جلد 18 -
جلد 18 - صفحات 0-0 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Ethics code: IR.IAU.FALA.REC.1399.014
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Zolfaghari A, Beheshti-Maal K, Ahadi A M, Monajemi R. Clinical and Epidemiological Characteristics of Leishmania Species in Isfahan, Iran. Qom Univ Med Sci J 2024; 18 : 2943.1
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3795-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3795-fa.html
ذوالفقاری آزاده، بهشتی مآل کیوان، احدی علی‌محمد، منجمی رامش. مشخصات بالینی و اپیدمیولوژیک گونه‌های لیشمانیا در اصفهان، ایران. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1403; 18 ()
آزاده ذوالفقاری1 
، کیوان بهشتی مآل* 2، علی‌محمد احدی3 ، رامش منجمی4
، کیوان بهشتی مآل* 2، علی‌محمد احدی3 ، رامش منجمی4
1- گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، فلاورجان، ایران.
2- گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، فلاورجان، ایران. ،beheshtimaal@iaufala.ac.ir
3- گروه ژنتیک، دانشکده علوم، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
4- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، فلاورجان، ایران.
2- گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، فلاورجان، ایران. ،
3- گروه ژنتیک، دانشکده علوم، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران.
4- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، فلاورجان، ایران.
متن کامل [PDF 4555 kb]
(298 دریافت)
| چکیده (HTML) (742 مشاهده)
متن کامل: (219 مشاهده)
مقدمه
لیشمانیوز از بیماری‌های انگلی منتقله توسط بندپایان است که به‌وسیله تک‌یاخته‌های کینتوپلاستی از جنس لیشمانیا ایجاد می‌شود [1]. لیشمانیوز یک مشکل بهداشت عمومی در سراسر جهان است و یکی از نگرانی‌های اصلی سازمان بهداشت جهانی است. در حال حاضر 104 کشور بومی لیشمانیوز هستند. سالانه 5/1 تا 2 میلیون مورد جدید با 20000 تا 30000 مرگ رخ می‌دهد [2]. ازنظر بالینی 3 نوع اصلی لیشمانیوز وجود دارد که شامل لیشمانیوز جلدی، لیشمانیوز احشایی و لیشمانیوز مخاطی جلدی هستند. حدود 20 گونه مختلف از انگل‌های لیشمانیا شناسایی شده‌اند که باعث لیشمانیوز می‌شوند [3]. برخی از گونه‌های لیشمانیا مانند لیشمانیاماژور، لیشمانیاتروپیکا، لیشمانیااتیوپیکا، لیشمانیا مکزیکانا، لیشمانیابرازیلینسیس و لیشمانیاآمازینسیس انگل‌های اصلی درگیر در بیماری‌زایی لیشمانیوز جلدی هستند [4]. ایران یکی از مهم‌ترین مناطق آندمیک است که لیشمانیوز جلدی در آن به 2 صورت مشاهده می‌شود. لیشمانیوز جلدی زئونوزیک یا روستایی و لیشمانیوز جلدی آنتروپونوتیک یا شهری لیشمانیوز جلدی روستایی در حدود 17 استان ایران از‌جمله استان اصفهان بومی است [5]. نوع شهری توسط لیشمانیاتروپیکا با تظاهرات بالینی مانند زخم‌های کوچک و خشک و با دوره عفونت طولانی‌تر ایجاد می‌شود. از سوی دیگر، نوع روستایی توسط لیشمانیاماژور ایجاد می‌شود و تظاهرات بالینی آن زخم‌های بزرگ، زخم‌های مرطوب و با دوره عفونت کوتاه‌تر است [4، 6]. علی‌رغم تلاش فراوان مسئولان بهداشتی و درمانی برای کنترل لیشمانیوز جلدی در اصفهان، کانون‌های جدیدی در نقاط مختلف استان آشکار شده است. ازآنجایی‌که این بیماری یک معضل عمده بهداشتی است و بار روانی، اجتماعی و اقتصادی جدی بر جامعه دارد، در برنامه ملی کنترل لیشمانیوز، شناخت و تبیین ابعاد مختلف این بیماری مورد تأکید قرار گرفته است [7]؛ بنابراین شناسایی گونه‌های لیشمانیا در مناطق آندمیک برای تعیین ناقل اصلی بیماری، تعیین اثر درمانی روش‌های مختلف و انتخاب استراتژی مناسب برای کنترل لیشمانیوز جلدی ضروری است. هدف از این مطالعه تعیین الگوی اپیدمیولوژیک و بالینی گونه لیشمانیا در بیماران مبتلا به لیشمانیوز جلدی در اصفهان به‌منظور بهبود سیستم مراقبت این بیماری است؛ بنابراین مطالعه حاضر با هدف ارائه یک نمای کلی از بیماری شامل معاینه بیماران و میزان بهبودی و همچنین تعیین ویژگی‌های جمعیت‌شناختی بیماری و شناسایی مولکولی گونه‌های عامل لیشمانیا در طول سالهای 1399 و 1400 انجام شد.
مواد و روش‌ها
70 نمونه از بیماران مشکوک به لیشمانیوز جلدی مراجعه‌کننده به آزمایشگاه مرکز تحقیقات بیماری‌های پوستی و سالک دانشگاه علوم‌پزشکی اصفهان برای تشخیص و درمان ضایعات پوستی توسط کارشناسان آزمایشگاه طی سالهای 1399 و 1400 جمع‌آوری شد. رضایت‌نامه از همه بیماران گرفته شد. تشخیص در درجه اول بر‌اساس علائم بالینی توسط متخصص پوست بود. مشاهده میکروسکوپی انگل‌ها بر روی لام مستقیم رنگ‌آمیزی‌شده اعمال شد. سروزیته ضایعه پوستی توسط بیستوری تراشیده شد و بر روی لام‌های شیشه‌ای پخش شد. سپس در هوا خشک و با متانول مطلق تثبیت شد و پس از خشک شدن با گیمسا رنگ‌آمیزی شد. همه اسلایدهای رنگ‌آمیزی‌شده در زیر میکروسکوپ نوری با زوم بالا (100 ×) و با روغن ایمرسیون برای کشف آماستیگوت‌های درون‌سلولی و خارج سلولی مشاهده شدند [8]. سپس لام اسلایدهای رنگ‌آمیزی که نتیجه مثبت لیشمانیا آماستیگوت را نشان دادند، برای تشخیص تأییدی به روش Nested PCR و شناسایی گونه لیشمانیا استفاده شدند. نمونه‌های اسمیر مستقیم تحت روش‌های استخراج DNA کل، با استفاده از پروتکل استاندارد فنل‌ـ‌کلروفرم، قرار گرفتند [9]. Nested-PCR با روش استاندارد برای شناسایی انواع لیشمانیا با استفاده از پرایمرهایی که به‌طور خاص برای SrRNA 18 طراحی شده بودند، پس از هم‌ترازی با توالی‌های ثبت‌شده در بانک ژنوم NCBI انجام شد [10]. توالی و سایر خواص این پرایمرها و آمپلیکون‌های مربوط به آن‌ها در جدول شماره 1 قابل‌دسترسی است. همچنین تصویر شماره 1 نموداری از محل پرایمرهای طراحی شده را نشان می‌دهد. همچنین در این مطالعه چک‌لیستی از بیماران شامل سن، جنسیت، محل یا تعداد ضایعات، شغل، سابقه سفر به منطقه اندمیک، محل سکونت، نتایج آزمایش‌های بالینی و آزمایشگاهی، نوع درمان، میزان بهبودی تکمیل شد. بیماران با گلوکانتیم سیستمیک یا تزریق داخل ضایعه بر‌اساس پروتکل استاندارد درمان لیشمانیوز و تحت‌نظر پزشک مجرب تحت درمان قرار گرفتند. درمان سیستمیک با تجویز روزانه 20 میلی‌گرم بر کیلوگرم گلوکانتیم، در روز به مدت 21 روز انجام شد. تزریق داخل ضایعه گلوکانتیم، هر هفته به مدت حداکثر 12 هفته انجام شد. بیماران در فواصل 1 هفته تا 12 هفته پس از شروع درمان بر‌اساس اندازه‌گیری ضایعات و معاینه بالینی و همچنین 3 ماه بعد پایان درمان پیگیری شدند [11]. پاسخ به درمان بیماران به 3 گروه مختلف تقسیم شد: بهبودی کامل، بهبودی نسبی و بدون التیام. بهبودی کامل شامل ناپدید شدن تمام واکنش‌های التهابی از‌جمله جوش یا سفتی، تشکیل اسکار یا اپیتلیالیزاسیون مجدد کامل ضایعه تعیین می‌شود. بهبودی نسبی به معنای کاهش اندازه یا ایندوراسیون و تداوم ضایعه است و عدم بهبودی به‌عنوان عدم تغییر قابل‌توجه در اندازه ضایعه یا بدتر شدن ضایعه است [12].
در انتها داده‌های جمع‌آوری‌شده با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 24 (آمار IBM SPSS.، شیکاگو) کدگذاری، جدول‌بندی و تجزیه‌و‌تحلیل آماری شدند. ما از آزمون کای‌اسکوئر برای ارزیابی متغیرهای طبقه‌بندی‌شده و تشخیص اینکه آیا ویژگی‌های بالینی در گونه‌های لیشمانیا متفاوت است یا خیر، استفاده کردیم.
یافته‌ها
معاینات بالینی و آزمایشگاهی اولین مرحله غربالگری بیماران مبتلا به لیشمانیوز مراجعه‌کننده به مرکز تحقیقات پوست و سالک در آزمایشگاه است. تصویر شماره 2 تصاویر ضایعات مربوط به 3 بیمار و همچنین تصاویر میکروسکوپی ضایعات را نشان می‌دهد. 62 بیمار ازنظر تشخیص بالینی و میکروسکوپی مثبت گزارش شدند. سپس آنالیزهای آزمایشگاهی و بالینی با تشخیص مولکولی Nested-PCR برای شناسایی گونه‌های لیشمانیا دنبال شد. نتایج PCR نشان داد همه 62 لام مثبت رنگ‌آمیزی‌شده ازنظر وجود انگل لیشمانیا مثبت بودند و از این 62 نمونه، 54 نمونه مربوط به لیشمانیاماژور و 8 نمونه مربوط به لیشمانیاتروپیکا بود.
سپس چک‌لیست ثبت‌شده از بیماران، شامل مشخصات جمعیت‌شناختی و مشخصات بالینی آن‌ها بررسی شد. مشخصات جمعیت‌شناختی بیماران در جدول شماره 2 نشان داده شده است. نتایج این بررسی‌ها نشان داد 03/79 درصد از بیماران مرد و 96/20 درصد زن بودند. همچنین بیشترین فراوانی بیماران در گروه سنی 30 تا 39 سال بود. اکثریت بیماران (65/80 درصد) هیچ سابقه سفر به مناطق آندمیک در سال اخیر نداشتند. از این تعداد 032/79 درصد شهرنشین و 97/20 درصد ساکن روستا بودند. در جدول شماره 3 ارتباط بین گونه لیشمانیا و ویژگی‌های بالینی بیماران گزارش شده است. تعداد ضایعات در اکثر بیماران 1 تا 2 ضایعه بود. شایع‌ترین محل ضایعات در هر 2 گونه لیشمانیا، دست بود. در بیماران آلوده به گونه لیشمانیاتروپیکا، 37 درصد بیماران بهبودی نسبی را ثبت کردند و 37 درصد پس از اتمام دوره درمان عدم بهبودی را نشان دادند. درحالی‌که در گروه مبتلا به لیشمانیاماژور هیچ موردی از عدم بهبودی یافت نشد و تنها 11 درصد بیماران بهبود نسبی داشتند. در‌واقع، رابطه بین گونه لیشمانیا و میزان بهبودی معنی‌دار بود (05/0>P).
بحث
طی دهه‌های گذشته، باتوجه‌به مهاجرت از کشورهای همسایه به ایران، انگیزه جابه‌جایی جمعیت بین مناطق شهری و روستایی، تغییرات جمعیتی و تغییرات اقلیمی، جنبه‌های اپیدمیولوژیک لیشمانیوز جلدی در ایران تغییر کرده است. در‌واقع تغییرات در اپیدمیولوژی لیشمانیوز جلدی و شناسایی گونه‌های غالب لیشمانیا به دلیل تفاوت در میزبان‌های مخزن و همچنین شناسایی خصوصیات بالینی و اپیدمیولوژیک برای استراتژی‌های مؤثر درمانی و کنترل بیماری حیاتی است [11]. مدیریت کنترل لیشمانیوز نیاز به شناسایی گونه‌های عامل آن دارد، زیرا عفونت ناشی از گونه‌های مختلف ممکن است نیاز به رژیم‌های درمانی جداگانه داشته باشد. همچنین دانستن اپیدمیولوژی لیشمانیوز به‌عنوان مؤلفه اصلی برای برنامه‌ریزی برای کنترل و مبارزه با این بیماری بسیار مفید است [13]. در این مطالعه از روش Nested-PCR برای تأیید تشخیص و تعیین گونه لیشمانیا با استفاده از DNA استخراج‌شده از سروزیت ضایعات پوستی استفاده شد. روش‌های مبتنی بر PCR ابزار قدرتمند و دقیقی برای تشخیص لیشمانیوز جلدی هستند. بسیاری از محققین ویژگی بالای این روش و حساسیتی بین ۹۲ تا ۹۸ درصد برای آن را گزارش کرده‌اند. که به نظر می‌رسد حساس‌ترین تست تشخیصی تکی برای نوع لیشمانیا باشد [14، 15]. در این مطالعه تمامی بیماران با اسمیر مثبت در روش PCR نیز مثبت گزارش شدند. از کل مجموع جدایه‌های لیشمانیا، 54 جدایه (1/87 درصد) و 8 (9/12 درصد) جدایه به ترتیب مربوط به لیشمانیاماژور و لیشمانیاتروپیکا شناسایی شدند. نتایج مطالعات قبلی نشان داده است لیشمانیاماژور عامل اصلی لیشمانیوز جلدی در اصفهان است که با نتایج مطالعه ما مطابقت دارد [16، 17]. وجود 9/12 درصد لیشمانیاتروپیکا در نمونه‌های جدا‌شده ممکن است با تغییرات جمعیتی و آب‌وهوایی مرتبط باشد. شاید مهاجرت از روستا به شهر عامل خطر اصلی برای لیشمانیوز جلدی آنتروپونتیک به دلیل اقامت در حومه فقیر باشد. این مطالعه که در بین بیماران مبتلا به لیشمانیوز جلدی مراجعه‌کننده به مرکز تحقیقات بیماری‌های پوستی و سالک استان اصفهان انجام شد، نشان داد تعداد مردان مبتلا به لیشمانیوز جلدی به‌طور معنی‌داری از زنان بیمار بیشتر است و همچنین اکثر بیماران ساکن مناطق شهری بوده و بیشترین تعداد مبتلایان از بین مشاغل کارگری بوده است. همچنین اکثر بیماران در محدوده سنی 30 تا 39 سال قرار داشتند. ازنظر مشخصات بالینی، ضایعات در دست (77/46 درصد)، پا (97/20 درصد)، صورت (74/17 درصد)، تنه (45/6 درصد) و گردن (06/8 درصد) بود. همچنین نتایج این مطالعه نشان داد درمان بیماران مبتلا به گونه لیشمانیاماژور موفق‌تر از گونه لیشمانیاتروپیکا بوده است. کرمی و همکاران گزارش کردند اکثر بیماران بیش از 1 زخم داشتند و بیشتر بیماران مرد بودند و بیشتر زخم‌ها در قسمت قدامی بدن و اکثریت بیماران مرد و 2/31 درصد در رنج سنی 21 تا 30 سال بودند که نتایج به‌دست‌آمده از مطالعه ما با آن‌ها مطابقت دارد [18]. در برخی مطالعات، زنان بیشتر مستعد ابتلا به لیشمانیوز بودند و نتایج ما با آن‌ها مطابقت نداشت [19، 20]. بنابراین به نظر می‌رسد امکان وجود بیماری در مردان به دلیل فعالیت‌های بیرون از منزل و امکان در معرض قرار گرفتن در محیط باز بیشتر از زنان است و به دلیل در معرض بودن بیشتر نسبت به بقیه اندام‌ها، احتمال وجود ضایعه در دست‌ها بیشتر است.
در مطالعه خسروی و همکاران، اکثر ضایعات لیشمانیوز جلدی در دست قرار داشتند [21]. در مطالعه حاتمی و همکاران نیز دست‌ها بیشترین آسیب را داشتند و لیشمانیوز جلدی زونوتیک نوع غالب بود [22]. همچنین در برخی مطالعات میزان درگیری مردان بیشتر از زنان بود [20، 23، 24]. در مطالعه اخلاق و همکاران، میانگین سنی بیماران 8/11±7/32 سال بود [24]. همه این نتایج با نتایج ما مطابقت دارد. در مطالعه دیگری، در گروه سنی 20 تا 29 سال، 1/32 درصد فراوانی لیشمانیوز جلدی بود که نتایج ما با آن‌ها همخوانی نداشت [25]. در مطالعه‌ای که توسط رضایی و همکاران انجام شد، اکثر موارد (35/47 درصد) با درمان موضعی گلوکانتیم درمان شدند که با نتایج ما مطابقت داشت [26]. بنابراین اکثراً گونه لیشمانیاماژور مسبب لیشمانیوز جلدی که عامل ایجاد‌کننده نوع مرطوب بیماری است، دوره عفونت کوتاه‌تری را ایجاد می‌کند و پاسخ به درمان استاندارد در این گروه بهتر است.
نتیجه‌گیری
فراوانی لیشمانیوز بسته به جنس، سن، شغل، محل زندگی و محل ضایعات متفاوت است. این یافته‌ها به بحث بهتر در‌مورد پیشگیری و درمان عفونت کمک می‌کند. همچنین موفقیت درمان بیماران با داروهای استاندارد در گونه‌های مختلف، مسبب بیماری متفاوت است. بنابراین شناخت گونه عامل لیشمانیوز می‌تواند در تصمیم‌گیری در خصوص بهترین درمان مؤثر باشد. ازآنجایی‌که تعداد قابل‌توجهی از بیماران آلوده به گونه لیشمانیاتروپیکا نسبت به گلوکانتیم مقاوم هستند. بنابراین، کاهش مواجهه با ناقل و توسعه داروهای جایگزین مؤثر جدید، اقدامات ضروری در برابر لیشمانیوز جلدی ناشی از لیشمانیاتروپیکا است.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
تأییدیه اخلاقی این پژوهش با کد IR.IAU.FALA.REC.1399.014 توسط کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان تأیید شد.
حامی مالی
این مقاله برگرفته از پایان نامه مقطع دکتری تخصصی آزاده ذوالفقاری تایید شده توسط گروه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان می باشد.
مشارکت نویسندگان
ایده پردازی، نگارش، نقد و تدوین مقاله: آزاده ذوالفقاری، کیوان بهشتی مآل، علی‌محمد احدی و رامش منجمی؛ طراحی و نظارت و گردآوری داده‌ها: آزاده ذوالفقاری، کیوان بهشتی مآل و علی محمد احدی.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
از حمایت‌های دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، دانشگاه شهرکرد و مرکز تحقیقات بیماری‌های پوستی و سالک دانشگاه علوم‌پزشکی اصفهان تشکر می‌کنیم.
لیشمانیوز از بیماری‌های انگلی منتقله توسط بندپایان است که به‌وسیله تک‌یاخته‌های کینتوپلاستی از جنس لیشمانیا ایجاد می‌شود [1]. لیشمانیوز یک مشکل بهداشت عمومی در سراسر جهان است و یکی از نگرانی‌های اصلی سازمان بهداشت جهانی است. در حال حاضر 104 کشور بومی لیشمانیوز هستند. سالانه 5/1 تا 2 میلیون مورد جدید با 20000 تا 30000 مرگ رخ می‌دهد [2]. ازنظر بالینی 3 نوع اصلی لیشمانیوز وجود دارد که شامل لیشمانیوز جلدی، لیشمانیوز احشایی و لیشمانیوز مخاطی جلدی هستند. حدود 20 گونه مختلف از انگل‌های لیشمانیا شناسایی شده‌اند که باعث لیشمانیوز می‌شوند [3]. برخی از گونه‌های لیشمانیا مانند لیشمانیاماژور، لیشمانیاتروپیکا، لیشمانیااتیوپیکا، لیشمانیا مکزیکانا، لیشمانیابرازیلینسیس و لیشمانیاآمازینسیس انگل‌های اصلی درگیر در بیماری‌زایی لیشمانیوز جلدی هستند [4]. ایران یکی از مهم‌ترین مناطق آندمیک است که لیشمانیوز جلدی در آن به 2 صورت مشاهده می‌شود. لیشمانیوز جلدی زئونوزیک یا روستایی و لیشمانیوز جلدی آنتروپونوتیک یا شهری لیشمانیوز جلدی روستایی در حدود 17 استان ایران از‌جمله استان اصفهان بومی است [5]. نوع شهری توسط لیشمانیاتروپیکا با تظاهرات بالینی مانند زخم‌های کوچک و خشک و با دوره عفونت طولانی‌تر ایجاد می‌شود. از سوی دیگر، نوع روستایی توسط لیشمانیاماژور ایجاد می‌شود و تظاهرات بالینی آن زخم‌های بزرگ، زخم‌های مرطوب و با دوره عفونت کوتاه‌تر است [4، 6]. علی‌رغم تلاش فراوان مسئولان بهداشتی و درمانی برای کنترل لیشمانیوز جلدی در اصفهان، کانون‌های جدیدی در نقاط مختلف استان آشکار شده است. ازآنجایی‌که این بیماری یک معضل عمده بهداشتی است و بار روانی، اجتماعی و اقتصادی جدی بر جامعه دارد، در برنامه ملی کنترل لیشمانیوز، شناخت و تبیین ابعاد مختلف این بیماری مورد تأکید قرار گرفته است [7]؛ بنابراین شناسایی گونه‌های لیشمانیا در مناطق آندمیک برای تعیین ناقل اصلی بیماری، تعیین اثر درمانی روش‌های مختلف و انتخاب استراتژی مناسب برای کنترل لیشمانیوز جلدی ضروری است. هدف از این مطالعه تعیین الگوی اپیدمیولوژیک و بالینی گونه لیشمانیا در بیماران مبتلا به لیشمانیوز جلدی در اصفهان به‌منظور بهبود سیستم مراقبت این بیماری است؛ بنابراین مطالعه حاضر با هدف ارائه یک نمای کلی از بیماری شامل معاینه بیماران و میزان بهبودی و همچنین تعیین ویژگی‌های جمعیت‌شناختی بیماری و شناسایی مولکولی گونه‌های عامل لیشمانیا در طول سالهای 1399 و 1400 انجام شد.
مواد و روش‌ها
70 نمونه از بیماران مشکوک به لیشمانیوز جلدی مراجعه‌کننده به آزمایشگاه مرکز تحقیقات بیماری‌های پوستی و سالک دانشگاه علوم‌پزشکی اصفهان برای تشخیص و درمان ضایعات پوستی توسط کارشناسان آزمایشگاه طی سالهای 1399 و 1400 جمع‌آوری شد. رضایت‌نامه از همه بیماران گرفته شد. تشخیص در درجه اول بر‌اساس علائم بالینی توسط متخصص پوست بود. مشاهده میکروسکوپی انگل‌ها بر روی لام مستقیم رنگ‌آمیزی‌شده اعمال شد. سروزیته ضایعه پوستی توسط بیستوری تراشیده شد و بر روی لام‌های شیشه‌ای پخش شد. سپس در هوا خشک و با متانول مطلق تثبیت شد و پس از خشک شدن با گیمسا رنگ‌آمیزی شد. همه اسلایدهای رنگ‌آمیزی‌شده در زیر میکروسکوپ نوری با زوم بالا (100 ×) و با روغن ایمرسیون برای کشف آماستیگوت‌های درون‌سلولی و خارج سلولی مشاهده شدند [8]. سپس لام اسلایدهای رنگ‌آمیزی که نتیجه مثبت لیشمانیا آماستیگوت را نشان دادند، برای تشخیص تأییدی به روش Nested PCR و شناسایی گونه لیشمانیا استفاده شدند. نمونه‌های اسمیر مستقیم تحت روش‌های استخراج DNA کل، با استفاده از پروتکل استاندارد فنل‌ـ‌کلروفرم، قرار گرفتند [9]. Nested-PCR با روش استاندارد برای شناسایی انواع لیشمانیا با استفاده از پرایمرهایی که به‌طور خاص برای SrRNA 18 طراحی شده بودند، پس از هم‌ترازی با توالی‌های ثبت‌شده در بانک ژنوم NCBI انجام شد [10]. توالی و سایر خواص این پرایمرها و آمپلیکون‌های مربوط به آن‌ها در جدول شماره 1 قابل‌دسترسی است. همچنین تصویر شماره 1 نموداری از محل پرایمرهای طراحی شده را نشان می‌دهد. همچنین در این مطالعه چک‌لیستی از بیماران شامل سن، جنسیت، محل یا تعداد ضایعات، شغل، سابقه سفر به منطقه اندمیک، محل سکونت، نتایج آزمایش‌های بالینی و آزمایشگاهی، نوع درمان، میزان بهبودی تکمیل شد. بیماران با گلوکانتیم سیستمیک یا تزریق داخل ضایعه بر‌اساس پروتکل استاندارد درمان لیشمانیوز و تحت‌نظر پزشک مجرب تحت درمان قرار گرفتند. درمان سیستمیک با تجویز روزانه 20 میلی‌گرم بر کیلوگرم گلوکانتیم، در روز به مدت 21 روز انجام شد. تزریق داخل ضایعه گلوکانتیم، هر هفته به مدت حداکثر 12 هفته انجام شد. بیماران در فواصل 1 هفته تا 12 هفته پس از شروع درمان بر‌اساس اندازه‌گیری ضایعات و معاینه بالینی و همچنین 3 ماه بعد پایان درمان پیگیری شدند [11]. پاسخ به درمان بیماران به 3 گروه مختلف تقسیم شد: بهبودی کامل، بهبودی نسبی و بدون التیام. بهبودی کامل شامل ناپدید شدن تمام واکنش‌های التهابی از‌جمله جوش یا سفتی، تشکیل اسکار یا اپیتلیالیزاسیون مجدد کامل ضایعه تعیین می‌شود. بهبودی نسبی به معنای کاهش اندازه یا ایندوراسیون و تداوم ضایعه است و عدم بهبودی به‌عنوان عدم تغییر قابل‌توجه در اندازه ضایعه یا بدتر شدن ضایعه است [12].
در انتها داده‌های جمع‌آوری‌شده با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 24 (آمار IBM SPSS.، شیکاگو) کدگذاری، جدول‌بندی و تجزیه‌و‌تحلیل آماری شدند. ما از آزمون کای‌اسکوئر برای ارزیابی متغیرهای طبقه‌بندی‌شده و تشخیص اینکه آیا ویژگی‌های بالینی در گونه‌های لیشمانیا متفاوت است یا خیر، استفاده کردیم.
یافته‌ها
معاینات بالینی و آزمایشگاهی اولین مرحله غربالگری بیماران مبتلا به لیشمانیوز مراجعه‌کننده به مرکز تحقیقات پوست و سالک در آزمایشگاه است. تصویر شماره 2 تصاویر ضایعات مربوط به 3 بیمار و همچنین تصاویر میکروسکوپی ضایعات را نشان می‌دهد. 62 بیمار ازنظر تشخیص بالینی و میکروسکوپی مثبت گزارش شدند. سپس آنالیزهای آزمایشگاهی و بالینی با تشخیص مولکولی Nested-PCR برای شناسایی گونه‌های لیشمانیا دنبال شد. نتایج PCR نشان داد همه 62 لام مثبت رنگ‌آمیزی‌شده ازنظر وجود انگل لیشمانیا مثبت بودند و از این 62 نمونه، 54 نمونه مربوط به لیشمانیاماژور و 8 نمونه مربوط به لیشمانیاتروپیکا بود.
سپس چک‌لیست ثبت‌شده از بیماران، شامل مشخصات جمعیت‌شناختی و مشخصات بالینی آن‌ها بررسی شد. مشخصات جمعیت‌شناختی بیماران در جدول شماره 2 نشان داده شده است. نتایج این بررسی‌ها نشان داد 03/79 درصد از بیماران مرد و 96/20 درصد زن بودند. همچنین بیشترین فراوانی بیماران در گروه سنی 30 تا 39 سال بود. اکثریت بیماران (65/80 درصد) هیچ سابقه سفر به مناطق آندمیک در سال اخیر نداشتند. از این تعداد 032/79 درصد شهرنشین و 97/20 درصد ساکن روستا بودند. در جدول شماره 3 ارتباط بین گونه لیشمانیا و ویژگی‌های بالینی بیماران گزارش شده است. تعداد ضایعات در اکثر بیماران 1 تا 2 ضایعه بود. شایع‌ترین محل ضایعات در هر 2 گونه لیشمانیا، دست بود. در بیماران آلوده به گونه لیشمانیاتروپیکا، 37 درصد بیماران بهبودی نسبی را ثبت کردند و 37 درصد پس از اتمام دوره درمان عدم بهبودی را نشان دادند. درحالی‌که در گروه مبتلا به لیشمانیاماژور هیچ موردی از عدم بهبودی یافت نشد و تنها 11 درصد بیماران بهبود نسبی داشتند. در‌واقع، رابطه بین گونه لیشمانیا و میزان بهبودی معنی‌دار بود (05/0>P).
بحث
طی دهه‌های گذشته، باتوجه‌به مهاجرت از کشورهای همسایه به ایران، انگیزه جابه‌جایی جمعیت بین مناطق شهری و روستایی، تغییرات جمعیتی و تغییرات اقلیمی، جنبه‌های اپیدمیولوژیک لیشمانیوز جلدی در ایران تغییر کرده است. در‌واقع تغییرات در اپیدمیولوژی لیشمانیوز جلدی و شناسایی گونه‌های غالب لیشمانیا به دلیل تفاوت در میزبان‌های مخزن و همچنین شناسایی خصوصیات بالینی و اپیدمیولوژیک برای استراتژی‌های مؤثر درمانی و کنترل بیماری حیاتی است [11]. مدیریت کنترل لیشمانیوز نیاز به شناسایی گونه‌های عامل آن دارد، زیرا عفونت ناشی از گونه‌های مختلف ممکن است نیاز به رژیم‌های درمانی جداگانه داشته باشد. همچنین دانستن اپیدمیولوژی لیشمانیوز به‌عنوان مؤلفه اصلی برای برنامه‌ریزی برای کنترل و مبارزه با این بیماری بسیار مفید است [13]. در این مطالعه از روش Nested-PCR برای تأیید تشخیص و تعیین گونه لیشمانیا با استفاده از DNA استخراج‌شده از سروزیت ضایعات پوستی استفاده شد. روش‌های مبتنی بر PCR ابزار قدرتمند و دقیقی برای تشخیص لیشمانیوز جلدی هستند. بسیاری از محققین ویژگی بالای این روش و حساسیتی بین ۹۲ تا ۹۸ درصد برای آن را گزارش کرده‌اند. که به نظر می‌رسد حساس‌ترین تست تشخیصی تکی برای نوع لیشمانیا باشد [14، 15]. در این مطالعه تمامی بیماران با اسمیر مثبت در روش PCR نیز مثبت گزارش شدند. از کل مجموع جدایه‌های لیشمانیا، 54 جدایه (1/87 درصد) و 8 (9/12 درصد) جدایه به ترتیب مربوط به لیشمانیاماژور و لیشمانیاتروپیکا شناسایی شدند. نتایج مطالعات قبلی نشان داده است لیشمانیاماژور عامل اصلی لیشمانیوز جلدی در اصفهان است که با نتایج مطالعه ما مطابقت دارد [16، 17]. وجود 9/12 درصد لیشمانیاتروپیکا در نمونه‌های جدا‌شده ممکن است با تغییرات جمعیتی و آب‌وهوایی مرتبط باشد. شاید مهاجرت از روستا به شهر عامل خطر اصلی برای لیشمانیوز جلدی آنتروپونتیک به دلیل اقامت در حومه فقیر باشد. این مطالعه که در بین بیماران مبتلا به لیشمانیوز جلدی مراجعه‌کننده به مرکز تحقیقات بیماری‌های پوستی و سالک استان اصفهان انجام شد، نشان داد تعداد مردان مبتلا به لیشمانیوز جلدی به‌طور معنی‌داری از زنان بیمار بیشتر است و همچنین اکثر بیماران ساکن مناطق شهری بوده و بیشترین تعداد مبتلایان از بین مشاغل کارگری بوده است. همچنین اکثر بیماران در محدوده سنی 30 تا 39 سال قرار داشتند. ازنظر مشخصات بالینی، ضایعات در دست (77/46 درصد)، پا (97/20 درصد)، صورت (74/17 درصد)، تنه (45/6 درصد) و گردن (06/8 درصد) بود. همچنین نتایج این مطالعه نشان داد درمان بیماران مبتلا به گونه لیشمانیاماژور موفق‌تر از گونه لیشمانیاتروپیکا بوده است. کرمی و همکاران گزارش کردند اکثر بیماران بیش از 1 زخم داشتند و بیشتر بیماران مرد بودند و بیشتر زخم‌ها در قسمت قدامی بدن و اکثریت بیماران مرد و 2/31 درصد در رنج سنی 21 تا 30 سال بودند که نتایج به‌دست‌آمده از مطالعه ما با آن‌ها مطابقت دارد [18]. در برخی مطالعات، زنان بیشتر مستعد ابتلا به لیشمانیوز بودند و نتایج ما با آن‌ها مطابقت نداشت [19، 20]. بنابراین به نظر می‌رسد امکان وجود بیماری در مردان به دلیل فعالیت‌های بیرون از منزل و امکان در معرض قرار گرفتن در محیط باز بیشتر از زنان است و به دلیل در معرض بودن بیشتر نسبت به بقیه اندام‌ها، احتمال وجود ضایعه در دست‌ها بیشتر است.
در مطالعه خسروی و همکاران، اکثر ضایعات لیشمانیوز جلدی در دست قرار داشتند [21]. در مطالعه حاتمی و همکاران نیز دست‌ها بیشترین آسیب را داشتند و لیشمانیوز جلدی زونوتیک نوع غالب بود [22]. همچنین در برخی مطالعات میزان درگیری مردان بیشتر از زنان بود [20، 23، 24]. در مطالعه اخلاق و همکاران، میانگین سنی بیماران 8/11±7/32 سال بود [24]. همه این نتایج با نتایج ما مطابقت دارد. در مطالعه دیگری، در گروه سنی 20 تا 29 سال، 1/32 درصد فراوانی لیشمانیوز جلدی بود که نتایج ما با آن‌ها همخوانی نداشت [25]. در مطالعه‌ای که توسط رضایی و همکاران انجام شد، اکثر موارد (35/47 درصد) با درمان موضعی گلوکانتیم درمان شدند که با نتایج ما مطابقت داشت [26]. بنابراین اکثراً گونه لیشمانیاماژور مسبب لیشمانیوز جلدی که عامل ایجاد‌کننده نوع مرطوب بیماری است، دوره عفونت کوتاه‌تری را ایجاد می‌کند و پاسخ به درمان استاندارد در این گروه بهتر است.
نتیجه‌گیری
فراوانی لیشمانیوز بسته به جنس، سن، شغل، محل زندگی و محل ضایعات متفاوت است. این یافته‌ها به بحث بهتر در‌مورد پیشگیری و درمان عفونت کمک می‌کند. همچنین موفقیت درمان بیماران با داروهای استاندارد در گونه‌های مختلف، مسبب بیماری متفاوت است. بنابراین شناخت گونه عامل لیشمانیوز می‌تواند در تصمیم‌گیری در خصوص بهترین درمان مؤثر باشد. ازآنجایی‌که تعداد قابل‌توجهی از بیماران آلوده به گونه لیشمانیاتروپیکا نسبت به گلوکانتیم مقاوم هستند. بنابراین، کاهش مواجهه با ناقل و توسعه داروهای جایگزین مؤثر جدید، اقدامات ضروری در برابر لیشمانیوز جلدی ناشی از لیشمانیاتروپیکا است.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
تأییدیه اخلاقی این پژوهش با کد IR.IAU.FALA.REC.1399.014 توسط کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان تأیید شد.
حامی مالی
این مقاله برگرفته از پایان نامه مقطع دکتری تخصصی آزاده ذوالفقاری تایید شده توسط گروه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان می باشد.
مشارکت نویسندگان
ایده پردازی، نگارش، نقد و تدوین مقاله: آزاده ذوالفقاری، کیوان بهشتی مآل، علی‌محمد احدی و رامش منجمی؛ طراحی و نظارت و گردآوری داده‌ها: آزاده ذوالفقاری، کیوان بهشتی مآل و علی محمد احدی.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
از حمایت‌های دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، دانشگاه شهرکرد و مرکز تحقیقات بیماری‌های پوستی و سالک دانشگاه علوم‌پزشکی اصفهان تشکر می‌کنیم.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
میکروب شناسی
دریافت: 1402/5/24 | پذیرش: 1402/7/3 | انتشار: 1403/2/10
دریافت: 1402/5/24 | پذیرش: 1402/7/3 | انتشار: 1403/2/10
فهرست منابع
1. Cortes S, Bruno de Sousa C, Morais T, Lago J, Campino L. Potential of the natural products against leishmaniasis in Old World-A review of in-vitro studies. Pathog Glob Health. 2020; 114(4):170-82. [DOI:10.1080/20477724.2020.1754655] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1080/20477724.2020.1754655]
2. Barbosa Gomes de Carvalho YM, Shanmugam S, Batista MS, Serafini MR, Araújo AAS, Quintans Júnior LJ. Pharmaceutical agents for treatment of leishmaniasis: A patent landscape. Expert Opin Ther Pat. 2020; 30(8):633-41. [DOI:10.1080/13543776.2020.1789100] [PMID] [DOI:10.1080/13543776.2020.1789100]
3. Cantanhêde LM, Mattos CB, de Souza Ronconi C, Filgueira CPB, da Silva Júnior CF, Limeira C, et al. First report of Leishmania (Viannia) lindenbergi causing tegumentary leishmaniasis in the Brazilian western Amazon region. Parasite. 2019; 26:30. [DOI:10.1051/parasite/2019030] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1051/parasite/2019030]
4. Zolfaghari A, Beheshti-Maal K, Ahadi AM, Monajemi R. Identification of Leishmania species and frequency distribution of LRV1 and LRV2 viruses on cutaneous leishmaniasis patients in Isfahan Province, Iran. Indian J Med Microbiol. 2023; 41:13-8. [DOI:10.1016/j.ijmmb.2022.11.008] [PMID] [DOI:10.1016/j.ijmmb.2022.11.008]
5. Soltani S, Foroutan M, Hezarian M, Afshari H, Kahvaz MS. Cutaneous leishmaniasis: An epidemiological study in Southwest of Iran. J Parasit Dis. 2019; 43(2):190-7. [DOI:10.1007/s12639-018-1073-0] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1007/s12639-018-1073-0]
6. Darzi F, Davoudian R, Nateghi Rostami M. Differential inflammatory responses associated with Leishmania major and L tropica in culture. Parasite Immunol. 2021; 43(8):e12841. [DOI:10.1111/pim.12841] [PMID] [DOI:10.1111/pim.12841]
7. Doroodgar A, Sayyah M, Doroodgar M, Mahbobi S, Nemetian M, Rafizadeh S, et al. Progressive increasing of cutaneous leishmaniasis in Kashan district, central of Iran. Asian Pac J Trop Dis 2012; 2:260-3. [DOI:10.1016/S2222-1808 (12)60057-7] [DOI:10.1016/S2222-1808(12)60057-7]
8. Echchakery M, Chicharro C, Boussaa S, Nieto Martinez FJ, Ortega S, Carrillo E, et al. Molecular identification of Leishmania tropica and L. infantum isolated from cutaneous human leishmaniasis samples in central Morocco. J Vector Borne Dis. 2020; 57(1):71-7. [Link] [DOI:10.4103/0972-9062.308804]
9. Usmael UA, Tesema NB, Girma S, Kendie DA, Abas MK. Detection of Leishmania donovani using ITS1-RFLP from positive and negative smear samples among clinically reported patients visiting University of Gondar Comprehensive Specialized Hospital. BMC Infect Dis. 2022; 22(1):963. [DOI:10.1186/s12879-022-07930-1] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1186/s12879-022-07930-1]
10. Rojas-Jaimes J, Rojas-Palomino N, Pence J, Lescano AG. Leishmania species in biopsies of patients with different clinical manifestations identified by high resolution melting and nested PCR in an Endemic district in Peru. Parasite Epidemiol Control. 2019; 4:e00095. [DOI:10.1016/j.parepi.2019.e00095] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1016/j.parepi.2019.e00095]
11. Sharifi I, Khosravi A, Aflatoonian MR, Salarkia E, Bamorovat M, Karamoozian A, et al. Cutaneous leishmaniasis situation analysis in the Islamic Republic of Iran in preparation for an elimination plan. Front Public Health. 2023; 11:1091709. [DOI:10.3389/fpubh.2023.1091709] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3389/fpubh.2023.1091709]
12. Tayyebi M, Darchini-Maragheh E, Layegh P, Kiafar B, Goyonlo VM. The effect of oral miltefosine in treatment of antimoniate resistant anthroponotic cutaneous leishmaniasis: An uncontrolled clinical trial. PLoS Negl Trop Dis. 2021; 15(3):e0009241. [DOI:10.1371/journal.pntd.0009241] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1371/journal.pntd.0009241]
13. Camara Coelho LI, Paes M, Guerra JA, Barbosa MD, Coelho C, Lima B, et al. Characterization of Leishmania spp. causing cutaneous leishmaniasis in Manaus, Amazonas, Brazil. Parasitol Res. 2011; 108(3):671-7. [DOI:10.1007/s00436-010-2139-9] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1007/s00436-010-2139-9]
14. Pourmohammadi B, Motazedian M, Hatam G, Kalantari M, Habibi P, Sarkari B. Comparison of three methods for diagnosis of cutaneous leishmaniasis. Iran J Parasitol. 2010; 5(4):1-8. [PMID] [PMCID]
15. Faber WR, Oskam L, van Gool T, Kroon NC, Knegt-Junk KJ, Hofwegen H, et al. Value of diagnostic techniques for cutaneous leishmaniasis. J Am Acad Dermatol. 2003; 49(1):70-4. [DOI:10.1067/mjd.2003.492] [PMID] [DOI:10.1067/mjd.2003.492]
16. Farrokhi-Karibozorg M, Ghayour-Najafabadi Z, Hejazi SH, Ataei-Pirkooh A, Mohebali M, Teimouri P, et al. Molecular identification of Leishmania RNA virus in cutaneous leishmaniasis patients and rodent reservoirs in Isfahan province, Iran. Infect Genet Evol. 2022; 98:105222. [DOI:10.1016/j.meegid.2022.105222] [PMID] [DOI:10.1016/j.meegid.2022.105222]
17. Doudi M, Hejazi SH, Razavi MR, Narimani M, Khanjani S, Eslami G. Comparative molecular epidemiology of Leishmania major and Leishmania tropica by PCR-RFLP technique in hyper endemic cities of Isfahan and Bam, Iran. Med Sci Monit. 2010; 16(11):CR530-5. [PMID]
18. Karami M, Doudi M, Setorki M. Assessing epidemiology of cutaneous leishmaniasis in Isfahan, Iran. J Vector Borne Dis. 2013; 50(1):30-7. [PMID] [DOI:10.4103/0972-9062.112532]
19. Khosrotaj MH, Rakhshani T, Nazari M, Gheibi Z, Soltani A. Epidemiological and clinical features of cutaneous leishmaniasis and its time trend model in a high-endemic focus of disease in the southwest of Iran from 2014 to 2019. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2022; 116(6):538-44. [DOI:10.1093/trstmh/trab166] [PMID] [DOI:10.1093/trstmh/trab166]
20. Sanei-Dehkordi A, Soleimani-Ahmadi M, Zare M, Mirzaei H. Epidemiological features of cutaneous leishmaniasis and distribution of sand flies in an endemic area in southeast of Iran. Parasite Epidemiol Control. 2021; 14:e00220. [DOI:10.1016/j.parepi.2021.e00220] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1016/j.parepi.2021.e00220]
21. Khosravi A, Sharifi I, Fekri A, Kermanizadeh A, Bamorovat M, Mostafavi M, et al. Clinical features of anthroponotic cutaneous leishmaniasis in a major focus, Southeastern Iran, 1994-2014. Iran J Parasitol. 2017; 12(4):544-53. [PMID] [PMCID]
22. Hatami I, Khanjani N, Aliakbarpoor M, Dehghan A. [Epidemiologic characteristics and time trend of cutaneous leishmaniasis incidence in cities under the surveillance of Shiraz University of Medical Sciences (Persian)]. J Sch Publ Health Inst Publ Health Res. 2018; 16(1):1-18. [Link]
23. Jorjani O, Mirkarimi K, Charkazi A, Shahamat YD, Mehrbakhsh Z, Bagheri A. The epidemiology of cutaneous leishmaniasis in Golestan Province, Iran: A cross-sectional study of 8-years. Parasite Epidemiol Control. 2019; 5:e00099. [DOI:10.1016/j.parepi.2019.e00099] [PMID] [PMCID] [DOI:10.1016/j.parepi.2019.e00099]
24. Akhlagh A, Salehzadeh A, Zahirnia AH, Davari B. 10-Year trends in epidemiology, diagnosis, and treatment of cutaneous leishmaniasis in Hamadan Province, West of Iran (2007-2016). Front Public Health. 2019; 7:27. [DOI:10.3389/fpubh.2019.00027] [PMID] [PMCID] [DOI:10.3389/fpubh.2019.00027]
25. Ahmadi Mirqhaed M, Dastoorpoor M, Behbahani A. Trend analysis of cutaneous leishmaniasis incidence in Izeh County during 2014-2019. Dis Diagn. 2021; 10(3):99-103. [DOI:10.34172/ddj.2021.19] [DOI:10.34172/ddj.2021.19]
26. Rezaee N, Raissi V, Rajaeipour A, Nazari M, Getso M, Taghipour A, et al. Epidemiology, associated factors and treatment methods of cutaneous leishmaniasis based on previous data from 2013 to 2018 in Ilam, Western Iran. Acta Parasitol. 2020; 65(3):760-7. [DOI:10.2478/s11686-020-00198-y] [PMID] [DOI:10.2478/s11686-020-00198-y]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
