‌های به کار رفته در ساخت آن که اغلب آرژنین است، می‌باشد که موجب جداسازی موتیف‌های مختلف پروتئین فیوژن‌شده میشود. در گذشته، از این نوع لینکر برای انتقال دارو به سلول‌های سرطانی استفاده می‌شد. در پژوهشی در مورد انتقال داروهای مختلف به سلول‌های سرطانی، به این نتیجه رسیدند که استفاده از لینکرهای فورینی نسبت به لینکرهای بدون انعطاف، مؤثرتر عمل می‌کنند (27). در مجموع لینکرهای دارای آرژنین، فورینی به حساب می‌آیند؛ مانند لینکرهای RR، RXK و... که توسط فورین برش می‌خورند. لینکر مورد استفاده در این پژوهش (RARR)، که یک توالی غنی از آرژنین بوده، انتخاب گردید. این توالی لینکری، اقتباس‌شده از آنتی‌ژن PA باسیلوس آنتراسیس است (8،28).
تزریق پروتئین‌های نوترکیب ممزوجی به حیوان آزمایشگاهی، باعث افزایش تیتر آنتی‌بادی علیه پروتئین‌ها میشوند. حسین هنری و همکاران (سال 1393) در مطالعه‌ای با هدف «بیان پروتئین نوترکیب IpaD-STxB و بررسی ایمنی‌زایی آن در موش سوری و خوکچه هندی» نشان داد تیتر آنتی‌بادی علیه پروتئین IpaD-STxB در موش، افزایش محسوسی داشته است (7،13). مهدی باران‌وند و همکاران در سال 1394 با بررسی ایمنی‌زایی آنتی‌ژن‌هایSTxB و IpaD-STxB به‌صورت نازال در رت‌های آزمایشگاهی، مشاهده کردند با ممزوج شدن IpaD بهSTxB ، میزان تیتر آنتی‌بادی نسبت به تیتر آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن STxBافزایش یافته است، در مطالعه فوق جهت بررسی تیتر آنتی‌بادی در حیوانات آزمایشگاهی، 4 مرتبه با فاصله 15 روز تزریق انجام گرفت (29). پروتئین‌های غیرفعال‌کننده ریبوزومی دارای خاصیت یاوری می‌باشند و با تزریق یک یا حداکثر دو مرتبه به حیوان آزمایشگاهی به اندازه کافی آنتی‌بادی تولید می‌کنند که از خصوصیات بارز پروتئین‌های غیرفعال‌کننده ریبوزومی است. آزمایش‌های مربوط به کمّیت تیتر آنتی‌بادی نشان می‌دهد مقدار آنتی‌بادی خونگیری دوم و سوم با هم اختلاف معنی‌داری ندارند. عبدالهی و همکاران در سال 1396، کمّیت آنتی‌بادی پلی‌کلونال پروتئین نوترکیب SO6 را در رت مطالعه کردند که میزان آنتی‌بادی خونگیری اول، دوم و سوم با هم اختلاف چندانی نداشت (30).
در این تحقیق، با توجه به شناسایی آنتی‌ژن (MLI) به‌وسیله آنتی‌بادی MLI-STxB و خاصیت آنزیمی کتینازی، سوپراکسید دسموتازی، DNasای، لیپازی و اثر ضدویروسی و خواص ضدسرطانی پروتئین‌های غیرفعال‌کننده ریبوزومی، همچنین خاصیت ایمنی‌زایی، یاوری، حاملی پروتئین STxB و بیان زیاد Gb3 در سطح سلول‌های سرطانی انسان، تلاش گردید تا پروتئین نوترکیبی با ممزوج کردن ژن‌های MLI و stxB تولید شود. پروتئین ساخته‌شده می‌تواند به‌عنوان یک کاندید واکسن، و یک ترکیب ضدسرطان، ضدویروس و ضدقارچ مطرح باشد. پروتئین غیرفعال‌کننده ریبوزومیML1 بسیار پایدار بوده و با توجه به فعالیت حاملی و یاوری STxB، از آنتی‌بادی این ترکیبات، به‌عنوان کیت تشخیصی سم گیاه دارواش و باکتری شیگلا می‌توان استفاده کرد. تحلیل آماری نتایج، فرض یکسان بودن تیتر آنتی‌بادی در نمونه‌گیری‌ها را رد کرده و تولید افزایشی آنتی‌بادی (001/0=p) را تأیید می‌کند.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله از تمامی اساتید، پژوهشگران و همکاران محترم در دانشگاه جامع امام حسین(ع) که در به نتیجه رسیدن این تحقیق تلاش فراوان کردند، تشکر و سپاسگزاری میشود.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
ژنتیک
دریافت: 1396/8/30 | پذیرش: 1397/4/13 | انتشار: 1398/2/18
دریافت: 1396/8/30 | پذیرش: 1397/4/13 | انتشار: 1398/2/18
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
