دوره 15، شماره 5 - ( مرداد 1400 )
جلد 15 شماره 5 صفحات 377-368 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Khazaei S, Soleimani M, Ahmaditafti S H, Hojati Z. Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Into Cardiac-like Cells by Co-induction of Lentiviruses Containing Mir-1 and Myocd in Chitosan Collagen Hydrogel Scaffold. Qom Univ Med Sci J 2021; 15 (5) :368-377
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3193-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3193-fa.html
خزائی سمانه، سلیمانی مسعود، احمدی تفتی سید حسین، حجتی زهره. تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه قلبی با انتقال همزمان لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و Myocd در داربست هیدروزلی کیتوزان/کلاژن. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1400; 15 (5) :368-377
سمانه خزائی1 
، مسعود سلیمانی2 ، سید حسین احمدی تفتی3 ، زهره حجتی* 4
، مسعود سلیمانی2 ، سید حسین احمدی تفتی3 ، زهره حجتی* 4
1- گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم و فناور یهای زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران.
2- گروه مهندسی بافت و خون شناسی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس،تهران، ایران.
3- مرکز تحقیقات فناور یهای پزشکی قلب و عروق، مرکز قلب تهران، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران.
4- گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم و فناور یهای زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران. ،z.hojati@sci.ui.ac.ir
2- گروه مهندسی بافت و خون شناسی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس،تهران، ایران.
3- مرکز تحقیقات فناور یهای پزشکی قلب و عروق، مرکز قلب تهران، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران.
4- گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم و فناور یهای زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران. ،
متن کامل [PDF 7223 kb]
(655 دریافت)
| چکیده (HTML) (2045 مشاهده)
متن کامل: (1272 مشاهده)
مقدمه
بیماری‌های قلبی‌عروقی دلیل اصلی مرگ‌و‌میر در جهان است [۱]. در دهه‌های اخیر پیشرفت‌های چشمگیری در تکنیک‌های جراحی و درمان‌های دارویی حاصل شده است. با وجود این، بیماری‌های قلبی‌عروقی همچنان دلیل اصلی نارسایی قلبی در سراسر جهان است [۲]. به همین دلیل اتخاذ روش‌های نوین مانند رویکرد‌های بازسازی‌کننده قلب و درمان‌های مبتنی بر سلول ضروری به نظر می‌رسد [۳]. در میان منابع سلولی، سلولهای بنیادی مزانشیمی به دلیل خواص منحصر‌به‌فرد از جمله اثرات پاراکراین، تعدیل سیستم ایمنی، ایمنی‌زایی کم و توانایی تمایز به چندین رده سلولی مانند کاردیومیوسیت به طور گسترده‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرند [۴]. سلولهای بنیادی مزانشیمی در منابع مختلفی مانند مغز استخوان، جفت، خون بند ناف و بافت چربی یافت می‌شوند. در این میان سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی دارای مزایای متعددی از جمله قابلیت دسترسی، برداشت آسان و عوارض کم هستند. اخیراً استراتژی‌های ترکیبی مانند القای ژنتیکی و استفاده از مواد بیولوژیکی برای افزایش اثربخشی درمانی سلولهای بنیادی مزانشیمی ایجاد شده است [۵].
در چندین مطالعه با استفاده از القای ژنتیکی، سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌کاردیومیوسیت القاشده (iCM) تمایز یافته‌اند که در همین راستا از ژن‌ها و microRNAهای مختلف استفاده میشود [7 ،6]. در مطالعات مختلف نشان داده شده است که miRNAهای مختلفی در کاردیومیوژنز نقش دارند که به miRNAهای قلبی معروف هستند، مانند miR-133 ، miR-499 وmiR-1 [۸]. miR-1یکی از miRNAهایی است که با القای بیان ژن‌های Gata4 و Nkx2-5 و فعال کردن مسیر سیگنالینگ Wnt/β-Catenin باعث تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌قلبی میشود [۹]. در تمایز عضلانی، فاکتور پاسخ سرم (SRF) به عنوان فعال‌کننده ژن‌های عضلانی از جمله miR-1 عمل می‌کند. با این حال نشان داده شده که SRF یک فعال‌کننده ضعیف است که برای عملکرد بهتر به یک فعال‌کننده دیگر به نام میوکاردین وابسته است. بدین ترتیب SRF و MyoCD با اتصال به توالی‌های تقویت‌کننده miR-1 بیان آن را به صورت هم‌افزایی افزایش می‌دهند [۱۰].
علی‌رغم پیشرفت‌های فراوان در القای ژنتیکی سلولهای بنیادی مزانشیمی و تمایز آن‌ها به سلولهای شبه‌قلبی، این سلول‌ها در درمان مبتنی بر سلول به اندازه کافی مؤثر نیستند. زیرا کاردیومیوسیت‌های مشتق‌شده از سلولهای بنیادی مزانشیمی در یک محیط دوبعدی به صورت نابالغ بوده و فنوتیپی مشابه فنوتیپ کاردیومیوسیت جنینی به جای کاردیومیوسیت بالغ دارند [۱۱]. بنابراین در بسیاری از مطالعات از کشت سه‌بعدی برای بهبود شرایط تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی استفاده شده است. مانند استفاده از داربست پلیمری، ماتریکس خارج سلولی دسلولارشده و هیدروژل‌های مختلف [13 ،12]. هیدروژل‌ها به عنوان اولین ماده زیستی متورم در آب که در مهندسی بافت استفاده میشود می‌توانند یک ساختار سه‌بعدی ایجاد کنند. کیتوزان یکی از مواد پرکاربرد در هیدروژل‌هاست که به دلیل داشتن بار مثبت دارای ویژگی هایی مانند تجزیه بیولوژیکی، سازگاری زیستی، آب‌دوستی، غیر‌سمی بودن و مقاومت فشاری است. در مطالعات مختلف از کیتوزان به عنوان حامل سلول استفاده شده است که باعث بهبود شرایط تمایز، افزایش قدرت زنده‌مانی سلول‌ها و بهبود عملکرد قلب در مدل رت دارای انفارکتوس پس از پیوند به ناحیه آسیب‌دیده شده است [۱۴]. یکی دیگر از راهکار‌های مورد‌استفاده در مهندسی بافت، استفاده از هیدروژل‌های ترکیبی است. هیدروژل کیتوزان / کلاژن یکی از پرکاربردترین هیدروژل‌های ترکیبی برای بهبود تمایز و بازسازی سلولهای قلبی است [۱۵]. کلاژن یکی از اجزای اصلی ماتریکس خارج‌سلولی است که باعث تقویت مقاومت کششی در دیواره قلب میشود. کلاژن باعث بقا، تکثیر و چسبندگی سلول میشود. این در صورتی است که کلاژن دارای سرعت تجزیه‌پذیری بالا با مقاومت مکانیکی ضعیف است. با وجود این به علت پایداری مکانیکی و بار مثبت کیتوزان ترکیب کیتوزان / کلاژن باعث بهبود قدرت مکانیکی و کاهش میزان تخریب‌پذیری کلاژن میشود [۱۶]. بنابراین در مطالعه حاضر سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی موش به طور همزمان با لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD ترانسداکت شد و تمایز آن در محیط دوبعدی و سه‌بعدی با یکدیگر مقایسه شد.
روش بررسی
به منظور بررسی تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌قلبی با القای ژنتیکی، لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD به طور جداگانه ساخته شد. به این صورت که ابتدا سلول HEK293T به روش کلسیم فسفات با وکتور‌های miR-1 و MyoCD و وکتور‌های کمکی به نام‌های psPAX2 و pMD ترانسفکت شدند. مواد لازم برای ترانسفکت شامل بافر HEPES، کلسیم کلراید (۵/۲ میلی مولار) و آب استریل است. محیط سلول‌ها در زمان ترانسفکت High glucose DMEM با FBS 5% و فاقد آنتی‌بیوتیک است. نسبت وکتور‌های miR-1 ،psPAX2 و pMD به ترتیب ۱:۳:۳ است. همچنین از وکتور فاقد توالی اینسرت‌شده به عنوان کنترل استفاده شد. سپس هر ۱۲ ساعت یک بار و به مدت ۳ روز مایع رویی سلول‌ها که حاوی ویروس‌های مد نظر است، جمع‌آوری شد و در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. برای تغلیظ ویروس‌های جمع‌آوری‌شده از اولتراسانتریفوژ یخچال‌دار با دور ۴۰ هزار g و به مدت ۲ ساعت استفاده شد. پس از ساخت ویروس، هیدروژل ترکیبی کیتوزان /کلاژن با کمک بتا گلیسرول فسفات (5/ 7درصد) به عنوان کراس لینکر ساخته شد [17] و تست‌های تورم و قدرت زنده‌مانی سلول‌ها در محیط هیدروژلی انجام شد. پس از اتمام مراحل ساخت ویروس و بعد از آن هیدروژل، سلولهای بنیادی مزانشیمی از بافت چربی موش با روش آنزیمی طبق پروتکل جداسازی شد [18]. به منظور تأیید هویت سلولهای جداسازی‌شده تست فلوسایتومتری برای مارکر‌های سطحی CD73، CD90 و CD105 (مارکر‌های اختصاصی سلولهای بنیادی مزانشیمی) و عدم بیان CD45 (مارکر اختصاصی سلولهای خونی) انجام شد. همچنین سلولهای جدا‌شده در محیط‌های اختصاصی قرار گرفته وتوانایی تمایزشان به سلولهای چربی و استخوان به ترتیب با رنگ‌آمیزی Oil Red O و Alizarin Red سنجیده شد (داده‌ها نشان داده نشده است). سلولهای جدا‌شده در پایان پاساژ ۳ در پلیت‌های ۱۲خانه سید‌شده و با ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD ترانسداکت شدند. ۴۸ ساعت پس از ترانسداکشن، سلولهای GFP مثبت با کمک میکروسکوپ فلئورسنت و فلوسایتومتری ارزیابی شدند. میزان افزایش بیان miR-1 و MyoCD در سلولهای ترانسداکت‌شده با روش qRT-PCR سنجیده شد. ۳ روز پس از ترانسداکشن، سلول‌ها از پلیت جدا شده و در هیدروژل کیتوزان / کلاژن اینکپسوله شدند. روش کار به این صورت بود که پس از تریپسینه کردن سلولهای ترانسداکت‌شده، این سلول‌ها به همراه هیدروژل کیتوزان / کلاژن به چاهک‌های پلیت ۱۲خانه منتقل شده و به منظور ایجاد ژل، NaHCO3 اشباع‌شده به مخلوط سلول هیدروژل اضافه شده و به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه در انکوباتور قرار داده شدند. پس از پایان ۱۵ دقیقه، محیط کشت به سطح چاهک‌ها اضافه شد و در سه گروه مختلف به مدت ۷ روز، ۱۴ روز و ۲۱ روز در انکوباتور حاوی ۵ CO2 درصد نگهداری شدند. همچنین سلولهای ترانسداکت‌شده با لنتی ویروس حاوی miR-1 و MyoCD در محیط دوبعدی به عنوان گروه کنترل استفاده شد. پس از پایان هرکدام از زمان‌های تعیین‌شده در گروه‌های مختلف، سلولهای هر گروه برای انجام تست qRT-PCR و ایمونوسیتوشیمی [19] جمع‌آوری شدند. برای انجام qRT-PCR سلول‌ها به کمک ترایزول لیز شده و استخراج RNA طبق پروتکل انجام شد [20]. RNAهای استخراج‌شده به صورت کیفی با بردن روی ژل آگاروز 1 درصد و به صورت کمی با دستگاه نانودراپ سنجیده شد. سپس با توجه به دستورالعمل کیت (Takara, Korea) سنتز CDNA انجام شد. پرایمر‌های اختصاصی برای ژن‌های Nkx2-5، Gata4 و Tnnt2 به کمک Gene runner و UCSC genome browser طراحی و به صورت آنلاین با NCBI blast به منظور اختصاصی بودن برای اتصال به نواحی مدنظر، ارزیابی شد. توالی پرایمرها در جدول شماره ۱ آورده شده است. تست PCRqRT- در حجم 20 لاندا انجام شد که شامل 10 λ مستر میکس، 1 λ CDNA، 1 λ پرایمر میکس Forward و Reverse و 8 λ آب استریل بود. سپس با استفاده دستگاه Applied Biosystems 7500real time PCR بیان هرکدام از ژن‌ها به صورت کمی سنجیده شد. برنامه زمانی داده‌شده به دستگاه به صورت ۹۵ درجه ابتدایی ۱۵ دقیقه و ۴۰ سیکل به صورت دو‌مرحله‌ای شامل ۹۵ درجه ۵ ثانیه و ۶۰ درجه ۳۰ ثانیه تنظیم شد. در این آزمایش از ژن U6 و Gapdh به ترتیب به عنوان کنترل داخلی برای نرمالیزه کردن بیان miRNA و ژن‌های مورد‌مطالعه استفاده شد. همچنین از روش 2^-ΔΔCt برای آنالیز داده‌های qRT-PCR استفاده شد. برای بیان پروتئین مارکر‌های قلبی ذکر‌شده، تست ایمونوسیتوشیمی به کمک آنتی‌بادی‌های ضد NKX2-5 ،GATA و cTnT با آنتی‌بادی ثانویه کانژوگه با FITC طبق پروتکل انجام شد و نتایج با کمک میکروسکوپ فلئورسنت (Olympus, Japan) ارزیابی شد.
تحلیل آماری
داده‌های کمی به صورت میانگین و انحراف معیار با حداقل سه تکرار برای هر آزمایش ارائه شد. اختلاف معنادار بین گروه‌های آزمایش و کنترل با استفاده از آزمون‌های آماری تی تست و آنووا و با استفاده از نرم‌افزار Prism Graphpad نسخه 9، انجام شد. سطح معناداری در تمام آزمون‌ها 05/≤0 در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
پس از ساخت ویروس و جداسازی سلولهای بنیادی مزانشیمی از بافت چربی موش، این سلول‌ها با مقادیر مناسب از ویروس ترانسداکت‌شده و میزان سلولهای GFP مثبت با روش فلوسایتومتری ارزیابی شد. افزایش بیان miR-1 و MyoCD در سلولهای مزانشیمی ترانسداکت‌شده با ویروس‌های miR-1 و MyoCD به ترتیب ۸۸ برابر و ۴۳ برابر نسبت به گروه کنترل است (تصویر شماره 1 الف). همچنین همان‌طور که در تصویر شماره 1 ب مشخص است، حدود ۷۰ درصد از سلولهای ترانسداکت شده GFP مثبت هستند.
نمودار‌های مربوط به تست تورم در تصویر شماره 2 الف و زنده‌مانی سلول‌ها در تصویر شماره 2 ب نشان داده شده است. طبق نمودار تورم میتوان نتیجه گرفت ترکیب هیدروژل کیتوزان /کلاژن دارای قدرت جذب آب مناسب است و در صورت قرارگیری در محیط آبی ساختار ژل از بین نمیرود. همچنین طبق نمودار نرخ تورم در کیتوزان خالص بیشتر از هیدروژل کیتوزان / کلاژن است، زیرا کیتوزان خالص نسبت به کیتوزان / کلاژن خاصیت آب‌دوستی بیشتری دارد. علاوه بر این ترکیب هیدروژل کیتوزان /کلاژن برای سلول‌ها سمی نبوده و سلول‌ها قادر به رشد و زنده ماندن در این محیط پس از ۱۴ روز هستند. انحراف معیار با حداقل سه تکرار است. سطح معناداری 05/≤0 در نظر گرفته شد.
پس از ارزیابی صحت کارایی ویروس‌های ساخته‌شده در توانایی ترانسداکت کردن سلولهای بنیادی مزانشیمی که با روش فلوسایتومتری تأیید شد و همچنین سمی نبودن ترکیب هیدروژل ساخته‌شده، ابتدا سلولهای مزانشیمی توسط لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD ترانسداکت شده و سپس در هیدروژل اینکپسوله شده و نهایتاً پس از پایان زمان‌های تعیین‌شده تست‌های مربوطه انجام شد. با انجام تست qRT-PCR برای سلول‌ها در گروه‌های مختلف مشخص شد که بیان مارکر‌های قلبی در محیط سه‌بعدی نسبت به محیط دوبعدی به طور معناداری افزایش یافته است. به طوری که بر اساس تست qRT-PCR بیان ژن‌های Nkx2-5 ، Gata4 و Tnnt2 در گروه سه‌بعدی در هر سه زمان 7 روز، 14 روز و 21 روز نسبت به گروه دو بعدی به طور معناداری افزایش بیان نشان می‌دهد (تصویر شماره 3 الف). همچنین نتایج حاصل از ایمونوسیتوشیمی تأییدکننده نتایج qRT-PCR است. به این صورت که بیان پروتئین مارکر‌های قلبی در محیط سه‌بعدی نسبت به دوبعدی افزایش دارد (تصویر شماره 3 ب).
بحث
miRNAها به عنوان تنظیم کننده در فرایند‌های زیستی مانند تمایز، تکثیر و تکامل در نظر گرفته می‌شوند. همچنین آن‌ها نقش مهمی در کاردیوژنز دارند [۱۷]. در میان miRNAهای ویژه قلبی miR-1 با هدف قرار دادن مسیر‌های سیگنالینگ مختلف از جمله مسیر Wnt/β-catenin در مراحل اولیه رشد قلب نقش دارد [۹]. مطالعات مختلف نشان داده است که miR-1 در بیان مارکر‌های ویژه قلبی از جمله Nkx2-5 ،Gata4 و Tnnt2 نقش ویژه‌ای دارد. همچنین مشخص شده است که افزایش بیان miR-1 در سلولهای بنیادی مزانشیمی سبب تمایز این سلول‌ها به سلولهای شبه‌قلبی میشود [۱۸]. علاوه بر این، ژانگ و همکاران نشان داده‌ند که القای همزمان miR-1 و MyoCD سبب بهبود تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌قلبی میشود. بنابراین به دلیل اثر هم‌افزایی فاکتور MyoCD بر عملکرد miR-1 و بهبود تمایز به سمت سلولهای شبه‌قلبی، در این مطالعه سلولهای بنیادی مزانشیمی به صورت همزمان با لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD القا شدند [۱۹].
در گذشته بیشتر مطالعات مرتبط با فرایند تمایز در کشت دوبعدی بررسی می‌شد، اما به دلیل مزایای متعدد محیط سه‌بعدی نسبت به محیط دوبعدی، مطالعات زیادی در این راستا انجام شده است. در کشت سه‌بعدی سلول‌ها علاوه بر تعامل با یکدیگر با ماتریکس خارج سلولی نیز ارتباط دارند. در حالی که در کشت دوبعدی سلول‌ها فقط با سلولهای اطراف خود ارتباط برقرار می‌کنند. علاوه بر این، نیرو‌های مکانیکی بین سلول سلول و محیط سلول در کشت سه‌بعدی مجموعه‌ای از سیگنال‌ها را تنظیم کرده که عملکرد‌های مختلف سلولی از قبیل تکثیر، تمایز و مهاجرت را تنظیم می‌کند. علاوه بر این، ساختار و سازمان‌دهی سلول‌ها در کشت سه‌بعدی در مقایسه با کشت دوبعدی تغییر می‌کند که بر عملکرد و سیگنالینگ سلول‌ها مؤثر است [۲۰]. بنابراین میتوان نتیجه گرفت رفتار‌های سلولی در کشت سه‌بعدی با کشت دوبعدی کاملاً متفاوت است. مجموعه این ویژگی‌ها سبب بهبود شرایط تمایز سلول‌ها از جمله تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌قلبی میشود [۲۱]. در مهندسی بافت قلب از هیدروژل‌های مختلفی استفاده میشود که کیتوزان و کلاژن یکی از پرکاربردترین آن‌هاست. کیتوزان به عنوان یک پلی‌ساکارید زیست‌سازگار به دلیل فعالیت آنتی‌اکسیدانی و عدم ایمنی‌زایی غالباً در مهندسی بافت استفاده میشود. مطالعات نشان داده است که کیتوزان به عنوان یک داربست هیدروژلی در ترکیب با سلولهای بنیادی مزانشیمی می‌تواند عملکرد قلب را در مدل‌های انفارکتوس موش صحرایی بهبود بخشد [۲۲]. همچنین کلاژن، چسبندگی سلول را با گیرنده‌های اینتگرین تسهیل می‌کند و به این ترتیب مسیر‌های سیگنال‌دهی را فعال کرده که به نوبه خود بقا، تکثیر و تمایز سلول را تنظیم می‌کند [19]. بنابراین در صورت ترکیب با کیتوزان کارایی تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌قلبی بهبود می‌یابد. به این صورت که شبکه هیدروژلی یکپارچه متخلخل کیتوزان / کلاژن یک ریزمحیط مناسب برای تکثیر و تمایز سلول از طریق نفوذپذیری مواد مغذی و مولکول‌های بیولوژیکی و توسعه مسیر سیگنالینگ در میان سلولهای اینکپسوله در هیدروژل فراهم کرده است [20]. در مطالعه حاضر سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی موش با لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD به طور همزمان ترانسداکت شده و پس از سه روز، سلولهای القاشده در هیدروژل کیتوزان / کلاژن قرار گرفتند. نتایج حاصل از تست‌های in vitro نشان داد بیان مارکر‌های قلبی در سطح ژن و پروتئین در سلولهای اینکپسوله‌شده در هیدروژل در مقایسه با سلولهای موجود در کشت دوبعدی به طور معناداری افزایش پیدا کرده است. با وجود اینکه بیان ژن‌ها در محیط سه‌بعدی نسبت به محیط دوبعدی افزایش معناداری نشان می‌دهد، اما با توجه به اینکه Gata4 یک مارکر اولیه و Tnnt2 یک مارکر ثانویه در تمایز سلولهای قلبی است، الگوی بیانی این دو ژن در روز‌های مختلف تمایز متفاوت است.
این نتایج نشان‌دهنده تأثیر مثبت کشت سه‌بعدی بر بهبود تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سمت سلولهای شبه‌قلبی است.
نتیجه‌گیری
نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که القای همزمان miR-1 و MyoCD در سلولهای بنیادی مزانشیمی و به دنبال آن کشت در محیط هیدروژل حاوی کیتوزان / کلاژن منجر به تمایز بیشتر سلول‌ا به سمت سلولهای شبه‌قلبی میشود. این یافته‌ها اهمیت کشت سه‌بعدی در تمایز سلولهای بنیادی را نشان می‌دهد. بنابراین در مطالعات آینده میتوان با بهبود شرایط تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی و به دنبال آن به دست آوردن سلولهای قلبی بالغ، شاهد پیشرفت‌هایی در بازسازی قلب مبتنی بر سلول‌درمانی باشیم.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
تمام آزمایشات حیوانی بر اساس دستورالعمل‌های مورد تأیید مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی و کمیته اخلاق دانشگاه تربیت‌مدرس انجام شد (کد اخلاق: 125.IR.MODARES.REC.1398).
حامی مالی
این تحقیق هیچ‌گونه کمک مالی از سازمان‌های تأمین مالی در بخش‌های عمومی، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش همه بخش‌های پژوهش حاضر مشارکت داشته‌اند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله از دانشگاه تربیت‌مدرس، دانشگاه اصفهان و مرکز قلب تهران کمال تشکر و قدردانی را دارند.
بیماری‌های قلبی‌عروقی دلیل اصلی مرگ‌و‌میر در جهان است [۱]. در دهه‌های اخیر پیشرفت‌های چشمگیری در تکنیک‌های جراحی و درمان‌های دارویی حاصل شده است. با وجود این، بیماری‌های قلبی‌عروقی همچنان دلیل اصلی نارسایی قلبی در سراسر جهان است [۲]. به همین دلیل اتخاذ روش‌های نوین مانند رویکرد‌های بازسازی‌کننده قلب و درمان‌های مبتنی بر سلول ضروری به نظر می‌رسد [۳]. در میان منابع سلولی، سلولهای بنیادی مزانشیمی به دلیل خواص منحصر‌به‌فرد از جمله اثرات پاراکراین، تعدیل سیستم ایمنی، ایمنی‌زایی کم و توانایی تمایز به چندین رده سلولی مانند کاردیومیوسیت به طور گسترده‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرند [۴]. سلولهای بنیادی مزانشیمی در منابع مختلفی مانند مغز استخوان، جفت، خون بند ناف و بافت چربی یافت می‌شوند. در این میان سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی دارای مزایای متعددی از جمله قابلیت دسترسی، برداشت آسان و عوارض کم هستند. اخیراً استراتژی‌های ترکیبی مانند القای ژنتیکی و استفاده از مواد بیولوژیکی برای افزایش اثربخشی درمانی سلولهای بنیادی مزانشیمی ایجاد شده است [۵].
در چندین مطالعه با استفاده از القای ژنتیکی، سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌کاردیومیوسیت القاشده (iCM) تمایز یافته‌اند که در همین راستا از ژن‌ها و microRNAهای مختلف استفاده میشود [7 ،6]. در مطالعات مختلف نشان داده شده است که miRNAهای مختلفی در کاردیومیوژنز نقش دارند که به miRNAهای قلبی معروف هستند، مانند miR-133 ، miR-499 وmiR-1 [۸]. miR-1یکی از miRNAهایی است که با القای بیان ژن‌های Gata4 و Nkx2-5 و فعال کردن مسیر سیگنالینگ Wnt/β-Catenin باعث تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌قلبی میشود [۹]. در تمایز عضلانی، فاکتور پاسخ سرم (SRF) به عنوان فعال‌کننده ژن‌های عضلانی از جمله miR-1 عمل می‌کند. با این حال نشان داده شده که SRF یک فعال‌کننده ضعیف است که برای عملکرد بهتر به یک فعال‌کننده دیگر به نام میوکاردین وابسته است. بدین ترتیب SRF و MyoCD با اتصال به توالی‌های تقویت‌کننده miR-1 بیان آن را به صورت هم‌افزایی افزایش می‌دهند [۱۰].
علی‌رغم پیشرفت‌های فراوان در القای ژنتیکی سلولهای بنیادی مزانشیمی و تمایز آن‌ها به سلولهای شبه‌قلبی، این سلول‌ها در درمان مبتنی بر سلول به اندازه کافی مؤثر نیستند. زیرا کاردیومیوسیت‌های مشتق‌شده از سلولهای بنیادی مزانشیمی در یک محیط دوبعدی به صورت نابالغ بوده و فنوتیپی مشابه فنوتیپ کاردیومیوسیت جنینی به جای کاردیومیوسیت بالغ دارند [۱۱]. بنابراین در بسیاری از مطالعات از کشت سه‌بعدی برای بهبود شرایط تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی استفاده شده است. مانند استفاده از داربست پلیمری، ماتریکس خارج سلولی دسلولارشده و هیدروژل‌های مختلف [13 ،12]. هیدروژل‌ها به عنوان اولین ماده زیستی متورم در آب که در مهندسی بافت استفاده میشود می‌توانند یک ساختار سه‌بعدی ایجاد کنند. کیتوزان یکی از مواد پرکاربرد در هیدروژل‌هاست که به دلیل داشتن بار مثبت دارای ویژگی هایی مانند تجزیه بیولوژیکی، سازگاری زیستی، آب‌دوستی، غیر‌سمی بودن و مقاومت فشاری است. در مطالعات مختلف از کیتوزان به عنوان حامل سلول استفاده شده است که باعث بهبود شرایط تمایز، افزایش قدرت زنده‌مانی سلول‌ها و بهبود عملکرد قلب در مدل رت دارای انفارکتوس پس از پیوند به ناحیه آسیب‌دیده شده است [۱۴]. یکی دیگر از راهکار‌های مورد‌استفاده در مهندسی بافت، استفاده از هیدروژل‌های ترکیبی است. هیدروژل کیتوزان / کلاژن یکی از پرکاربردترین هیدروژل‌های ترکیبی برای بهبود تمایز و بازسازی سلولهای قلبی است [۱۵]. کلاژن یکی از اجزای اصلی ماتریکس خارج‌سلولی است که باعث تقویت مقاومت کششی در دیواره قلب میشود. کلاژن باعث بقا، تکثیر و چسبندگی سلول میشود. این در صورتی است که کلاژن دارای سرعت تجزیه‌پذیری بالا با مقاومت مکانیکی ضعیف است. با وجود این به علت پایداری مکانیکی و بار مثبت کیتوزان ترکیب کیتوزان / کلاژن باعث بهبود قدرت مکانیکی و کاهش میزان تخریب‌پذیری کلاژن میشود [۱۶]. بنابراین در مطالعه حاضر سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی موش به طور همزمان با لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD ترانسداکت شد و تمایز آن در محیط دوبعدی و سه‌بعدی با یکدیگر مقایسه شد.
روش بررسی
به منظور بررسی تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌قلبی با القای ژنتیکی، لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD به طور جداگانه ساخته شد. به این صورت که ابتدا سلول HEK293T به روش کلسیم فسفات با وکتور‌های miR-1 و MyoCD و وکتور‌های کمکی به نام‌های psPAX2 و pMD ترانسفکت شدند. مواد لازم برای ترانسفکت شامل بافر HEPES، کلسیم کلراید (۵/۲ میلی مولار) و آب استریل است. محیط سلول‌ها در زمان ترانسفکت High glucose DMEM با FBS 5% و فاقد آنتی‌بیوتیک است. نسبت وکتور‌های miR-1 ،psPAX2 و pMD به ترتیب ۱:۳:۳ است. همچنین از وکتور فاقد توالی اینسرت‌شده به عنوان کنترل استفاده شد. سپس هر ۱۲ ساعت یک بار و به مدت ۳ روز مایع رویی سلول‌ها که حاوی ویروس‌های مد نظر است، جمع‌آوری شد و در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. برای تغلیظ ویروس‌های جمع‌آوری‌شده از اولتراسانتریفوژ یخچال‌دار با دور ۴۰ هزار g و به مدت ۲ ساعت استفاده شد. پس از ساخت ویروس، هیدروژل ترکیبی کیتوزان /کلاژن با کمک بتا گلیسرول فسفات (5/ 7درصد) به عنوان کراس لینکر ساخته شد [17] و تست‌های تورم و قدرت زنده‌مانی سلول‌ها در محیط هیدروژلی انجام شد. پس از اتمام مراحل ساخت ویروس و بعد از آن هیدروژل، سلولهای بنیادی مزانشیمی از بافت چربی موش با روش آنزیمی طبق پروتکل جداسازی شد [18]. به منظور تأیید هویت سلولهای جداسازی‌شده تست فلوسایتومتری برای مارکر‌های سطحی CD73، CD90 و CD105 (مارکر‌های اختصاصی سلولهای بنیادی مزانشیمی) و عدم بیان CD45 (مارکر اختصاصی سلولهای خونی) انجام شد. همچنین سلولهای جدا‌شده در محیط‌های اختصاصی قرار گرفته وتوانایی تمایزشان به سلولهای چربی و استخوان به ترتیب با رنگ‌آمیزی Oil Red O و Alizarin Red سنجیده شد (داده‌ها نشان داده نشده است). سلولهای جدا‌شده در پایان پاساژ ۳ در پلیت‌های ۱۲خانه سید‌شده و با ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD ترانسداکت شدند. ۴۸ ساعت پس از ترانسداکشن، سلولهای GFP مثبت با کمک میکروسکوپ فلئورسنت و فلوسایتومتری ارزیابی شدند. میزان افزایش بیان miR-1 و MyoCD در سلولهای ترانسداکت‌شده با روش qRT-PCR سنجیده شد. ۳ روز پس از ترانسداکشن، سلول‌ها از پلیت جدا شده و در هیدروژل کیتوزان / کلاژن اینکپسوله شدند. روش کار به این صورت بود که پس از تریپسینه کردن سلولهای ترانسداکت‌شده، این سلول‌ها به همراه هیدروژل کیتوزان / کلاژن به چاهک‌های پلیت ۱۲خانه منتقل شده و به منظور ایجاد ژل، NaHCO3 اشباع‌شده به مخلوط سلول هیدروژل اضافه شده و به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه در انکوباتور قرار داده شدند. پس از پایان ۱۵ دقیقه، محیط کشت به سطح چاهک‌ها اضافه شد و در سه گروه مختلف به مدت ۷ روز، ۱۴ روز و ۲۱ روز در انکوباتور حاوی ۵ CO2 درصد نگهداری شدند. همچنین سلولهای ترانسداکت‌شده با لنتی ویروس حاوی miR-1 و MyoCD در محیط دوبعدی به عنوان گروه کنترل استفاده شد. پس از پایان هرکدام از زمان‌های تعیین‌شده در گروه‌های مختلف، سلولهای هر گروه برای انجام تست qRT-PCR و ایمونوسیتوشیمی [19] جمع‌آوری شدند. برای انجام qRT-PCR سلول‌ها به کمک ترایزول لیز شده و استخراج RNA طبق پروتکل انجام شد [20]. RNAهای استخراج‌شده به صورت کیفی با بردن روی ژل آگاروز 1 درصد و به صورت کمی با دستگاه نانودراپ سنجیده شد. سپس با توجه به دستورالعمل کیت (Takara, Korea) سنتز CDNA انجام شد. پرایمر‌های اختصاصی برای ژن‌های Nkx2-5، Gata4 و Tnnt2 به کمک Gene runner و UCSC genome browser طراحی و به صورت آنلاین با NCBI blast به منظور اختصاصی بودن برای اتصال به نواحی مدنظر، ارزیابی شد. توالی پرایمرها در جدول شماره ۱ آورده شده است. تست PCRqRT- در حجم 20 لاندا انجام شد که شامل 10 λ مستر میکس، 1 λ CDNA، 1 λ پرایمر میکس Forward و Reverse و 8 λ آب استریل بود. سپس با استفاده دستگاه Applied Biosystems 7500real time PCR بیان هرکدام از ژن‌ها به صورت کمی سنجیده شد. برنامه زمانی داده‌شده به دستگاه به صورت ۹۵ درجه ابتدایی ۱۵ دقیقه و ۴۰ سیکل به صورت دو‌مرحله‌ای شامل ۹۵ درجه ۵ ثانیه و ۶۰ درجه ۳۰ ثانیه تنظیم شد. در این آزمایش از ژن U6 و Gapdh به ترتیب به عنوان کنترل داخلی برای نرمالیزه کردن بیان miRNA و ژن‌های مورد‌مطالعه استفاده شد. همچنین از روش 2^-ΔΔCt برای آنالیز داده‌های qRT-PCR استفاده شد. برای بیان پروتئین مارکر‌های قلبی ذکر‌شده، تست ایمونوسیتوشیمی به کمک آنتی‌بادی‌های ضد NKX2-5 ،GATA و cTnT با آنتی‌بادی ثانویه کانژوگه با FITC طبق پروتکل انجام شد و نتایج با کمک میکروسکوپ فلئورسنت (Olympus, Japan) ارزیابی شد.
تحلیل آماری
داده‌های کمی به صورت میانگین و انحراف معیار با حداقل سه تکرار برای هر آزمایش ارائه شد. اختلاف معنادار بین گروه‌های آزمایش و کنترل با استفاده از آزمون‌های آماری تی تست و آنووا و با استفاده از نرم‌افزار Prism Graphpad نسخه 9، انجام شد. سطح معناداری در تمام آزمون‌ها 05/≤0 در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
پس از ساخت ویروس و جداسازی سلولهای بنیادی مزانشیمی از بافت چربی موش، این سلول‌ها با مقادیر مناسب از ویروس ترانسداکت‌شده و میزان سلولهای GFP مثبت با روش فلوسایتومتری ارزیابی شد. افزایش بیان miR-1 و MyoCD در سلولهای مزانشیمی ترانسداکت‌شده با ویروس‌های miR-1 و MyoCD به ترتیب ۸۸ برابر و ۴۳ برابر نسبت به گروه کنترل است (تصویر شماره 1 الف). همچنین همان‌طور که در تصویر شماره 1 ب مشخص است، حدود ۷۰ درصد از سلولهای ترانسداکت شده GFP مثبت هستند.
نمودار‌های مربوط به تست تورم در تصویر شماره 2 الف و زنده‌مانی سلول‌ها در تصویر شماره 2 ب نشان داده شده است. طبق نمودار تورم میتوان نتیجه گرفت ترکیب هیدروژل کیتوزان /کلاژن دارای قدرت جذب آب مناسب است و در صورت قرارگیری در محیط آبی ساختار ژل از بین نمیرود. همچنین طبق نمودار نرخ تورم در کیتوزان خالص بیشتر از هیدروژل کیتوزان / کلاژن است، زیرا کیتوزان خالص نسبت به کیتوزان / کلاژن خاصیت آب‌دوستی بیشتری دارد. علاوه بر این ترکیب هیدروژل کیتوزان /کلاژن برای سلول‌ها سمی نبوده و سلول‌ها قادر به رشد و زنده ماندن در این محیط پس از ۱۴ روز هستند. انحراف معیار با حداقل سه تکرار است. سطح معناداری 05/≤0 در نظر گرفته شد.
پس از ارزیابی صحت کارایی ویروس‌های ساخته‌شده در توانایی ترانسداکت کردن سلولهای بنیادی مزانشیمی که با روش فلوسایتومتری تأیید شد و همچنین سمی نبودن ترکیب هیدروژل ساخته‌شده، ابتدا سلولهای مزانشیمی توسط لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD ترانسداکت شده و سپس در هیدروژل اینکپسوله شده و نهایتاً پس از پایان زمان‌های تعیین‌شده تست‌های مربوطه انجام شد. با انجام تست qRT-PCR برای سلول‌ها در گروه‌های مختلف مشخص شد که بیان مارکر‌های قلبی در محیط سه‌بعدی نسبت به محیط دوبعدی به طور معناداری افزایش یافته است. به طوری که بر اساس تست qRT-PCR بیان ژن‌های Nkx2-5 ، Gata4 و Tnnt2 در گروه سه‌بعدی در هر سه زمان 7 روز، 14 روز و 21 روز نسبت به گروه دو بعدی به طور معناداری افزایش بیان نشان می‌دهد (تصویر شماره 3 الف). همچنین نتایج حاصل از ایمونوسیتوشیمی تأییدکننده نتایج qRT-PCR است. به این صورت که بیان پروتئین مارکر‌های قلبی در محیط سه‌بعدی نسبت به دوبعدی افزایش دارد (تصویر شماره 3 ب).
بحث
miRNAها به عنوان تنظیم کننده در فرایند‌های زیستی مانند تمایز، تکثیر و تکامل در نظر گرفته می‌شوند. همچنین آن‌ها نقش مهمی در کاردیوژنز دارند [۱۷]. در میان miRNAهای ویژه قلبی miR-1 با هدف قرار دادن مسیر‌های سیگنالینگ مختلف از جمله مسیر Wnt/β-catenin در مراحل اولیه رشد قلب نقش دارد [۹]. مطالعات مختلف نشان داده است که miR-1 در بیان مارکر‌های ویژه قلبی از جمله Nkx2-5 ،Gata4 و Tnnt2 نقش ویژه‌ای دارد. همچنین مشخص شده است که افزایش بیان miR-1 در سلولهای بنیادی مزانشیمی سبب تمایز این سلول‌ها به سلولهای شبه‌قلبی میشود [۱۸]. علاوه بر این، ژانگ و همکاران نشان داده‌ند که القای همزمان miR-1 و MyoCD سبب بهبود تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌قلبی میشود. بنابراین به دلیل اثر هم‌افزایی فاکتور MyoCD بر عملکرد miR-1 و بهبود تمایز به سمت سلولهای شبه‌قلبی، در این مطالعه سلولهای بنیادی مزانشیمی به صورت همزمان با لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD القا شدند [۱۹].
در گذشته بیشتر مطالعات مرتبط با فرایند تمایز در کشت دوبعدی بررسی می‌شد، اما به دلیل مزایای متعدد محیط سه‌بعدی نسبت به محیط دوبعدی، مطالعات زیادی در این راستا انجام شده است. در کشت سه‌بعدی سلول‌ها علاوه بر تعامل با یکدیگر با ماتریکس خارج سلولی نیز ارتباط دارند. در حالی که در کشت دوبعدی سلول‌ها فقط با سلولهای اطراف خود ارتباط برقرار می‌کنند. علاوه بر این، نیرو‌های مکانیکی بین سلول سلول و محیط سلول در کشت سه‌بعدی مجموعه‌ای از سیگنال‌ها را تنظیم کرده که عملکرد‌های مختلف سلولی از قبیل تکثیر، تمایز و مهاجرت را تنظیم می‌کند. علاوه بر این، ساختار و سازمان‌دهی سلول‌ها در کشت سه‌بعدی در مقایسه با کشت دوبعدی تغییر می‌کند که بر عملکرد و سیگنالینگ سلول‌ها مؤثر است [۲۰]. بنابراین میتوان نتیجه گرفت رفتار‌های سلولی در کشت سه‌بعدی با کشت دوبعدی کاملاً متفاوت است. مجموعه این ویژگی‌ها سبب بهبود شرایط تمایز سلول‌ها از جمله تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌قلبی میشود [۲۱]. در مهندسی بافت قلب از هیدروژل‌های مختلفی استفاده میشود که کیتوزان و کلاژن یکی از پرکاربردترین آن‌هاست. کیتوزان به عنوان یک پلی‌ساکارید زیست‌سازگار به دلیل فعالیت آنتی‌اکسیدانی و عدم ایمنی‌زایی غالباً در مهندسی بافت استفاده میشود. مطالعات نشان داده است که کیتوزان به عنوان یک داربست هیدروژلی در ترکیب با سلولهای بنیادی مزانشیمی می‌تواند عملکرد قلب را در مدل‌های انفارکتوس موش صحرایی بهبود بخشد [۲۲]. همچنین کلاژن، چسبندگی سلول را با گیرنده‌های اینتگرین تسهیل می‌کند و به این ترتیب مسیر‌های سیگنال‌دهی را فعال کرده که به نوبه خود بقا، تکثیر و تمایز سلول را تنظیم می‌کند [19]. بنابراین در صورت ترکیب با کیتوزان کارایی تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه‌قلبی بهبود می‌یابد. به این صورت که شبکه هیدروژلی یکپارچه متخلخل کیتوزان / کلاژن یک ریزمحیط مناسب برای تکثیر و تمایز سلول از طریق نفوذپذیری مواد مغذی و مولکول‌های بیولوژیکی و توسعه مسیر سیگنالینگ در میان سلولهای اینکپسوله در هیدروژل فراهم کرده است [20]. در مطالعه حاضر سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی موش با لنتی ویروس‌های حاوی miR-1 و MyoCD به طور همزمان ترانسداکت شده و پس از سه روز، سلولهای القاشده در هیدروژل کیتوزان / کلاژن قرار گرفتند. نتایج حاصل از تست‌های in vitro نشان داد بیان مارکر‌های قلبی در سطح ژن و پروتئین در سلولهای اینکپسوله‌شده در هیدروژل در مقایسه با سلولهای موجود در کشت دوبعدی به طور معناداری افزایش پیدا کرده است. با وجود اینکه بیان ژن‌ها در محیط سه‌بعدی نسبت به محیط دوبعدی افزایش معناداری نشان می‌دهد، اما با توجه به اینکه Gata4 یک مارکر اولیه و Tnnt2 یک مارکر ثانویه در تمایز سلولهای قلبی است، الگوی بیانی این دو ژن در روز‌های مختلف تمایز متفاوت است.
این نتایج نشان‌دهنده تأثیر مثبت کشت سه‌بعدی بر بهبود تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سمت سلولهای شبه‌قلبی است.
نتیجه‌گیری
نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که القای همزمان miR-1 و MyoCD در سلولهای بنیادی مزانشیمی و به دنبال آن کشت در محیط هیدروژل حاوی کیتوزان / کلاژن منجر به تمایز بیشتر سلول‌ا به سمت سلولهای شبه‌قلبی میشود. این یافته‌ها اهمیت کشت سه‌بعدی در تمایز سلولهای بنیادی را نشان می‌دهد. بنابراین در مطالعات آینده میتوان با بهبود شرایط تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی و به دنبال آن به دست آوردن سلولهای قلبی بالغ، شاهد پیشرفت‌هایی در بازسازی قلب مبتنی بر سلول‌درمانی باشیم.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
تمام آزمایشات حیوانی بر اساس دستورالعمل‌های مورد تأیید مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی و کمیته اخلاق دانشگاه تربیت‌مدرس انجام شد (کد اخلاق: 125.IR.MODARES.REC.1398).
حامی مالی
این تحقیق هیچ‌گونه کمک مالی از سازمان‌های تأمین مالی در بخش‌های عمومی، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش همه بخش‌های پژوهش حاضر مشارکت داشته‌اند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله از دانشگاه تربیت‌مدرس، دانشگاه اصفهان و مرکز قلب تهران کمال تشکر و قدردانی را دارند.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
سلولی و مولکولی
دریافت: 1400/4/20 | پذیرش: 1400/5/18 | انتشار: 1400/5/10
دریافت: 1400/4/20 | پذیرش: 1400/5/18 | انتشار: 1400/5/10
فهرست منابع
1. Zhao Y, Londono P, Cao Y, Sharpe EJ, Proenza C, O'Rourke R, et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 2015; 6:8243. [DOI:10.1038/ncomms9243] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1038/ncomms9243]
2. Muiesan ML, Paini A, Rosei CA, Bertacchini F, Stassaldi D, Salvetti M. Current pharmacological therapies in heart failure patients. High Blood Press Cardiovasc Prev. 2017; 24(2):107-14. [DOI:10.1007/s40292-017-0194-3] [PMID] [DOI:10.1007/s40292-017-0194-3]
3. Hénon P. Key success factors for regenerative medicine in acquired heart diseases. Stem Cell Rev Rep. 2020; 16(3):441-58. [DOI:10.1007/s12015-020-09961-0] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1007/s12015-020-09961-0]
4. Karantalis V, Hare JM. Use of mesenchymal stem cells for therapy of cardiac disease. Circ Res. 2015; 116(8):1413-30. [DOI:10.1161/CIRCRESAHA.116.303614] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1161/CIRCRESAHA.116.303614]
5. Musialek P, Mazurek A, Jarocha D, Tekieli L, Szot W, Kostkiewicz M, et al. Myocardial regeneration strategy using Wharton's jelly mesenchymal stem cells as an off-the-shelf 'unlimited' therapeutic agent: Results from the acute myocardial infarction first-in-man study. Postepy Kardiol Interwencyjnej. 2015; 11(2):100-7. [DOI:10.5114/pwki.2015.52282] [PMID] [PMCID] [DOI:10.5114/pwki.2015.52282]
6. McGinley L, McMahon J, Strappe P, Barry F, Murphy M, O'Toole D, et al. Lentiviral vector mediated modification of mesenchymal stem cells & enhanced survival in an in vitro model of ischaemia. Stem Cell Res Ther. 2011; 2(2):12. [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/scrt53]
7. Satija NK, Singh VK, Verma YK, Gupta P, Sharma Sh, Afrin F, et al. Mesenchymal stem cell‐based therapy: A new paradigm in regenerative medicine. J Cell Mol Med. 2009; 13(11‐12):4385-402. [DOI:10.1111/j.1582-4934.2009.00857.x] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1111/j.1582-4934.2009.00857.x]
8. Piubelli C, Meraviglia V, Pompilio G, D'Alessandra Y, Colombo GI, Rossini A. microRNAs and cardiac cell fate. Cells. 2014; 3(3):802- 23. [DOI:10.3390/cells3030802] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/cells3030802]
9. Shen X, Pan B, Zhou H, Liu L, Lv T, Zhu J, et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes is regulated by miRNA-1-2 via WNT signaling pathway. J Biomed Sci. 2017; 24(1):29. [DOI:10.1186/s12929-017-0337-9] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/s12929-017-0337-9]
10. Wang D, Chang PS, Wang Z, Sutherland L, Richardson JA, Small E, et al. Activation of cardiac gene expression by myocardin, a transcriptional cofactor for serum response factor. Cell. 2001; 105(7):851- 62. [DOI:10.1016/S0092-8674(01)00404-4] [PMID] [DOI:10.1016/S0092-8674(01)00404-4]
11. Fong AH, Romero-López M, Heylman CM, Keating M, Tran D, Sobrino A, et al. Three-dimensional adult cardiac extracellular matrix promotes maturation of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 2016; 22(15-16):1016-25. [DOI:10.1089/ten.tea.2016.0027] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1089/ten.tea.2016.0027]
12. Caspi O, Lesman A, Basevitch Y, Gepstein A, Arbel G, Habib IHM, et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 2007; 100(2):263-72. [DOI:10.1161/01.RES.0000257776.05673.ff] [PMID] [DOI:10.1161/01.RES.0000257776.05673.ff]
13. Bejleri D, Davis ME. Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration. Adv Healthc Mater. 2019; 8(5):e1801217. [DOI:10.1002/adhm.201801217] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1002/adhm.201801217]
14. Fukuda J, Khademhossieni A, Yeo Y, Yang X, Yeh J, Eng G, et al. Micromolding of photocrosslinkable chitosan hydrogel for spheroid microarray and co-cultures. Biomaterials. 2006; 27(30):5259- 67. [DOI:10.1016/j.biomaterials.2006.05.044] [PMID] [DOI:10.1016/j.biomaterials.2006.05.044]
15. Shaghiera AD, Widiyanti P, Yusuf H. Synthesis and characterization of injectable hydrogels with varying collagen-chitosan-thymosin β4 composition for myocardial infarction therapy. J Funct Biomater. 2018; 9(2):33. [DOI:10.3390/jfb9020033] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3390/jfb9020033]
16. Deng C, Zhang P, Vulesevic B, Kuraitis D, Li F, Yang AF, et al. A collagen-chitosan hydrogel for endothelial differentiation and angiogenesis. Tissue Eng Part A. 2010; 16(10):3099-109. [DOI:10.1089/ten.tea.2009.0504] [PMID] [DOI:10.1089/ten.tea.2009.0504]
17. Synnergren J, Améen C, Lindahl A, Olsson B, Sartipy P. Expression of microRNAs and their target mRNAs in human stem cell-derived cardiomyocyte clusters and in heart tissue. Physiol Genomics. 2011; 43(10):581-94. [DOI:10.1152/physiolgenomics.00074.2010] [PMID] [DOI:10.1152/physiolgenomics.00074.2010]
18. Zhao XL, Yang B, Ma LN, Dong YH. MicroRNA-1 effectively induces differentiation of myocardial cells from mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2016; 44(7):1665-70. [DOI:10.3109/21691401.2015.1080168] [PMID] [DOI:10.3109/21691401.2015.1080168]
19. Christoforou N, Chakraborty S, Kirkton RD, Adler AF, Addis RC, Leong KW. Core transcription factors, microRNAs, and small molecules drive transdifferentiation of human fibroblasts towards the cardiac cell lineage. Sci Rep. 2017; 7:40285. [DOI:10.1038/srep40285] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1038/srep40285]
20. Ronaldson-Bouchard K, Ma SP, Yeager K, Chen T, Song L, Sirabella D, et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 2018; 556(7700):239-43. [DOI:10.1038/s41586-018-0016-3] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1038/s41586-018-0016-3]
21. Synnergren J, Ameen C, Lindahl A, Olsson B, Sartipy P. Expression of microRNAs and their target mRNAs in human stem cell-derived cardiomyocyte clusters and in heart tissue. Physiol. Genomics. 2011; 43(10):581-594. [DOI:10.1152/physiolgenomics.00074.2010] [DOI:10.1152/physiolgenomics.00074.2010]
22. Zhao X, Yang B, Ma L, Dong Y. MicroRNA-1 effectively induces differentiation of myocardial cells from mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2016; 44(7):1665-70. [DOI:10.3109/21691401.2015.1080168] [DOI:10.3109/21691401.2015.1080168]
23. Christoforou N, Chakraborty S, Kirkton RD, Adler AF, Addis RC, Leong KW. Core transcription factors, microRNAs, and small molecules drive transdifferentiation of human fibroblasts towards the cardiac cell lineage. Sci Rep. 2017; 7(1):1-5. https://www.nature.com/articles/srep40285 [DOI:10.1038/srep40285]
24. Ronaldson-Bouchard K, Ma s, Yeager K, Chen T, Song L, Sirabella D, et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 2018; 556(7700):239-43. [DOI:10.1038/s41586-018-0016-3] [DOI:10.1038/s41586-018-0016-3]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
