مجله دانشگاه علوم پزشکی قم

مقدمه

یکی از ویژگی‌های منحصر به فرد موجودات زنده، توانایی تولید مثل می‌باشد؛ از این رو، باروری و داشتن فرزند در جامعه بشری از اهمیت به‌سزایی برخوردار است (1). ناباروری یک مشکل بالینی جدی در زمینه تولید مثل می‌باشد که ﺷﻴﻮﻉ ﺑﺎﻻﻱ ﺍﻳﻦ ﺑﻴﻤﺎﺭﻱ، ﺍﻫﻤﻴﺖ ﺁﻥ ﺭﺍ ﺩﻭﭼﻨﺪﺍﻥ نموده و استرس زیادی را بر زوج‌های نابارور وارد می‌کند و بدین‌ترتیب سلامت روانی زوجین را تهدید می‌نماید (2). ﻧﻘﺺ ﻋﻤﻠﻜﺮد اﺳﭙﺮم به‌ عنوان یکی از بزرگ‌ترین ﻋﻮاﻣﻞ دﺧﻴﻞ در ﻧﺎﺑﺎروری ﻣﺮدان ﻣﻄﺮح می‌باشد (3). اﺧﺘﻼل در ﺗﺤﺮک اﺳﭙﺮم ﻳﻜﻲ از ﺷﺎﺧﺺﻫﺎی ﻋﻤﺪه در ﻧﺎﺑﺎروری ﻣﺮدان اﺳﺖ؛ ﺑﻪ ‌ﻃﻮری ﻛﻪ ﻧﺎﺑﺎروری ﻧﺎﺷﻲ از ﺑﻲﺗﺤﺮﻛﻲ ﻳﺎ ﻛﻴﻔﻴﺖ ﺿﻌﻴﻒ ﺗﺤﺮک اﺳﭙﺮم، ﻣﺸﻜﻞ اﺻﻠﻲ ﺑﻴﻤﺎران ﻣﺮاﺟﻌﻪﻛﻨﻨﺪه به مراکز درمان ناباروری می‌باشد (4). حدود 60 سال است که انجماد به عنوان یک روش نگهدارنده اسپرم برای مدت طولانی مطرح می‌باشد. با وجود تاریخچه طولانی انجماد اسپرم، میزان بقای اسپرم همچنان محدود بوده و نمی‌تواند انتظارات ایده‌آل را برآورده نماید؛ زیرا فرایند انجماد با ایجاد آسیب‌های شیمیایی و فیزیکی مانند تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS: Reactive Oxygen Species) در اسپرم موجب آسیب به غشای سلول، اختلال در تحرک اسپرم، ایجاد ناهنجاری‌های ریختی، آسیب به آکروزوم، قطعه قطعه شدن DNA و در نتیجه کاهش عملکرد اسپرم می‌شود (5،6). معمولاً در روش انجماد برای حفظ حیات و تحرک اسپرم و کاهش آسیب‌های وارد شده، از محیط‌های انجماد اسپرم استفاده می‌شود (7). اخیراً محققان برای بهبود پارامترهای اسپرمی پس از انجماد و ذوب، افزودن برخی از آنتی‌اکسیدان‌ها به محیط انجماد اسپرم را در دستور کار خود قرار داده‌اند (8). با توجه به اینکه انتخاب یک اسپرم مناسب پس از فرایند ذوب جهت استفاده درICSI  (Intracytoplasmic sperm injection) (یکی از تکنیک‌های لقاح مصنوعی) می‌تواند با درصد حاملگی بالاتر و رشد جنینی بیشتر همراه باشد، دستیابی به اسپرمی با حفظ کیفیت بالا پس از فرآیند ذوب بسیار حائز اهمیت است (9). سیستئین اسید آمینه‌ای با وزن مولکولی پایین حاوی تیول می‌باشد که پیش‌ساز گلوتاتیون داخل سلولی است (10). سیستئین به راحتی از غشای سلول وارد شده و باعث افزایش بیوسنتز گلوتاتیون داخل سلولی- هم در برون‌تنی و هم درون‌تنی- و نیز محافظت لیپیدها و پروتئین‌های غشایی به علت خواص خنثی‌کنندگی غیر مستقیم رادیکال‌های آزاد می‌شود (11). مطالعات نشان می‌دهند که سنتز گلوتاتیون در شرایط برون‌تنی ممکن است به علت کمبود سیستئین در محیط کشت دچار نقص شود که این امر ناشی از ناپایداری بالای گلوتاتیون و اکسیده شدن خود به خودی آن به سیستئین می‌باشد (12). سیستئین اثر محافظتی در برابر یکپارچگی عملکرد آکروزوم و میتوکندری در برابر انجماد داشته و فعالیت حرکتی اسپرم پس از خروج از انجماد را بهبود می‌بخشد (13). اثبات شده است که تیول‌هایی از قبیل گلوتاتیون و سیستئین، مانع از دست رفتن فعالیت حرکتی اسپرم در مایع منی گاو پس از ذوب شده و باعث بهبود قابلیت حیات، حفظ ساختار کروماتین و یکپارچگی غشای اسپرم گاو طی ذخیره مایع منی می‌شود (14). با توجه به مطالب بیان شده، مطالعه حاضر با هدف بررسی اثر آنتی‌اکسیدان ان-استیل سیستئین بر محیط استاندارد فریز اسپرم با ارزیابی پارامترهای اسپرمی، قابلیت حیات و میزان شکست DNA اسپرم در بیماران آستنوزواسپرمی انجام شد.

روش بررسی

در پژوهش حاضر 20 مرد مبتلا به آستنوزواسپرمی که به منظور درﻣﺎن ﻧﺎﺑﺎروری به مرکز درمان ناباروری جهاد دانشگاهی قم ﻣﺮاﺟﻌﻪ کرده بودند، ﭘﺲ از اﻋﻼم رﺿﺎﻳﺖ ﺑﺮای ﺷﺮﻛﺖ در ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ انتخاب شدند. ﻧﻤﻮﻧﻪ اﺿﺎﻓﻲ ﻣﺎﻳﻊ ﻣﻨﻲ این بیماران پس از اﻧﺠﺎم اﺳﭙﺮﻣﻮﮔﺮام ﻣﻄﺎﺑﻖ با اﺳﺘﺎﻧﺪاردﻫﺎی سازمان جهانی بهداشت (2010) و تأیید توسط پزشک متخصص ارولوژیست، جمع‌آوری گردید. نمونه به ‌دست آمده از هریک از بیماران به سه گروه به شرح زیر تقسیم شد: گروه اول: گروه کنترل؛ گروه دوم: گروه انجماد؛ گروه سوم: گروه انجماد + ان-استیل سیستئین (1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) و به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه انکوبه گردید. پس از اخذ شرح حال بیماران و 4-3 روز پرهیز از مقاربت، یک ظرف استریل و درجه‌‌بندی شده جهت گرفتن نمونه به بیمار داده شد. آنالیز پارامترهای اسپرم هر فرد آستنوزواسپرمی ﻣﻄﺎﺑﻖ با اﺳﺘﺎﻧﺪاردﻫﺎی سازمان جهانی بهداشت (2010) قبل و بعد از فرایند انجماد-ذوب انجام شد. شایان ذکر است که این مطالعه در کمیته اخلاق بررسی گشته و طی نامه شماره IR.QOM.REC.1398.006 مورد تصویب کمیته قرار گرفته است.

ارزیابی پارامترهای اسپرمی

بررسی پارمترهای اسپرمی (غلظت، تحرک و مورفولوژی) با استفاده از میکروسکوپ نوری و طبق دستورالعمل سازمان جهانی بهداشت (2010) صورت گرفت. شمارش اسپرم‌ها بر حسب میلیون بر لیتر توسط لام نئوبار انجام شد. بررسی میزان تحرک اسپرم‌ها براساس دستورالعمل سازمان جهانی بهداشت (2010) اندازه‌گیری گردید. در گروه بیماران آستنوزواسپرمی، درصد تحرک کل اسپرم کمتر از 40 درصد بود (15). برای بررسی مورفولوژی طبیعی اسپرم‌ها از روش رنگ‌آمیزی پاپانیکولا استفاده شد (16). در رنگ‌آمیزی پاپانیکولا، سر به رنگ آبی و قطعه میانی به رنگ قرمز یا صورتی درمی‌آید. به منظور بررسی مورفولوژی اسپرم، ابتدا از هر نمونه گسترش تهیه شد. سپس رنگ‌آمیزی پاپانیکولا صورت گرفت. برای هر نمونه، یک لام فیکس شده از اسپرم تهیه شد. پس از رنگ‌آمیزی، 200 اسپرم توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی (×1000) بررسی گردید.

ارزیابی قابلیت حیات (Viability)

برای تعیین قابلیت حیات اسپرم، براساس دستورالعمل WHO از رنگ‌آمیزی ائوزین-نیگروزین استفاده شد (17). نسبت یک حجم از سوسپانسیون اسپرم و دو حجم از ائوزین در میکروتیوب مخلوط گردید و پس از گذشت 30 ثانیه، حجم مساوی از محلول نیگروزین به آن اضافه شد و گسترش نازکی از نمونه روی لام ایجاد گردید. پس از خشک شدن گسترش، با استفاده از میکروسکوپ معمولی با بزرگنمایی (×1000)، 200 اسپرم شمارش شد و اسپرم‌ها در گروه‌های مختلف بررسی شدند و به صورت درصد اسپرم‌های زنده گزارش گردیدند.

ارزیابی آسیب DNA

ارزیــابی فراگمانتاســیون DNA بــه روش SCD انجام شد (18). در این روش مقـدار 30 میکرولیتـر (تقریباً بین 15 تا 20 میلیون) از نمونـه اسـپرمی شستشو داده شد و بـا 70 میکرولیتـر از آگـاروز بـا درجـه ذوب پـایین در دمای 37 درجه سانتی‌گراد مخلـوط گردید. سـپس نمونه مخلوط شده روی لامی کـه از قبـل بـا آگـاروز
65/0 درصد پوشیده شده بود، قرار گرفت و با گذاشـتن یـک لامـل روی آن، به مدت 4 دقیقه در دمای 4 درجه سـانتی‌گـراد قرار گرفت. سپس با دقت لامل از سـطح لام جـدا گردید و هـر لام به مـدت 7 دقیقه بـه صورت افقی در محلول اسید کلریدریک 08/0 نرمال در دمای اتاق و در تـاریکی قـرار داده شد. سپس به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق در محلول‌های
تجزیه‌کننده قرار داده شد. در ادامه، شستشو صورت گرفت و هـرکدام به مدت 2 دقیقه به ترتیب در الکل 70، 90 و 100 درصـد آبگیری شد و پس از خشک شدن، با محلــول رنــگ دیفکوئیــک رنــگ‌آمیــزی گشته و توســط میکروسکوپ نوری بررسی گردید. با استفاده از این روش می‌توان میزان فراگمانتاسیون DNA را با توجه به وجود هالـه اطـراف هسته و اندازه آن بررسی نمود. در اسپرم‌های با فراگمانتاسیون DNA، هسته اسپرم با هالـه کوچـک و بـدون هالـه و در اسپرم‌های بـدون فراگمانتاسیون DNA، هسـته اسـپرم بـا هالـه بـزرگ و هالـه متوسط تعیین می‌شود. در این مطالعه به منظور بررسی فراگمانتاسیون DNA، 200 سلول شمارش گردید.

آنالیز آماری

داده‌های حاصل از این مطالعه با استفاده از نرم‌افزار SPSS 21 و آزمون‌های ONE Way ANOVA و تعقیبی توکی تجزیه و تحلیل گردیدند. تفاوت میانگین‌ها در سطح (05/0P<) معنا‌دار در نظر گرفته شد.

یافته‌ها

ارزیابی پارامترهای اسپرمی

در میانگین تعداد اسپرم در بین سه گروه تفاوت معناداری مشاهده نشد (05/0P<) (جدول 1). میانگین درصد تحرک کل اسپرم در گروه انجماد نسبت به گروه کنترل کاهش معنا‌داری را نشان داد (001/0P<). در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، میانگین

درصد تحرک کل اسپرم افزایش معنا‌داری نسبت به گروه انجماد داشت (001/0P<)؛ اما در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، افزایش معنا‌داری در میانگین درصد تحرک کل اسپرم نسبت به گروه کنترل مشاهده نشد (جدول 1) (05/0P<)‌. در این مطالعه میانگین درصد اسپرم‌های دارای حرکت پیشرونده در گروه انجماد نسبت به گروه کنترل کاهش معنا‌داری یافت (001/0P<). در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین نیز تحرک پیشرونده، افزایش معنا‌داری را نسبت به گروه انجماد نشان داد (001/0P<). شایان ذکر است که در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، افزایش معنا‌داری در میزان میانگین درصد اسپرم‌های دارای حرکت پیشرونده نسبت به گروه کنترل مشاهده نشد (جدول 1) (05/0P<)‌. از سوی دیگر در گروه انجماد، کاهش معنا‌داری در میانگین درصد اسپرم‌ها با مورفولو‍ژی نرمال نسبت به گروه کنترل مشاهده گردید (001/0P<). همچنین مورفولوژی نرمال اسپرم در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، افزایش معنا‌داری را نسبت به گروه انجماد نشان داد (001/0P<). میزان مورفولوژی نرمال در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، خود را به گروه کنترل نزدیک کرد؛ اما این افزایش نسبت به گروه کنترل معنا‌دار نبود (05/0P<) (جدول 1) (شکل 1).

ارزیابی قابلیت حیات اسپرم (Viability)

میانگین درصد اسپرم‌های زنده (قابلیت حیات) در گروه انجماد نسبت به گروه کنترل کاهش معنا‌داری یافت (001/0P<). از سوی دیگر، قابلیت حیات اسپرم در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، افزایش معنا‌داری را نسبت به گروه انجماد نشان داد (001/0P<) (شکل 2، C-B). در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین نیز میانگین درصد اسپرم‌های زنده، کاهش معنا‌داری نسبت به گروه کنترل یافت (جدول 1) (001/0P<). در شکل 2، A-B-C قابلیت حیات اسپرم در گروه‌های مختلف نشان داده شده است.

ارزیابی آسیب DNA

در گروه انجمادی، افزایش معنا‌داری نسبت به گروه کنترل در میانگین درصد آسیب DNA مشاهده شد (001/0P<)‌. میانگین درصد آسیب DNA در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، کاهش معناداری را نسبت به گروه انجماد نشان داد (001/0P<)‌. همچنین در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، افزایش معنا‌داری در میانگین درصد آسیب DNA نسبت به گروه کنترل مشاهده گردید (001/0P<) (جدول 2).

شکل شماره 1: بررسی مورفولوژی اسپرم با استفاده از رنگ‌آمیزی پاپانیکولا در گروه‌های مختلف (بزرگنمایی Ob×1000): A: گروه کنترل؛ B: گروه انجماد؛

C: گروه انجماد + آنتی‌اکسیدان

شکل شماره 2: سنجش قابلیت حیات اسپرم انسان با استفاده از رنگ‌آمیزی ائوزین-نیگروزین در گروه‌های مختلف (بزرگنمایی 0Ob×100): A: گروه کنترل؛   B: گروه انجماد؛ C: گروه انجماد + آنتی‌اکسیدان (اسپرم با سر سفید= زنده و اسپرم با سر قرمز یا صورتی= مرده)

جدول شماره 2: مقایسه میانگین درصد آسیب DNA اسپرم در گروه‌های مختلف بیماران آستنوزواسپرمی پس از انجماد و درمان با ان-استیل سیستئین (1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر)

بحث

تلاش برای قابلیت باروری اسپرم از حدود یک قرن پیش آغاز شده و همچنان ادامه دارد. یافته‌های مطالعه حاضر نشان دادند که در فرایند انجماد-ذوب، بروز استرس اکسیداتیو که ناشی از بر هم خوردن تعادل بین رادیکال‌های آزاد اکسیژن و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی مایع منی می‌باشد، ممکن است منجر به کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی مردان شود (5،19). استرس اکسیداتیو شامل: غلبه رادیکال‌های آزاد تولید شده نظیر رادیکال‌های هیدروکسیل، آنیون‌های سوپراکسید و پراکسید هیدروژن بر سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانتی در سلول‌ها می‌باشد (20). در مطالعه‌ حاضر گروه انجماد کاهش معنا‌داری را در میزان تحرک و تحرک پیشرونده نسبت به گروه کنترل نشان داد؛ در صورتی ‌‌که گروه درمان با ان-استیل سیستئین، بهبود قابل توجهی در میزان تحرک نسبت به گروه انجماد داشت. Michael در سال 2010 گزارش نمود که ان-استیل سیستئین اثر مثبتی بر تحرک اسپرم دارد (21). این یافته‌ها با نتایج مطالعه حاضر مطابقت دارند. در مطالعه‌ای که Oeda و همکاران در سال 1997 انجام دادند، بیان نمودند که تیمار با ان-استیل سیستئین در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) باعث افزایش پارامترهای اسپرمی از جمله افزایش میزان حرکت اسپرم‌ها و همچنین افزایش واکنش آکروزمی در اسپرم‌ها گردیده و پس از 20 دقیقه انکوباسیون با ان-استیل سیستئین، سطح ROS به طور معناداری کاهش یافته است (22). در پژوهش دیگری اثر ال-سیستئین بر اسپرم اسب در شرایط انجماد بررسی گشت و گزارش گردید که این اسید آمینه باعث بهبود پارامترهای کیفی اسب در طول ذخیره‌سازی در دمای 5 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت شد؛ به گونه‌ای که غلظت 200 مول بر لیتر آن سبب بهبود تحرک پیشرونده، حیات و یکپارچگی آکروزوم اسپرم گردید (13). از سوی دیگر، بررسی اثر آنتی‌اکسیدان‌های ویتامین  Eو سیستئین بر پارامترهای اسپرم بیانگر بهبود تحرک اسپرم و سلامت غشای پلاسمایی پس از انجماد می‌باشد (23). در مطالعه حاضر نتایج حاصل از ارزیابی مورفولوژی اسپرم‌های تیمار شده با ان-استیل سیستئین پس از فرایند انجماد-ذوب نشان دادند که در گروه انجماد، کاهش معنا‌داری در میانگین درصد اسپرم‌ها با مورفولوژی نرمال نسبت به گروه کنترل رخ داده است. مورفولوژی نرمال اسپرم در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، افزایش معنا‌داری را نسبت به گروه انجماد نشان داد. در طول روند انجماد-ذوب، آسیب به غشای سلول باعث نقص و تغییرات مورفولوژیکی و آسیب‌های ساختاری و عملکردی به اسپرم شده و در نتیجه موجب کاهش توان باروری اسپرم می‌شود. در مورد تأثیر ان-استیل سیستئین بر مورفولوژی نرمال اسپرم‌ها، مطالعات  In vivoوجود دارد که در جدیدترین آن‌ها نشان داده شده است که این آنتی‌اکسیدان می‌تواند باعث بهبود مورفولوژی اسپرم‌ها در بیماران آستنو تراتوزواسپرمی شود (24،25). جدا شدن سلول‌های زنده از مرده امر بسیار مهمی است که همواره مورد توجه محققان می‌باشد. به دلیل استرس‌های ناشی از ذوب و انجماد، همواره نگه داشتن تعداد سلول‌های زنده پس از این پدیده از نظر کلینیکی بسیار مهم می‌باشد؛ از این رو مطالعات متعددی با استفاده از آنتی‌اکسیدان‌های مختلف در مورد میزان زنده‌مانی اسپرم پس از انجماد و ذوب انجام شده‌اند و همواره محققان به ‌دنبال پیدا کردن راهی برای افزایش کیفیت اسپرم هستند (23). در این مطالعه میانگین درصد قابلیت حیات اسپرم در گروه انجماد نسبت به گروه کنترل کاهش معنا‌داری یافت. از سوی دیگر، قابلیت حیات اسپرم در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، افزایش معنا‌داری را نسبت به گروه انجماد نشان داد. در تأیید یافته‌های پژوهش حاضر، اسدپور و همکاران در سال 2013 نشان دادند که ان-استیل سیستئین می‌تواند در موش‌هایی که با استات سرب آلوده شده بودند، باعث افزایش معنادار تحرک و قدرت زنده ماندن اسپرم شود (26). در مطالعه خلیلی و همکاران (2010) اثر غلظت‌های مختلف اسیدهای آمینه سیستئین بر اسپرم قوچ مغانی در شرایط انجماد بررسی شد و مشاهده گردید که این اسید آمینه سبب بهبود قابل توجه حرکت پیشرونده اسپرم، حیات و یکپارچگی غشای آکروزوم اسپرم شده است (27). در پژوهش مذکور، میانگین درصد آسیب DNA در گروه انجماد + ان-استیل سیستئین، کاهش معنا‌داری نسبت به گروه انجماد داشت. در این راستا، در مطالعه‌ای که Lopes و همکاران در سال 1998 پیرامون اثربخشی ان-استیل سیستئین بر پارامترهای اسپرم انجام دادند، گزارش گردید که میزان آسیب به ROS در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) به میزان قابل توجهی کاهش یافته است که این امر را با کاهش در گونه‌های فعال اکسیژن (NOS) مرتبط دانستند (28)؛ بنابراین تصور می‌شود که استفاده از آنتی‌اکسیدان‌هایی مانند ان-استیل سیستئین بتواند باعث کاهش عوامل استرس‌زا مانند ROS و در نهایت کاهش آسیب DNA شود.

نتیجه‌گیری

نتیجه حاصل از این مطالعه بیانگر آن بودند که ان-استیل سیستئین به‌ عنوان یک آنتی‌اکسیدان بسیار قوی، دفاع مؤثری علیه رادیکال‌های آزاد داشته و سبب افزایش درصد تحرک کل، تحرک پیشرونده اسپرم، مورفولوژی نرمال، حیات سلول و کاهش فراگمانتاسیون DNA پس از فرایند انجماد-ذوب در افراد آستنوزواسپرمی می‌شود؛ بدین‌صورت که بر اسپرم انسان در برابر آسیب ناشی از واکنش پراکسیداسیون لیپیدی غشا که در
محیط‌های انجمادی اسپرم به وقوع می‌پیوندد، اثر حفاظتی دارد؛ بنابراین می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که اضافه نمودن این آنتی‌اکسیدان موجب بهبود عملکرد اسپرم می‌شود.

تشکر و قدردانی

بدین‌وسیله از کارکنان سخت‌کوش مرکز فوق تخصصی مرکز درمان ناباروری جهاد دانشگاهی قم که پژوهشگران را در انجام این مطالعه یاری نمودند، تشکر و قدردانی می‌گردد.