دوره 16، شماره 9 - ( آذر 1401 )
جلد 16 شماره 9 صفحات 767-756 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Ethics code: IR.IAU.TMU.REC.1401.172
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Adib S. Morphology and Molecular Studies and Differentiation Ability of Ovarian Stem Cells in Newborn Syrian Rats. Qom Univ Med Sci J 2022; 16 (9) :756-767
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3558-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3558-fa.html
ادیب سمانه. بررسی مورفولوژی، مولکولی و قابلیت تمایز سلول‌های بنیادی تخمدان موش سوری تازه متولد‌شده. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1401; 16 (9) :756-767
گروه علوم تشریحی و علوم اعصاب شناختی، دانشکده پزشکی، علوم‌پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی تهران، تهران، ایران.
متن کامل [PDF 4460 kb]
(284 دریافت)
| چکیده (HTML) (1029 مشاهده)
متن کامل: (291 مشاهده)
مقدمه
تخمدان یک غده درون‌ریز است که ترشحات خود را مدیون سلول‌های گرانولوزا و تکاست. در بافت تخمدان علاوه بر فولیکول‌ها (شامل اووسیت و سلول‌های پشیبان آن، یعنی گرانولوزا و تکا) که در مراحل تکاملی مختلفی قرار دارند، سلول‌های بنیادی نیز وجود دارد. این سلول‌های بنیادی می‌توانند در قشر، اپیتلیوم، مرز بین قشر و مرکز (مدولا) تخمدان قرار داشته باشند. مطالعات جدید نشان دادند که سلول‌های بنیادی تخمدان قادرند به اووسیت و سلول‌های پشتیبان اوسیت تمایز یابند. به پدیده تمایز سلول‌های بنیادی تخمدان به اووسیت نئواوژنزیس می‌گویند.
محققان در گذشته بر این باور بودند که تعداد فولیکول‌های بدوی در تخمدان پس از تولد ثابت است. این تعداد ثابت از دوران جنینی تعیین می‌شود، اما مطالعات جدید ثابت کردند که در تخمدان نئواوژنزیس نیز رخ می‌دهد. این پدیده تغییرات قابل‌توجهی در بیولوژی تولید مثل و تحقیقات ناباروری ایجاد کرد و ازاین‌رو، وجود سلول‌های بنیادی در تخمدان پستانداران پس از تولد ثابت شد [1، 2].
علاوه‌براین، سلول‌های بنیادی تخمدان قادرند به سلول‌های تکا نیز تمایز یابند [3]. در فولیکول بدوی سلول‌های تکا هنوز آرایش کاملی ندارند. به‌طورکلی می‌توان گفت در مرحله اولیه رشد فولیکول این لایه به‌‌صورت واضح و منظم دیده نمی‌شود. این سلول‌ها در مرحله فولیکول ثانویه به بعد دیده می‌شوند. وجود سلول‌های تکا برای فولیکولوژنزیس ضروری است، زیرا سلول‌های تکا همراه با سلول‌های گرانولوزا نقش مهمی در تولید هورمون‌های استروئیدی دارند. باوجوداین که شکل‌گیری سلول‌های تکا برای وقایع فیزیولوژی رشد و تکامل فولیکول مهم است، اطلاعات اندکی درباره شکل‌گیری سلول های تکا در طول رشد فولیکول وجود دارد. در دهه اخیر محققین نشان دادند سلول‌های تکا در تخمدان، ۲ منشأ جنین‌شناسی متفاوت دارد که مارکرهای ملکولی متفاوتی را بیان می‌کنند و سپس به تخمدان مهاجرت می‌کنند [4].
نکته قابل‌‌توجه و مهم این است که سلول‌های تکا، ۲ لایه تکای داخلی و خارجی دارند. لایه داخلی حاوی سلول‌های ایمنی، مویرگ‌های بسیار ریز خونی، سلول‌های بنیادی و سلول‌های استروئیدی است که گیرنده LH روی این سلول‌هاست و این سلول‌ها قادرند آندروژن ترشح کنند. این در حالی است که سلول‌های لایه خارجی بیشتر شبه فیبروبلاست و عضله صاف هستند. لایه اخیر حاوی عروق لنفاوی و خونی و رشته‌های عصبی و قابل انقباض است. محققان بر این باورند که سلول‌های بنیادی تکای جداشده از تخمدان قادرند هر ۲ لایه خارجی و داخلی تکا را در شرایط آزمایشگاهی تشکیل دهند [5].
سلول‌های بنیادی که در بافت‌ها بعد از تولد قرار دارند از نوع چند توان هستند که به آن‌ها سلول‌های بنیادی مزانشیمی گفته می‌شود. این سلول‌ها را می‌توان از انواع بافت‌ها مانند مغز استخوان، چربی و غیره استخراج کرد. سلول‌های بنیادی مزانشیمی با مارکرهای خاص با سطوح بیان متغیر از‌جمله CD105 ،CD73 ،CD44 ،CD90 مشخص می‌شوند. همچنین این سلول‌ها، نشانگر سلول‌های بنیادی خون‌ساز مانند CD34 و CD45 و همچنین نشانگر سلول‌های اندوتلیال CD31 را بیان نمی‌کنند.
افزون بر این می‌توان گفت این سلول‌ها مارکرهای مخصوص سلول‌های بنیادی از قبیل Sox2 ،Pou5f ،Nanog را نیز بیان می‌کنند. این سلول‌های شبه فیبروبلاست غیر‌خون‌ساز، تمایز نیافته، با خاصیت چسبندگی هستند. آن‌ها می‌توانند به‌طور گسترده تکثیر شوند و قابلیت تمایز به چندین نوع سلول از منشأ مزودرمی و غیر‌مزودرمی مانند سلول‌های استخوان و سلول‌های چربی را دارند [6، 7].
در این مطالعه، سلول‌های بنیادی تخمدان موش سوری جداسازی و خصوصیات آن‌ها بررسی شدند، زیرا شناخت دقیق مشخصات این سلول‌ها، نه تنها در ناباروی و رشد آزمایشگاهی فولیکول می‌تواند مؤثر باشد، بلکه در پزشکی احیاکننده
و سلول‌درمانی نیز بسیار ارزشمند است. سلول‌های بنیادی تخمدان ازنظر بیان برخی از ژن‌های نشانگر و توانایی تمایز آن‌ها در شرایط آزمایشگاهی به سلول‌های شبه‌استخوانی و شبه‌چربی در شرایط آزمایشگاهی بررسی شدند.
روش بررسی
جداسازی سلول‌های بنیادی از تخمدان
ابتدا موش‌های سوری نژاد (DBA2) تازه متولد‌شده (به تعداد 5 عدد) با روش قطع نخاع گردنی قربانی شدند. سپس تخمدان‌ها (10 عدد) جداسازی و به زیر لوپ منتقل شدند. پس از قطعه قطعه کردن بافت تخمدان با سوزن مربوط به سرنگ انسولین، بقایای بافت تخمدان در کلاژناز (01/0 درصد) به مدت 15 دقیقه در انکوباتور قرار داده شد و هر 5 دقیقه پیپتاژ شد. سپس با سرم 30 درصد خنثی و محتویات از فیلتر مش 70 رد شد و سلول‌ها ۲ بار با PBS شست‌وشو داده شدند.
سانتریفیوژ (500 دور به‌مدت 5 دقیقه) انجام شد. رسوب سلول‌ها در زیر هود مخصوص کشت سلولی به درون یک فلاسک 25 سانتی‌متری تخلیه و در محیط کشت DMEM/F12 و FBS 10 درصد قرار داده شد. سپس در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و میزان CO2 5 درصد و شرایط رطوبت 95 درصد برای مدت 24 ساعت نگهداری شدند و پس از یک روز این محیط تعویض شد. به هنگام تعویض محیط، سلول‌ها با PBS استریل شسته شدند. سلول‌هایی که به کف فلاسک نچسبیده بودند با تعویض محیط از فلاسک خارج شدند. پس از آن، تعویض محیط هر روز و برای 2 تا 3 روز تا تخلیه کامل سلول‌های خونی، خون‌ساز و دبریدمان و پر شدن بیش از 80 درصد کف فلاسک ادامه یافت.
سلول‌ها از ابتدا روزانه ازنظر مورفولوژی و شرایط عمومی توسط میکروسکوپ اینورت بررسی شد. بعد از 3 تا 4 روز سلول‌ها بر اثر تکثیر، کف فلاسک‌ها را پر کردند و در این هنگام پاساژ اول برای کشت سلول انجام شد که در این عمل با استفاده از محلول تریپسین EDTA سلول‌ها از کف فلاسک جدا شدند. به‌وسیله پیپتاژ کردن، سلول‌ها از همدیگر جدا شدند و بعد از این مرحله، عمل سانتریفیوژ سلول‌ها انجام شد.
بعد از عمل سانتریفیوژ، محتویات رویی لوله فالکن تخلیه، مقداری محیط کشت به داخل تیوپ حاوی سلول اضافه و مجدداً عمل پیپتاژ انجام شد. محتویات داخل لوله فالکن مجدداً به داخل ۳ فلاسک مخصوص کشت ریخته شد و در داخل انکوباتور 37 درجه با شرایط مرطوب و CO2 مناسب قرار گرفت. بعد از 3 پاساژ مکرر سلول‌های کاملاً یکدست و با ظاهری کاملاً شبیه به هم در کف فلاسک باقی ماندند که آمادگی لازم را برای بررسی داشتند.
استخراج RNA و سنتز cDNA
RNAهای کل از سلول‌های بنیادی تخمدان با بافرTrizol (Invitrogen) استخراج شد. آلودگی ناخواسته DNA در RNAهای استخراج‌شده به کمک DNase I هضم شد. پس از آن، غلظت و خلوص RNA توسط اسپکتروفتومتر
(Thermo Fisher Scientific) تعیین شد. اولین رشته cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA Maxima H Minus First Strand (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) سنتز و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد برای استفاده بعدی ذخیره شد.
تحلیل بیان ژن‌های مرتبط با سلول‌های بنیادی با روش RT-PCR
سطح بیان ژن‌های مرتبط با سلول‌های بنیادی تخمدان شامل Sox2 ،Oct4 ،Nanog با روش RT-PCR ارزیابی شد. از ژن Beta-Tubulin به‌عنوان ژن مرجع استفاده شد. لیست پرایمرهای استفاده‌شده در این پژوهش در جدول شماره 1 آمده است. روش RT-PCR براساس راهنمای کیت مربوطه انجام و برای انجام واکنش از کیت (Promega (M7502 استفاده شد. قطعات تکثیرشده از هر نمونه با الکتروفورز ژل آگارز ۱ درصد بررسی شد.
تمایز سلول‌های بنیادی تخمدان به سلول‌های شبه‌چربی
پس از آماده‌سازی محیط کشت تمایزی [1]، سلول‌های بنیادی بعد از پاساژ سوم سانتریفیوژ شدند. سپس در محیط کشت تمایزی به‌مدت 21 روز کشت داده شدند. محیط کشت هر 3 روز یک‌بار تعویض می‌شد.
رنگآمیزی اویل رد
ابتدا محیط کشت تمایزی روی سلول‌ها تخلیه شد. سپس سلول‌های باقی‌مانده با PBS شسته شدند. سلول‌ها با پارافورمآلدهید 4/0 درصد به‌مدت 1 ساعت فیکس و 20 دقیقه با رنگ (Sigma ،Germanygma) اویل رد رنگآمیزی شدند. پس از شست‌وشو با اتانول 70 درصد و درنهایت، شست‌وشو با آب، قطرات چربی در سلول‌ها رنگ شدند و زیر میکروسکوپ اینورت مشاهده و عکس‌برداری شدند.
تمایز سلول‌های بنیادی تخمدان به سلول‌های شبه استخوان
پس از آماده‌سازی محیط کشت تمایزی [1]، سلول‌های بنیادی پس از پاساژ سوم سانتریفیوژ شدند و سپس در محیط کشت تمایز به استخوان به‌مدت 21 روز کشت داده شدند. محیط کشت هر ۳ روز یک‌بار تعویض می‌شد.
رنگآمیزی آلیزارین رد
ابتدا محیط روی سلول‌ها تخلیه شد. سپس سلول‌ها با PBS شسته شدند. سلول‌ها با متانول به‌مدت 15 دقیقه فیکس شدند و 10 دقیقه با رنگ آلیزارین رد (سیگما-آلمان) رنگآمیزی شدند. پس از شست‌وشوی سلول‌ها با آب، مواد آهکی در سلول‌ها و ماتریکس مینرالیزه رنگ‌شده زیر میکروسکوپ اینورت مشاهده و عکس‌برداری شدند.
یافته‌ها
مورفولوژی سلول‌های بنیادی تخمدان
سلول‌های بنیادی قبل از کشت به‌‌صورت گرد و مدور بودند. زمانی که در پلیت قرار داده شدند به کف پلیت نچسبیدند. پس از گذشت 8 ساعت، این سلول‌ها کم‌کم به کف پلیت چسبیدند و 24 ساعت بعد شروع به تشکیل کلونی در مرحله کشت اولیه کردند. این کلونی‌ها ترکیبی از سلول‌های پهن‌شده، دوکی، گرد و بلند بودند (تصویر شماره 1). بعد از پاساژ سوم این سلول‌ها به‌‌صورت یک جمعیت یکدست بودند که تقریباً همه آن‌ها به کف ظرف چسبیده بوده و دوکی و کشیده شده بودند. این سلول‌ها ظاهری شبیه به سلول‌های فیبروبلاستی داشتند.
بررسی بیان ژن‌های مرتبط با سلول‌های بنیادی
ژن‌های مربوط به فاکتورهای رونویسی پرتوانی مانند Sox2 ،Oct4 ،Nanog در این مطالعه بررسی شدند که سلول‌های بنیادی هر ۳ ژن را بیان کردند (تصویر شماره 2).
تمایز سلول‌های بنیادی تکا به سلول‌های شبه‌چربی
به دنبال تمایز سلول‌های بنیادی تکا به سلول‌های شبه‌چربی، در سلول‌های تمایزیافته قطرات چربی دیده شد. این قطرات چربی با رنگ اویل رد رنگآمیزی و به صورت ذرات قرمزرنگ دیده شدند (تصویر شماره 3). این بررسی 21 روز پس از تمایز انجام شد.
تمایز سلول‌های بنیادی تکا به سلول‌های شبه‌استخوان
بعد از تمایز سلول‌های بنیادی تکا به سلول‌های شبه‌استخوان، ماتریکس آهکی شکل گرفت که پس از رنگآمیزی سلول‌ها با آلیزارین رد این قسمت‌ها به رنگ قرمز درآمدند (تصویر شماره 3). این بررسی 21 روز پس از تمایز انجام شد.
بحث
امروزه استفاده از سلول‌های بنیادی نقش بسزایی در درمان بیماری‌ها دارد. استفاده از سلول‌های بنیادی تخمدان و تمایز آن‌ها به سایر رده‌های سلولی از قبیل اووسیت و سلول‌های پشتیبان تکا در راستای درمان ناباروی می‌تواند نقش مهمی داشته باشد. علاوه‌براین، می‌توان از این سلول‌ها در سلول‌درمانی برای سایر بیماری‌ها نیز استفاده کرد.
در این مطالعه، سلول‌های بنیادی تخمدان به راحتی در شرایط آزمایشگاهی جداسازی شدند. بعد از جداسازی و کشت سلول‌های بنیادی مورفولوژی و قدرت تکثیر آن‌ها بررسی شد. سپس مارکرهای خاص سلول‌های بنیادی نیز بررسی شد. علاوه‌براین، توانایی تمایز این سلول‌ها نیز بررسی شد.
در کشت اولیه، سلول‌های بنیادی تکا، تجمع یافتند و کلونی تشکیل دادند، اما بعد از ۳ پاساژ به‌‌صورت جمعیت یکدستی دیده شدند. این سلول‌ها بعد از ۳ پاساژ چسبنده و دوکی بودند. این مورفولوژی در سلول‌های بنیادی مغز استخوان از گونه‌های مختلف مثل گوسفند [8] و انسان [9] نیز دیده شده است. همچنین در این مطالعه، بیان ترانس کریپشن فاکتورهای مهم که برای سلول‌های بنیادی ضروری است، بررسی شد. این مارکرها شامل Sox2 ،Nanog ،Pou5f1 بودند [10] بیان این فاکتورها در سلول‌های بنیادی اولیه و پرتوان گزارش شده است [11].
علاوه‌براین، مطالعات قبلی ثابت کردند که هر ۳ فاکتور فوق در سلول‌های بنیادی مشتق از مغز استخوان انسان و گوسفند نیز بیان می‌شوند [1، 3]. Oct4 یک ترانس کریپشن فاکتور شناخته‌شده برای سلول‌های پرتوان است و به نظر می‌رسد نقش کلیدی در پایه‌ریزی و تعیین هویت رده سلول‌های زایا دارد. محققان اخیراً نشان داده‌اند که Oct4 در سلول‌های زایا نیز بیان می‌شود. نتایج تحقیقات قبلی نشان دادند سلول‌های زایا می‌توانند لابه‌لای سلول‌های بنیادی تخمدان حضور داشته باشند [12].
در مطالعه‌ای که قبلاً روی سلول‌های بنیادی تکای گوسفند انجام شد، نشان داده شد سلول‌های بنیادی تکای گوسفندی مارکر Oct4 را بیشتر از Nanog بیان کردند و این در حالی بود که فاکتور Nanog بیشتر از Sox2 بیان شد. علاوه‌براین، محققان در این مطالعه نشان دادند هر ۳ فاکتور در تخمدان جنین گوسفندی بیان بسیار قابل ملاحظه و بالایی داشت [1]. در مطالعه دیگری که بر روی سلول‌های بنیادی تکای خوکی انجام شد، محققان نشان دادند این سلول‌های چند توان، توانایی بیان مارکرهای Oct4 و Nanog را ندارند، اما همچون سلول‌های بنیادی مزانشیمی می‌توانند تکثیر شوند و پس از چند پاساژ به جمعیت یکدستی تبدیل می‌شوند. در حالی که آن‌ها نشان دادند این سلول‌ها می‌توانند فاکتور Sox2 را بیان کنند [13].
تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های شبه‌استخوان و سلول‌های شبه‌چربی با رنگآمیزی آلیزارین رد و اویل رد تأیید شد. یافته‌های مطالعه قبلی نشان داده است سلول‌های چند توان مشتق از سلول‌های مغز استخوان [14] و چربی [15] نیز توانایی تمایز به استخوان و چربی را دارند. نتایج مطالعه حاضر بر روی سلول‌های بنیادی تکای مشتق از تخمدان گوسفند، خوک و انسان نیز مشابه یافته‌های این مقاله بود.
نتیجه‌گیری
یافته‌های این مطالعه نشان داد سلول‌های بنیادی تخمدان، شامل سلول‌های بنیادی چند توان هستند که قادرند نشانگرهای مربوط به سلول‌های بنیادی را بیان کنند و به رده‌های سلولی از قبیل سلول‌های شبه‌استخوان و شبه‌چربی تمایز یابند. نتایج حاصل از این مطالعه بیانگر این است که باتوجه‌به خصوصیات سلول‌های بنیادی حاصل از تخمدان، این سلول‌ها نیز می‌توانند در سلول‌درمانی و پزشکی احیاکننده استفاده شود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم پزشکی تهران این مطالعه را با شناسه (IR.IAU.TMU.REC.1401.172) تأیید کرد.
حامی مالی
تأمین منابع مالی آن به عهده نویسنده بوده است.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسنده مقاله از مهدی علیخانی کمال تشکر و قدردانی را دارد.
تخمدان یک غده درون‌ریز است که ترشحات خود را مدیون سلول‌های گرانولوزا و تکاست. در بافت تخمدان علاوه بر فولیکول‌ها (شامل اووسیت و سلول‌های پشیبان آن، یعنی گرانولوزا و تکا) که در مراحل تکاملی مختلفی قرار دارند، سلول‌های بنیادی نیز وجود دارد. این سلول‌های بنیادی می‌توانند در قشر، اپیتلیوم، مرز بین قشر و مرکز (مدولا) تخمدان قرار داشته باشند. مطالعات جدید نشان دادند که سلول‌های بنیادی تخمدان قادرند به اووسیت و سلول‌های پشتیبان اوسیت تمایز یابند. به پدیده تمایز سلول‌های بنیادی تخمدان به اووسیت نئواوژنزیس می‌گویند.
محققان در گذشته بر این باور بودند که تعداد فولیکول‌های بدوی در تخمدان پس از تولد ثابت است. این تعداد ثابت از دوران جنینی تعیین می‌شود، اما مطالعات جدید ثابت کردند که در تخمدان نئواوژنزیس نیز رخ می‌دهد. این پدیده تغییرات قابل‌توجهی در بیولوژی تولید مثل و تحقیقات ناباروری ایجاد کرد و ازاین‌رو، وجود سلول‌های بنیادی در تخمدان پستانداران پس از تولد ثابت شد [1، 2].
علاوه‌براین، سلول‌های بنیادی تخمدان قادرند به سلول‌های تکا نیز تمایز یابند [3]. در فولیکول بدوی سلول‌های تکا هنوز آرایش کاملی ندارند. به‌طورکلی می‌توان گفت در مرحله اولیه رشد فولیکول این لایه به‌‌صورت واضح و منظم دیده نمی‌شود. این سلول‌ها در مرحله فولیکول ثانویه به بعد دیده می‌شوند. وجود سلول‌های تکا برای فولیکولوژنزیس ضروری است، زیرا سلول‌های تکا همراه با سلول‌های گرانولوزا نقش مهمی در تولید هورمون‌های استروئیدی دارند. باوجوداین که شکل‌گیری سلول‌های تکا برای وقایع فیزیولوژی رشد و تکامل فولیکول مهم است، اطلاعات اندکی درباره شکل‌گیری سلول های تکا در طول رشد فولیکول وجود دارد. در دهه اخیر محققین نشان دادند سلول‌های تکا در تخمدان، ۲ منشأ جنین‌شناسی متفاوت دارد که مارکرهای ملکولی متفاوتی را بیان می‌کنند و سپس به تخمدان مهاجرت می‌کنند [4].
نکته قابل‌‌توجه و مهم این است که سلول‌های تکا، ۲ لایه تکای داخلی و خارجی دارند. لایه داخلی حاوی سلول‌های ایمنی، مویرگ‌های بسیار ریز خونی، سلول‌های بنیادی و سلول‌های استروئیدی است که گیرنده LH روی این سلول‌هاست و این سلول‌ها قادرند آندروژن ترشح کنند. این در حالی است که سلول‌های لایه خارجی بیشتر شبه فیبروبلاست و عضله صاف هستند. لایه اخیر حاوی عروق لنفاوی و خونی و رشته‌های عصبی و قابل انقباض است. محققان بر این باورند که سلول‌های بنیادی تکای جداشده از تخمدان قادرند هر ۲ لایه خارجی و داخلی تکا را در شرایط آزمایشگاهی تشکیل دهند [5].
سلول‌های بنیادی که در بافت‌ها بعد از تولد قرار دارند از نوع چند توان هستند که به آن‌ها سلول‌های بنیادی مزانشیمی گفته می‌شود. این سلول‌ها را می‌توان از انواع بافت‌ها مانند مغز استخوان، چربی و غیره استخراج کرد. سلول‌های بنیادی مزانشیمی با مارکرهای خاص با سطوح بیان متغیر از‌جمله CD105 ،CD73 ،CD44 ،CD90 مشخص می‌شوند. همچنین این سلول‌ها، نشانگر سلول‌های بنیادی خون‌ساز مانند CD34 و CD45 و همچنین نشانگر سلول‌های اندوتلیال CD31 را بیان نمی‌کنند.
افزون بر این می‌توان گفت این سلول‌ها مارکرهای مخصوص سلول‌های بنیادی از قبیل Sox2 ،Pou5f ،Nanog را نیز بیان می‌کنند. این سلول‌های شبه فیبروبلاست غیر‌خون‌ساز، تمایز نیافته، با خاصیت چسبندگی هستند. آن‌ها می‌توانند به‌طور گسترده تکثیر شوند و قابلیت تمایز به چندین نوع سلول از منشأ مزودرمی و غیر‌مزودرمی مانند سلول‌های استخوان و سلول‌های چربی را دارند [6، 7].
در این مطالعه، سلول‌های بنیادی تخمدان موش سوری جداسازی و خصوصیات آن‌ها بررسی شدند، زیرا شناخت دقیق مشخصات این سلول‌ها، نه تنها در ناباروی و رشد آزمایشگاهی فولیکول می‌تواند مؤثر باشد، بلکه در پزشکی احیاکننده
و سلول‌درمانی نیز بسیار ارزشمند است. سلول‌های بنیادی تخمدان ازنظر بیان برخی از ژن‌های نشانگر و توانایی تمایز آن‌ها در شرایط آزمایشگاهی به سلول‌های شبه‌استخوانی و شبه‌چربی در شرایط آزمایشگاهی بررسی شدند.
روش بررسی
جداسازی سلول‌های بنیادی از تخمدان
ابتدا موش‌های سوری نژاد (DBA2) تازه متولد‌شده (به تعداد 5 عدد) با روش قطع نخاع گردنی قربانی شدند. سپس تخمدان‌ها (10 عدد) جداسازی و به زیر لوپ منتقل شدند. پس از قطعه قطعه کردن بافت تخمدان با سوزن مربوط به سرنگ انسولین، بقایای بافت تخمدان در کلاژناز (01/0 درصد) به مدت 15 دقیقه در انکوباتور قرار داده شد و هر 5 دقیقه پیپتاژ شد. سپس با سرم 30 درصد خنثی و محتویات از فیلتر مش 70 رد شد و سلول‌ها ۲ بار با PBS شست‌وشو داده شدند.
سانتریفیوژ (500 دور به‌مدت 5 دقیقه) انجام شد. رسوب سلول‌ها در زیر هود مخصوص کشت سلولی به درون یک فلاسک 25 سانتی‌متری تخلیه و در محیط کشت DMEM/F12 و FBS 10 درصد قرار داده شد. سپس در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و میزان CO2 5 درصد و شرایط رطوبت 95 درصد برای مدت 24 ساعت نگهداری شدند و پس از یک روز این محیط تعویض شد. به هنگام تعویض محیط، سلول‌ها با PBS استریل شسته شدند. سلول‌هایی که به کف فلاسک نچسبیده بودند با تعویض محیط از فلاسک خارج شدند. پس از آن، تعویض محیط هر روز و برای 2 تا 3 روز تا تخلیه کامل سلول‌های خونی، خون‌ساز و دبریدمان و پر شدن بیش از 80 درصد کف فلاسک ادامه یافت.
سلول‌ها از ابتدا روزانه ازنظر مورفولوژی و شرایط عمومی توسط میکروسکوپ اینورت بررسی شد. بعد از 3 تا 4 روز سلول‌ها بر اثر تکثیر، کف فلاسک‌ها را پر کردند و در این هنگام پاساژ اول برای کشت سلول انجام شد که در این عمل با استفاده از محلول تریپسین EDTA سلول‌ها از کف فلاسک جدا شدند. به‌وسیله پیپتاژ کردن، سلول‌ها از همدیگر جدا شدند و بعد از این مرحله، عمل سانتریفیوژ سلول‌ها انجام شد.
بعد از عمل سانتریفیوژ، محتویات رویی لوله فالکن تخلیه، مقداری محیط کشت به داخل تیوپ حاوی سلول اضافه و مجدداً عمل پیپتاژ انجام شد. محتویات داخل لوله فالکن مجدداً به داخل ۳ فلاسک مخصوص کشت ریخته شد و در داخل انکوباتور 37 درجه با شرایط مرطوب و CO2 مناسب قرار گرفت. بعد از 3 پاساژ مکرر سلول‌های کاملاً یکدست و با ظاهری کاملاً شبیه به هم در کف فلاسک باقی ماندند که آمادگی لازم را برای بررسی داشتند.
استخراج RNA و سنتز cDNA
RNAهای کل از سلول‌های بنیادی تخمدان با بافرTrizol (Invitrogen) استخراج شد. آلودگی ناخواسته DNA در RNAهای استخراج‌شده به کمک DNase I هضم شد. پس از آن، غلظت و خلوص RNA توسط اسپکتروفتومتر
(Thermo Fisher Scientific) تعیین شد. اولین رشته cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA Maxima H Minus First Strand (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) سنتز و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد برای استفاده بعدی ذخیره شد.
تحلیل بیان ژن‌های مرتبط با سلول‌های بنیادی با روش RT-PCR
سطح بیان ژن‌های مرتبط با سلول‌های بنیادی تخمدان شامل Sox2 ،Oct4 ،Nanog با روش RT-PCR ارزیابی شد. از ژن Beta-Tubulin به‌عنوان ژن مرجع استفاده شد. لیست پرایمرهای استفاده‌شده در این پژوهش در جدول شماره 1 آمده است. روش RT-PCR براساس راهنمای کیت مربوطه انجام و برای انجام واکنش از کیت (Promega (M7502 استفاده شد. قطعات تکثیرشده از هر نمونه با الکتروفورز ژل آگارز ۱ درصد بررسی شد.
تمایز سلول‌های بنیادی تخمدان به سلول‌های شبه‌چربی
پس از آماده‌سازی محیط کشت تمایزی [1]، سلول‌های بنیادی بعد از پاساژ سوم سانتریفیوژ شدند. سپس در محیط کشت تمایزی به‌مدت 21 روز کشت داده شدند. محیط کشت هر 3 روز یک‌بار تعویض می‌شد.
رنگآمیزی اویل رد
ابتدا محیط کشت تمایزی روی سلول‌ها تخلیه شد. سپس سلول‌های باقی‌مانده با PBS شسته شدند. سلول‌ها با پارافورمآلدهید 4/0 درصد به‌مدت 1 ساعت فیکس و 20 دقیقه با رنگ (Sigma ،Germanygma) اویل رد رنگآمیزی شدند. پس از شست‌وشو با اتانول 70 درصد و درنهایت، شست‌وشو با آب، قطرات چربی در سلول‌ها رنگ شدند و زیر میکروسکوپ اینورت مشاهده و عکس‌برداری شدند.
تمایز سلول‌های بنیادی تخمدان به سلول‌های شبه استخوان
پس از آماده‌سازی محیط کشت تمایزی [1]، سلول‌های بنیادی پس از پاساژ سوم سانتریفیوژ شدند و سپس در محیط کشت تمایز به استخوان به‌مدت 21 روز کشت داده شدند. محیط کشت هر ۳ روز یک‌بار تعویض می‌شد.
رنگآمیزی آلیزارین رد
ابتدا محیط روی سلول‌ها تخلیه شد. سپس سلول‌ها با PBS شسته شدند. سلول‌ها با متانول به‌مدت 15 دقیقه فیکس شدند و 10 دقیقه با رنگ آلیزارین رد (سیگما-آلمان) رنگآمیزی شدند. پس از شست‌وشوی سلول‌ها با آب، مواد آهکی در سلول‌ها و ماتریکس مینرالیزه رنگ‌شده زیر میکروسکوپ اینورت مشاهده و عکس‌برداری شدند.
یافته‌ها
مورفولوژی سلول‌های بنیادی تخمدان
سلول‌های بنیادی قبل از کشت به‌‌صورت گرد و مدور بودند. زمانی که در پلیت قرار داده شدند به کف پلیت نچسبیدند. پس از گذشت 8 ساعت، این سلول‌ها کم‌کم به کف پلیت چسبیدند و 24 ساعت بعد شروع به تشکیل کلونی در مرحله کشت اولیه کردند. این کلونی‌ها ترکیبی از سلول‌های پهن‌شده، دوکی، گرد و بلند بودند (تصویر شماره 1). بعد از پاساژ سوم این سلول‌ها به‌‌صورت یک جمعیت یکدست بودند که تقریباً همه آن‌ها به کف ظرف چسبیده بوده و دوکی و کشیده شده بودند. این سلول‌ها ظاهری شبیه به سلول‌های فیبروبلاستی داشتند.
بررسی بیان ژن‌های مرتبط با سلول‌های بنیادی
ژن‌های مربوط به فاکتورهای رونویسی پرتوانی مانند Sox2 ،Oct4 ،Nanog در این مطالعه بررسی شدند که سلول‌های بنیادی هر ۳ ژن را بیان کردند (تصویر شماره 2).
تمایز سلول‌های بنیادی تکا به سلول‌های شبه‌چربی
به دنبال تمایز سلول‌های بنیادی تکا به سلول‌های شبه‌چربی، در سلول‌های تمایزیافته قطرات چربی دیده شد. این قطرات چربی با رنگ اویل رد رنگآمیزی و به صورت ذرات قرمزرنگ دیده شدند (تصویر شماره 3). این بررسی 21 روز پس از تمایز انجام شد.
تمایز سلول‌های بنیادی تکا به سلول‌های شبه‌استخوان
بعد از تمایز سلول‌های بنیادی تکا به سلول‌های شبه‌استخوان، ماتریکس آهکی شکل گرفت که پس از رنگآمیزی سلول‌ها با آلیزارین رد این قسمت‌ها به رنگ قرمز درآمدند (تصویر شماره 3). این بررسی 21 روز پس از تمایز انجام شد.
بحث
امروزه استفاده از سلول‌های بنیادی نقش بسزایی در درمان بیماری‌ها دارد. استفاده از سلول‌های بنیادی تخمدان و تمایز آن‌ها به سایر رده‌های سلولی از قبیل اووسیت و سلول‌های پشتیبان تکا در راستای درمان ناباروی می‌تواند نقش مهمی داشته باشد. علاوه‌براین، می‌توان از این سلول‌ها در سلول‌درمانی برای سایر بیماری‌ها نیز استفاده کرد.
در این مطالعه، سلول‌های بنیادی تخمدان به راحتی در شرایط آزمایشگاهی جداسازی شدند. بعد از جداسازی و کشت سلول‌های بنیادی مورفولوژی و قدرت تکثیر آن‌ها بررسی شد. سپس مارکرهای خاص سلول‌های بنیادی نیز بررسی شد. علاوه‌براین، توانایی تمایز این سلول‌ها نیز بررسی شد.
در کشت اولیه، سلول‌های بنیادی تکا، تجمع یافتند و کلونی تشکیل دادند، اما بعد از ۳ پاساژ به‌‌صورت جمعیت یکدستی دیده شدند. این سلول‌ها بعد از ۳ پاساژ چسبنده و دوکی بودند. این مورفولوژی در سلول‌های بنیادی مغز استخوان از گونه‌های مختلف مثل گوسفند [8] و انسان [9] نیز دیده شده است. همچنین در این مطالعه، بیان ترانس کریپشن فاکتورهای مهم که برای سلول‌های بنیادی ضروری است، بررسی شد. این مارکرها شامل Sox2 ،Nanog ،Pou5f1 بودند [10] بیان این فاکتورها در سلول‌های بنیادی اولیه و پرتوان گزارش شده است [11].
علاوه‌براین، مطالعات قبلی ثابت کردند که هر ۳ فاکتور فوق در سلول‌های بنیادی مشتق از مغز استخوان انسان و گوسفند نیز بیان می‌شوند [1، 3]. Oct4 یک ترانس کریپشن فاکتور شناخته‌شده برای سلول‌های پرتوان است و به نظر می‌رسد نقش کلیدی در پایه‌ریزی و تعیین هویت رده سلول‌های زایا دارد. محققان اخیراً نشان داده‌اند که Oct4 در سلول‌های زایا نیز بیان می‌شود. نتایج تحقیقات قبلی نشان دادند سلول‌های زایا می‌توانند لابه‌لای سلول‌های بنیادی تخمدان حضور داشته باشند [12].
در مطالعه‌ای که قبلاً روی سلول‌های بنیادی تکای گوسفند انجام شد، نشان داده شد سلول‌های بنیادی تکای گوسفندی مارکر Oct4 را بیشتر از Nanog بیان کردند و این در حالی بود که فاکتور Nanog بیشتر از Sox2 بیان شد. علاوه‌براین، محققان در این مطالعه نشان دادند هر ۳ فاکتور در تخمدان جنین گوسفندی بیان بسیار قابل ملاحظه و بالایی داشت [1]. در مطالعه دیگری که بر روی سلول‌های بنیادی تکای خوکی انجام شد، محققان نشان دادند این سلول‌های چند توان، توانایی بیان مارکرهای Oct4 و Nanog را ندارند، اما همچون سلول‌های بنیادی مزانشیمی می‌توانند تکثیر شوند و پس از چند پاساژ به جمعیت یکدستی تبدیل می‌شوند. در حالی که آن‌ها نشان دادند این سلول‌ها می‌توانند فاکتور Sox2 را بیان کنند [13].
تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های شبه‌استخوان و سلول‌های شبه‌چربی با رنگآمیزی آلیزارین رد و اویل رد تأیید شد. یافته‌های مطالعه قبلی نشان داده است سلول‌های چند توان مشتق از سلول‌های مغز استخوان [14] و چربی [15] نیز توانایی تمایز به استخوان و چربی را دارند. نتایج مطالعه حاضر بر روی سلول‌های بنیادی تکای مشتق از تخمدان گوسفند، خوک و انسان نیز مشابه یافته‌های این مقاله بود.
نتیجه‌گیری
یافته‌های این مطالعه نشان داد سلول‌های بنیادی تخمدان، شامل سلول‌های بنیادی چند توان هستند که قادرند نشانگرهای مربوط به سلول‌های بنیادی را بیان کنند و به رده‌های سلولی از قبیل سلول‌های شبه‌استخوان و شبه‌چربی تمایز یابند. نتایج حاصل از این مطالعه بیانگر این است که باتوجه‌به خصوصیات سلول‌های بنیادی حاصل از تخمدان، این سلول‌ها نیز می‌توانند در سلول‌درمانی و پزشکی احیاکننده استفاده شود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم پزشکی تهران این مطالعه را با شناسه (IR.IAU.TMU.REC.1401.172) تأیید کرد.
حامی مالی
تأمین منابع مالی آن به عهده نویسنده بوده است.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسنده مقاله از مهدی علیخانی کمال تشکر و قدردانی را دارد.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
بافت شناسی و جنین شناسی
دریافت: 1401/6/6 | پذیرش: 1401/7/24 | انتشار: 1401/8/10
دریافت: 1401/6/6 | پذیرش: 1401/7/24 | انتشار: 1401/8/10
فهرست منابع
1. Adib S, Valojerdi MR. Molecular assessment, characterization, and differentiation of theca stem cells imply the presence of mesenchymal and pluripotent stem cells in sheep ovarian theca layer. Res Vet Sci. 2017; 114:378-87. [DOI:10.1016/j.rvsc.2017.06.021] [PMID] [DOI:10.1016/j.rvsc.2017.06.021]
2. Porras-Gómez TJ, Moreno-Mendoza N. Neo-oogenesis in mammals. Zygote. 2017; 25(4):404-22. [DOI:10.1017/S0967199417000363] [PMID] [DOI:10.1017/S0967199417000363]
3. Dalman A, Totonchi M, Valojerdi MR. Human ovarian theca-derived multipotent stem cells have thepotential to differentiate into oocyte-like cells in vitro. Cell J. 2019; 20(4):527-36. [doi:10.22074/cellj.2019.5651]
4. Schubert C. Theca cell source. Biol Reprod. 2015; 93(2):26. [DOI:10.1095/biolreprod.115.131383] [DOI:10.1095/biolreprod.115.131383]
5. Young JM, McNeilly AS. Theca: the forgotten cell of the ovarian follicle. Reproduction. 2010; 140(4):489-504. [DOI:10.1530/REP-10-0094] [PMID] [DOI:10.1530/REP-10-0094]
6. Ghaneialvar H, Soltani L, Rahmani HR, Lotfi AS, Soleimani M. Characterization and classification of mesenchymal stem cells in several species using surface markers for cell therapy purposes. Indian J Clin Biochem. 2018; 33(1):46-52. [DOI:10.1007/s12291-017-0641-x] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1007/s12291-017-0641-x]
7. Lin CS, Xin ZC, Dai J, Lue TF. Commonly used mesenchymal stem cell markers and tracking labels: Limitations and challenges. Histol Histopathol. 2013; 28(9):1109-16. [doi:10.14670/hh-28.1109]
8. Ghasemzadeh-Hasankolaei M, Eslaminejad MB, Sedighi-Gilani M. Derivation of male germ cells from ram bone marrow mesenchymal stem cells by three different methods and evaluation of their fate after transplantation into the testis. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2016; 52(1):49-61.[DOI:10.1007/s11626-015-9945-4] [PMID] [DOI:10.1007/s11626-015-9945-4]
9. Adib S, Tiraihi T, Darvishi M, Taheri T, Kazemi H. Cholinergic differentiation of neural stem cells generated from cell aggregates-derived from Human Bone marrow stromal cells. Tissue Eng Regen Med. 2015; 12:43-52. [DOI:10.1007/s13770-014-0019-6] [DOI:10.1007/s13770-014-0019-6]
10. Wang KH, Kao AP, Chang CC, Lin TC, Kuo TC. Upregulation of Nanog and Sox-2 genes following ectopic expression of Oct-4 in amniotic fluid mesenchymal stem cells. Biotechnol Appl Biochem. 2015; 62(5):591-7. [DOI:10.1002/bab.1315] [PMID] [DOI:10.1002/bab.1315]
11. Swain N, Thakur M, Pathak J, Swain B. SOX2, OCT4 and NANOG: The core embryonic stem cell pluripotency regulators in oral carcinogenesis. J Oral Maxillofac Pathol. 2020; 24(2):368-73. [DOI:10.4103/jomfp.JOMFP_22_20] [PMID] [PMCID] [DOI:10.4103/jomfp.JOMFP_22_20]
12. Cheng L, Thomas A, Roth LM, Zheng W, Michael H, Karim FWA. OCT4: a novel biomarker for dysgerminoma of the ovary. Am J Surg Pathol. 2004; 28(10):1341-6. [DOI:10.1097/01.pas.0000135528.03942.1f] [PMID] [DOI:10.1097/01.pas.0000135528.03942.1f]
13. Lee YM, Kumar BM, Lee JH, Lee WJ, Kim TH, Lee SL, et al. Characterisation and differentiation of porcine ovarian theca-derived multipotent stem cells. Vet J. 2013; 197(3):761-8. [DOI:10.1016/j.tvjl.2013.04.011] [PMID] [DOI:10.1016/j.tvjl.2013.04.011]
14. Sun Q, Nakata H, Yamamoto M, Kasugai S, Kuroda S. Comparison of gingiva-derived and bone marrow mesenchymal stem cells for osteogenesis. J Cell Mol Med. 2019; 23(11):7592-601. [DOI:10.1111/jcmm.14632] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1111/jcmm.14632]
15. Sanghani-Kerai A, Black C, Cheng SO, Collins L, Schneider N, Blunn G, et al. Clinical outcomes following intra-articular injection of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis in dogs characterized by weight-bearing asymmetry. Bone Joint Res. 2021; 10(10):650-8. [DOI:10.1302/2046-3758.1010.BJR-2020-0540.R1] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1302/2046-3758.1010.BJR-2020-0540.R1]
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
