جلد 18 -
جلد 18 - صفحات 0-0 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Honari H, Aghaie S M, Hajinormohamadi A, Samadpour Shahrak M H. Investigating the Immunogenicity of C-CFTXB Antigen Obtained From the Jellyfish (Chironex fleckeri) in Syrian Rats. Qom Univ Med Sci J 2024; 18 : 1360.3
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3844-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3844-fa.html
هنری حسین، آقایی سیدمجتبی، حاجی نورمحمدی اشکان، صمدپور شهرک محمدحسن. بررسی ایمنی‌زایی نانوآنتی‌ژن C-CfTXB عروس دریایی (چیرونکس فلکری) در موش سوری. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1403; 18 ()
1- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام‌حسین(ع)، تهران، ایران. ، honari.hosein@gmail.com
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام‌حسین(ع)، تهران، ایران.
3- دانشگاه جامع امام حسین(ع)
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام‌حسین(ع)، تهران، ایران.
3- دانشگاه جامع امام حسین(ع)
متن کامل [PDF 3939 kb]
(292 دریافت)
| چکیده (HTML) (584 مشاهده)
متن کامل: (162 مشاهده)
مقدمه
عروس‌های دریایی از شاخه کیسه‌تنان و رده کوبوزوا، بی‌مهرگانی با بیش از 9 هزار گونه مختلف و 100 گونه خطرساز برای انسان هستند. سمی‌ترین عروس دریایی شناسایی‌شده، عروس دریایی جعبه‌ای چیرونکس فلکری است. گزش این عروس دریایی به‌شدت دردناک و گاهی کشنده است، به حدی که قادر است در کمتر از 5 دقیقه یک فرد را از پا در بیاورد. زهر چیرونکس فلکری دارای انواع پروتئین‌های فعال زیستی شامل آنزیم‌ها، سموم ایجادکننده منفذ و نوروتوکسین‌هایی است که بر سلول‌های سیستم عصبی تأثیر می‌گذارند. این پروتئین‌ها سایتولایتیک، سمیت‌زا، التهابی یا کشنده هستند. گزیده شدن توسط برخی کیسه‌تنان ازجمله عروس دریایی به‌عنوان یک مشکل اورژانسی در مناطق ساحلی بسیاری از کشورها ازجمله سواحل ایران در خلیج فارس شناخته می‌شود [1]. هرساله 150 میلیون مورد گزش با عروس دریایی در سرتاسر جهان گزارش می‌شود [2]. گزش توسط عروس دریایی یک تهدید جدی برای گردشگران و ماهیگیران بوده که هم از نظر اقتصادی و هم از نظر سلامت دارای اهمیت است [3].
فراوان‌ترین پروتئین‌های موجود در نماتوسیت عروس‌های دریایی چیرونکس فلکری، پروتئین‌های CfTX-1 و CfTX-2 هستند. ژن cftx دارای 1493 جفت‌باز، 461 اسیدآمینه و دارای mRNA خطی است که پروتئینی به وزن مولکولی 51 کیلودالتون کد می‌کند [4].
پیچیدگی زهرهای CfTX عروس دریایی نشان‌دهنده یک چالش درمانی منحصربه‌فرد است که نیاز به ابداع روش‌های درمانی و پیشگیری را یادآوری می‌کند بنابراین به‌عنوان یک هدف درمانی، برای درمان گزیدگی یا نیش‌زدگی یا به‌عنوان ترکیباتی برای طراحی دارو دارای اهمیت هستند [5].
با توجه به پیشینه تحقیقات انجام‌شده بر روی پروتئین‌های CfTX-1 و CfTX-2 [6-9] و همولوژی بالا بین هر دو سم CfTX-1/2، در این مطالعه کلونینگ و بیان قسمت 570 جفت‌بازی یا 204 اسیدآمینه‌ای از پروتئین CfTXB برای بررسی انتخاب شد. استفاده از پلیمرها برای ساخت نانوذرات پلیمری، به‌دلیل قابل‌تغییر بودن ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی (سایز، بار سطحی و آب‌گریزی) و خصوصیات رهایش دارویی (کنترل‌شده یا رهایش به‌وسیله محرک‌های خارجی)، انعطاف‌پذیری قابل‌توجهی را در طراحی فراهم می‌سازد [10، 11]. نانوذرات پلیمری زیست‌تخریب‌پذیر، همانند نانوذرات پلی لاکتیک-کو-گلیکولیک اسید، به‌دلیل قابلیت‌هایی که در زمینه دارورسانی و نانوواکسن‌ها دارند، به‌شدت بر انواع دیگر حامل‌ها ترجیح داده می‌شوند. این نانوذرات ویژگی رهاسازی کنترل‌شده و ممتد دارند، اندازه‌ای در ابعاد سلولی داشته و با بافت و سلول‌ها، زیست‌سازگاری دارند.
هدف کلی این تحقیق، بررسی میزان ایمنی‌زایی و تولید آنتی‌بادی پروتئین نوترکیب CfTXB در حالت معمول و در حالت نانوکپسوله و مقایسه با یکدیگر بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه توالی آمینواسیدی پروتئین C-CfTXB با کد دسترسی با شماره GenBank: JN695597.1 استخراج شد. تعیین درصد گوانین-سیتوزین، ضریب سازگاری کدونی، توزیع فراوانی کدونی و میزان کدون‌های نادر به‌ترتیب توسط نرم‌افزارهای تحت شبکه Genescript rare codon analysis tool [12]، Rare Codon Calculator tool [13] و Expasy translate tool [14] انجام شد.
ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی، نقطه ایزوالکتریک نظری، وزن مولکولی، تعداد اسیدآمینه‌های با بار مثبت و منفی، نیمه‌عمر، ضریب ناپایداری، ضریب آلیفاتیک و میانگین آب‌دوستی پروتئین با استفاده از نرم‌افزار تحت شبکه Expasy’s ProtParam tool [15] محاسبه شد. نرم‌افزار تحت شبکه Vaxijen [16] به‌منظور تخمین احتمال آنتی‌ژن بودن هر یک از زیرواحدها و همچنین شکل پروتئین‌های موردنظر مورداستفاده قرار گرفت. سلول‌های مستعد سوش اشریشیاکلی BL21(DE3) به روش کلریدکلسیم تهیه شد و برای تراریخت کردن سلول‌های میزبان E. coli با پلاسمید نوترکیب حاوی ژن صناعی، از روش شوک سرمایی استفاده شد. به‌منظور تخلیص پلاسمید از کلون‌های کشت داده‌شده، از روش لیز قلیایی استفاده شد.
تأیید پلاسمیدهای استخراج‌شده توسط ژل آگارز [17]
به‌منظور تأیید پلاسمیدهای استخراج‌شده و بررسی نتیجه کار، پلاسمیدها با ژل آگارز مطالعه و بررسی شدند.
تکثیر ژن c-cftxb
به‌منظور تکثیر قطعه ژنی c-cftxb از پرایمرهای عمومی وکتور pET28a(+) استفاده شد. جهت تأیید DNA تکثیرشده، قطعه بر روی ژل آگارز با الکترفورز مطالعه و بررسی شد.
بیان پروتئین نوترکیب C-CfTxB در باکتری E. coli [18]
کلونی‌های به‌دست‌آمده در محیط لوریا-برتانی مایع حاوی غلظت نهایی 80 میکروگرم بر میلی‌لیتر کانامایسین کشت داده شدند و جهت القای بیان ژن از ایزوپروپیل بتا-دی-1-تیوگالاکتوپیرانوزید با غلظت نهایی 100 میلی‌مولار استفاده شد. جهت بررسی بیان از روش الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات ـ ژل پلی‌آکریل آمید با غلظت 12 درصد استفاده شد. جهت تأیید پروتئین نوترکیب C-CfTXB از روش وسترن‌بلات با آنتی‌بادی پلی‌کلونال سرم موش‌های ایمن‌شده استفاده شد. جهت تخلیص پروتئین نوترکیب به روش دناتوره، کروماتوگرافی میل ترکیبی (ستون Ni-NTA) به‌کار رفت. برای تعیین غلظت پروتئین موجود در محلول‌های به‌دست‌آمده از روش برادفورد استفاده شد.
بارگذاری آنتی‌ژن C-CfTXB در نانوذره PLGA
برای تولید نانوکپسول‌ها از روش امولسیون دوگانه تبخیر حلال استفاده شد. خصوصیات ظاهری نانوذرات و پتانسیل زتا و بازده وزنی نانوذرات تولیدشده بررسی شد. در این تحقیق برای تعیین مقدار پروتئین محبوس‌شده در نانوذرات از روش غیرمستقیم استفاده شد.
تزریق آنتی‌ژن C-CfTXB به موش سوری
از 5 سر موش سوری به‌عنوان تست پروتئین نوترکیب همراه ادجوانت، 5 سر موش سوری به‌عنوان تست پروتئین نوترکیب بارگذاری‌شده در نانوذره و دو گروه 5تایی به‌عنوان نمونه کنترل استفاده شد. به هر سر موش، 20 میکروگرم پروتئین تخلیص‌شده به‌صورت زیرجلدی با ادجوانت 2 بار و با نانوذره 4 بار با فاصله زمانی 14 روز تزریق شد. خون‌گیری از موش‌ها یک هفته پس از آخرین تزریق در 3 نوبت انجام شد. تیتر آنتی‌بادی به روش الایزای غیرمستقیم محاسبه شد. چالش موش‌ها توسط زهر عروس دریایی (50×LD50) تیمارشده با C-CfTxB به‌صورت تزریق زیرجلدی انجام شد.
از نرم‌افزار SPSS نسخه 19جهت آنالیز آماری فاکتوریل در قالب طرح کاملاًً تصادفی و مقایسه میانگین‌ها از طریق آزمون دانکن استفاده شد.
یافته‌ها
وزن مولکولی پروتئین حاصل از توالی ژن صناعی تا اولین ATG از توالی pET، 119/22 کیلودالتون تخمین زده شد. طبق نتایج حاصل از نرم‌افزارهای Predict Protein و GOR IV، محتوای ساختار دوم این کایمر عبارت از مارپیچ آلفا به میزان 95/18 درصد، رشته‌های گسترده به میزان 79/35 درصد و پیچش‌های تصادفی به میزان 26/45 درصد بود. براساس بررسی ماهیت آنتی‌ژنی کایمر با نرم‌افزارVaxigen نسخه 2 احتمال آنتی‌ژن بودن 4874/0 به دست آمد.
تکثیر قطعه ژنی c-cftxb
برای ساخت کاست ژنی cftx1-stxB، قطعه ژنی cftx1 با آغازگرهای مربوطه تکثیر شد (تصویر شماره 1).
انتقال سازه pET28a(+)-c-cftxb به E. coli Bl21 DE3
پس از انجام ترانسفورماسیون شیمیایی، آن دسته از سلول‌هایی که پلاسمید را دریافت کردند روی محیط آنتی‌بیوتیک‌دار (کانامایسین) رشد کردند (تصویر شماره 2).
بیان پروتئین نوترکیب C-CfTxB
پس از کشت سلول‌ها و القا با IPTG، بیان پروتئین C-CfTxB صورت پذیرفت و سپس نمونه‌ها بر روی ژل SDS-PAGE 12 درصد موردارزیابی قرار گرفتند. غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد برابر با 403 میکروگرم بر لیتر بود (تصویر شماره 3).
بررسی نتایج بارگذاری آنتی‌ژن C-CfTXB در نانوذره PLGA
پتانسیل زتای نانوذرات PLGA فاقد پروتئین دارای یک پیک میانگین در محدوده 2/21- تا 5/22- میلی‌ولت بود (تصویر شماره 4).
تصاویر میکروسکوپ الکترونی، کروی بودن سطح ذرات حاصل از فرایند تولید نانوذرات در شرایط بهینه را مطلوب نشان داد (تصویر شماره 5).
پس از ساخت نانوذرات و انجام سانتریفیوژ، نانوذرات به‌صورت انجمادی خشک شدند و سپس بازده وزنی تولید نانوذرات طبق فرمول محاسبه شد (جدول شماره 1).
رهایش پروتئین از نانوذرات پی‌ال‌جی‌ای به‌مدت 40 روز بررسی و براساس درصد تجمعی رهایش پروتئین در نمودار نمایش داده شد (تصویر شماره 6).
پس از انجام رهایش کامل نانوذرات PLGA و مقایسه آن با پروتئین نوترکیب به‌عنوان کنترل، مشخص شد پروتئین در طول مراحل ساخت نانوذرات پایدار بوده و دناتوره نشده است (تصویر شماره 7).
تأیید پروتئین نوترکیب C-cftxB به روش وسترن‌بلات
پس از انجام این آزمون، رنگ‌پذیری کاغذ نیتروسلولز در مقابل باند 26 کیلودالتونی نشانگر مولکولی پروتئین انجام شد (تصویر شماره 8).
تزریق آنتی‌ژن C-CfTxB به موش سوری
با آماده شدن آنتی‌ژن نوترکیب C-CfTxB به‌شکل خالص‌شده و پس از تعیین غلظت آن، فرایند تزریق آنتی‌ژن همراه ادجوانت در 4 نوبت و اینکپسوله به‌شکل زیرجلدی 2 نوبت به فاصله هر 2 هفته یک‌بار به موش‌های گروه آزمون انجام شد.
ارزیابی تیتر آنتی‌بادی ضدپروتئین نوترکیب به روش الایزای غیرمستقیم
پس از گذشت یک هفته از تزریقات یادآور اول و دوم، خون‌گیری از موش‌های آزمون و کنترل انجام شد. به‌منظور ارزیابی آنتی‌بادی تولیدشده و محاسبه میزان آن در هر مرحله تزریق از روش الایزای غیرمستقیم استفاده شد (تصاویر شماره 9، 10 و 11).
بررسی آماری داده‌های حاصل از الایزای غیرمستقیم
آنالیز واریانس یک‌طرفه آزمون دانکن در بررسی تیتر IgG مدفوعی اختلاف بین گروه‌ها را نشان داد. البته این اختلاف بین گروه 1 و گروه 4 معنی‌دار نبود. گروه‌های موجود در ستون‌ها در سطح خطای 5 درصد دارای اختلاف معنی‌دار بودند (05/0>P) (جدول شماره 2).
چالش موش‌های ایمن با استفاده از زهرخام عروس دریایی گونه‌های جنوب
پس از استحصال زهرخام عروس دریایی گونه‌های جنوب و پس از محاسبه میزان نیمه دُز کشنده، عصاره سم تا غلظت50 برابر آن به موش‌های ایمن‌شده با ادجوانت و نانوذره PLGA تزریق شد که قادر به تحمل بودند.
بحث
از میان 200 گونه عروس دریایی، بیش از 100 گونه برای انسان خطرناک تشخیص داده شده که از این میان خطرناک‌ترین گونه، عروس دریایی جعبه‌ای است که بیشترین آسیب را به انسان می‌رساند. زهر عروس دریایی جعبه‌ای شامل سم دستگاه قلبی (کاردیوتوکسین) و سم دستگاه عصبی (نوروتوکسین) است که سریعاً جذب شده و وارد سیستم گردش خون بدن شده و در کمتر از 5 دقیقه سبب مرگ می‌شود. مطالعه اخیری که درمورد سموم CfTX انجام شد، نشان داد CfTX-1/2 در عرض یک دقیقه در موش‌های صحرایی بیهوش که در معرض این سموم قرار گرفتند باعث فروپاشی قلبی عروقی شد [19]. خطرناک‌ترین نوع عروس دریایی همان چیرونکس فلکری است که مرگ‌ومیر با این نوع عروس دریایی درنتیجه نارسایی تنفسی و ایست قلبی گزارش شده است [20، 21]. ژن cftx دارای 1493 جفت‌باز، 461 اسیدآمینه و mRNA خطی است که پروتئینی به وزن مولکولی 51 کیلودالتون را کد می‌کند [22، 23]. پروتئین‌های پایه دارای وزن مولکولی 43 الی 45 کیلودالتون بوده و شامل هر دو ناحیه آلفا و بتا هستند. فراوان‌ترین پروتئین‌های موجود در نماتوسیت عروس‌های دریایی چیرونکس فلکری دو پروتئین CfTX-1 و CfTX-2 هستند [4، 24].
در مطالعات قبلی که برینکمن و همکاران برای بررسی سمیت و ویژگی‌های بیوشیمیایی زهر عروس دریایی چیرونکس فلکری انجام دادند، نگرانی عمده در جمع‌آوری نمونه‌های پروتئینی وجود داشت [19، 21، 22]. تا کنون هیچ مطالعه‌ای جهت بیان پروتئین‌های زهر عروس‌های دریایی انجام نشده است. نتایج به‌دست‌آمده از این مطالعات نشان داد اغلب پروتئین‌های نماتوسیت مانند CfTX-1 را می‌توان در یک میزبان باکتریایی بیان کرد [7-9]. بخش بزرگی از پروتئین CfTX بیان‌شده، به‌صورت اجسام نامحلول اینکلوژن هستند که حالت فعال اغلب پروتئین‌های نوترکیب است.
ما در این تحقیق پروتئین مذکور را در E. coli تولید کردیم. بدین‌منظور با بررسی توالی اسیدهای آمینه CfTX1 و CfTX2 مشخص شد در نواحی از سکانس‌ها، بیش از 95 درصد همولوژی وجود دارد. بنابراین با انتخاب این ناحیه از C ترمینال CfTX1، بهینه‌سازی و همسانه‌سازی و بیان آنتی‌ژن در E. coli، میزان تولید آنتی‌بادی در موش موردبررسی قرار گرفت. ما در این تحقیق نشان دادیم در موش‌هایی که 4 مرتبه تزریق در فواصل مشخص انجام شده تا 50 برابر LD50 زهر می‌توانند ایمن شوند [7-9]. در این تحقیق استفاده از پروتئین نوترکیب به‌منظور ایمنی‌زایی موش‌ها در برابر زهر عروس دریایی بسیار مؤثر بود. چالش موش‌های نژاد سوری توسط آنتی‌ژن C-CfTxB همراه ادجوانت و به‌شکل بارگذاری‌شده در نانوذره PGLA حاکی از نتایجی جالب، قابل‌تأمل و موفقیت‌آمیزی بود. چنانکه موش‌ها تا 50 برابر متوسط دُز کشنده را تحمل کردند.
نتیجه‌گیری
با توجه عدم خاصیت کاردیوتوکسیستی و نوروتوکسیستی پروتئین نوترکیب C-CfTXB در موش‌های سوری، این پروتئین تولیدشده می‌تواند به‌عنوان کاندید واکسن علیه زهر عروس دریایی استفاده شود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
با توجه به موضوع مقاله، مجوز کد اخلاق این تحقیق طی نامه شماره 2779 به تاریخ 15/4/1401 صادر شده است.
حامی مالی
مقاله حاضر بخشی از نتایج حاصل از پایان‌نامه کارشناسی‌ارشد گرایش سلولی مولکولی حسین هنری در مرکز علم و فناوری زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام‌حسین(ع) تهران است.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در آماده‌سازی این مقاله مشارکت داشتند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان هیچ تعارض منافعی وجود ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از معاونت پژوهش دانشگاه جامع امام‌حسین(ع) تهران تشکر می‌کنند.
عروس‌های دریایی از شاخه کیسه‌تنان و رده کوبوزوا، بی‌مهرگانی با بیش از 9 هزار گونه مختلف و 100 گونه خطرساز برای انسان هستند. سمی‌ترین عروس دریایی شناسایی‌شده، عروس دریایی جعبه‌ای چیرونکس فلکری است. گزش این عروس دریایی به‌شدت دردناک و گاهی کشنده است، به حدی که قادر است در کمتر از 5 دقیقه یک فرد را از پا در بیاورد. زهر چیرونکس فلکری دارای انواع پروتئین‌های فعال زیستی شامل آنزیم‌ها، سموم ایجادکننده منفذ و نوروتوکسین‌هایی است که بر سلول‌های سیستم عصبی تأثیر می‌گذارند. این پروتئین‌ها سایتولایتیک، سمیت‌زا، التهابی یا کشنده هستند. گزیده شدن توسط برخی کیسه‌تنان ازجمله عروس دریایی به‌عنوان یک مشکل اورژانسی در مناطق ساحلی بسیاری از کشورها ازجمله سواحل ایران در خلیج فارس شناخته می‌شود [1]. هرساله 150 میلیون مورد گزش با عروس دریایی در سرتاسر جهان گزارش می‌شود [2]. گزش توسط عروس دریایی یک تهدید جدی برای گردشگران و ماهیگیران بوده که هم از نظر اقتصادی و هم از نظر سلامت دارای اهمیت است [3].
فراوان‌ترین پروتئین‌های موجود در نماتوسیت عروس‌های دریایی چیرونکس فلکری، پروتئین‌های CfTX-1 و CfTX-2 هستند. ژن cftx دارای 1493 جفت‌باز، 461 اسیدآمینه و دارای mRNA خطی است که پروتئینی به وزن مولکولی 51 کیلودالتون کد می‌کند [4].
پیچیدگی زهرهای CfTX عروس دریایی نشان‌دهنده یک چالش درمانی منحصربه‌فرد است که نیاز به ابداع روش‌های درمانی و پیشگیری را یادآوری می‌کند بنابراین به‌عنوان یک هدف درمانی، برای درمان گزیدگی یا نیش‌زدگی یا به‌عنوان ترکیباتی برای طراحی دارو دارای اهمیت هستند [5].
با توجه به پیشینه تحقیقات انجام‌شده بر روی پروتئین‌های CfTX-1 و CfTX-2 [6-9] و همولوژی بالا بین هر دو سم CfTX-1/2، در این مطالعه کلونینگ و بیان قسمت 570 جفت‌بازی یا 204 اسیدآمینه‌ای از پروتئین CfTXB برای بررسی انتخاب شد. استفاده از پلیمرها برای ساخت نانوذرات پلیمری، به‌دلیل قابل‌تغییر بودن ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی (سایز، بار سطحی و آب‌گریزی) و خصوصیات رهایش دارویی (کنترل‌شده یا رهایش به‌وسیله محرک‌های خارجی)، انعطاف‌پذیری قابل‌توجهی را در طراحی فراهم می‌سازد [10، 11]. نانوذرات پلیمری زیست‌تخریب‌پذیر، همانند نانوذرات پلی لاکتیک-کو-گلیکولیک اسید، به‌دلیل قابلیت‌هایی که در زمینه دارورسانی و نانوواکسن‌ها دارند، به‌شدت بر انواع دیگر حامل‌ها ترجیح داده می‌شوند. این نانوذرات ویژگی رهاسازی کنترل‌شده و ممتد دارند، اندازه‌ای در ابعاد سلولی داشته و با بافت و سلول‌ها، زیست‌سازگاری دارند.
هدف کلی این تحقیق، بررسی میزان ایمنی‌زایی و تولید آنتی‌بادی پروتئین نوترکیب CfTXB در حالت معمول و در حالت نانوکپسوله و مقایسه با یکدیگر بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه توالی آمینواسیدی پروتئین C-CfTXB با کد دسترسی با شماره GenBank: JN695597.1 استخراج شد. تعیین درصد گوانین-سیتوزین، ضریب سازگاری کدونی، توزیع فراوانی کدونی و میزان کدون‌های نادر به‌ترتیب توسط نرم‌افزارهای تحت شبکه Genescript rare codon analysis tool [12]، Rare Codon Calculator tool [13] و Expasy translate tool [14] انجام شد.
ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی، نقطه ایزوالکتریک نظری، وزن مولکولی، تعداد اسیدآمینه‌های با بار مثبت و منفی، نیمه‌عمر، ضریب ناپایداری، ضریب آلیفاتیک و میانگین آب‌دوستی پروتئین با استفاده از نرم‌افزار تحت شبکه Expasy’s ProtParam tool [15] محاسبه شد. نرم‌افزار تحت شبکه Vaxijen [16] به‌منظور تخمین احتمال آنتی‌ژن بودن هر یک از زیرواحدها و همچنین شکل پروتئین‌های موردنظر مورداستفاده قرار گرفت. سلول‌های مستعد سوش اشریشیاکلی BL21(DE3) به روش کلریدکلسیم تهیه شد و برای تراریخت کردن سلول‌های میزبان E. coli با پلاسمید نوترکیب حاوی ژن صناعی، از روش شوک سرمایی استفاده شد. به‌منظور تخلیص پلاسمید از کلون‌های کشت داده‌شده، از روش لیز قلیایی استفاده شد.
تأیید پلاسمیدهای استخراج‌شده توسط ژل آگارز [17]
به‌منظور تأیید پلاسمیدهای استخراج‌شده و بررسی نتیجه کار، پلاسمیدها با ژل آگارز مطالعه و بررسی شدند.
تکثیر ژن c-cftxb
به‌منظور تکثیر قطعه ژنی c-cftxb از پرایمرهای عمومی وکتور pET28a(+) استفاده شد. جهت تأیید DNA تکثیرشده، قطعه بر روی ژل آگارز با الکترفورز مطالعه و بررسی شد.
بیان پروتئین نوترکیب C-CfTxB در باکتری E. coli [18]
کلونی‌های به‌دست‌آمده در محیط لوریا-برتانی مایع حاوی غلظت نهایی 80 میکروگرم بر میلی‌لیتر کانامایسین کشت داده شدند و جهت القای بیان ژن از ایزوپروپیل بتا-دی-1-تیوگالاکتوپیرانوزید با غلظت نهایی 100 میلی‌مولار استفاده شد. جهت بررسی بیان از روش الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات ـ ژل پلی‌آکریل آمید با غلظت 12 درصد استفاده شد. جهت تأیید پروتئین نوترکیب C-CfTXB از روش وسترن‌بلات با آنتی‌بادی پلی‌کلونال سرم موش‌های ایمن‌شده استفاده شد. جهت تخلیص پروتئین نوترکیب به روش دناتوره، کروماتوگرافی میل ترکیبی (ستون Ni-NTA) به‌کار رفت. برای تعیین غلظت پروتئین موجود در محلول‌های به‌دست‌آمده از روش برادفورد استفاده شد.
بارگذاری آنتی‌ژن C-CfTXB در نانوذره PLGA
برای تولید نانوکپسول‌ها از روش امولسیون دوگانه تبخیر حلال استفاده شد. خصوصیات ظاهری نانوذرات و پتانسیل زتا و بازده وزنی نانوذرات تولیدشده بررسی شد. در این تحقیق برای تعیین مقدار پروتئین محبوس‌شده در نانوذرات از روش غیرمستقیم استفاده شد.
تزریق آنتی‌ژن C-CfTXB به موش سوری
از 5 سر موش سوری به‌عنوان تست پروتئین نوترکیب همراه ادجوانت، 5 سر موش سوری به‌عنوان تست پروتئین نوترکیب بارگذاری‌شده در نانوذره و دو گروه 5تایی به‌عنوان نمونه کنترل استفاده شد. به هر سر موش، 20 میکروگرم پروتئین تخلیص‌شده به‌صورت زیرجلدی با ادجوانت 2 بار و با نانوذره 4 بار با فاصله زمانی 14 روز تزریق شد. خون‌گیری از موش‌ها یک هفته پس از آخرین تزریق در 3 نوبت انجام شد. تیتر آنتی‌بادی به روش الایزای غیرمستقیم محاسبه شد. چالش موش‌ها توسط زهر عروس دریایی (50×LD50) تیمارشده با C-CfTxB به‌صورت تزریق زیرجلدی انجام شد.
از نرم‌افزار SPSS نسخه 19جهت آنالیز آماری فاکتوریل در قالب طرح کاملاًً تصادفی و مقایسه میانگین‌ها از طریق آزمون دانکن استفاده شد.
یافته‌ها
وزن مولکولی پروتئین حاصل از توالی ژن صناعی تا اولین ATG از توالی pET، 119/22 کیلودالتون تخمین زده شد. طبق نتایج حاصل از نرم‌افزارهای Predict Protein و GOR IV، محتوای ساختار دوم این کایمر عبارت از مارپیچ آلفا به میزان 95/18 درصد، رشته‌های گسترده به میزان 79/35 درصد و پیچش‌های تصادفی به میزان 26/45 درصد بود. براساس بررسی ماهیت آنتی‌ژنی کایمر با نرم‌افزارVaxigen نسخه 2 احتمال آنتی‌ژن بودن 4874/0 به دست آمد.
تکثیر قطعه ژنی c-cftxb
برای ساخت کاست ژنی cftx1-stxB، قطعه ژنی cftx1 با آغازگرهای مربوطه تکثیر شد (تصویر شماره 1).
انتقال سازه pET28a(+)-c-cftxb به E. coli Bl21 DE3
پس از انجام ترانسفورماسیون شیمیایی، آن دسته از سلول‌هایی که پلاسمید را دریافت کردند روی محیط آنتی‌بیوتیک‌دار (کانامایسین) رشد کردند (تصویر شماره 2).
بیان پروتئین نوترکیب C-CfTxB
پس از کشت سلول‌ها و القا با IPTG، بیان پروتئین C-CfTxB صورت پذیرفت و سپس نمونه‌ها بر روی ژل SDS-PAGE 12 درصد موردارزیابی قرار گرفتند. غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد برابر با 403 میکروگرم بر لیتر بود (تصویر شماره 3).
بررسی نتایج بارگذاری آنتی‌ژن C-CfTXB در نانوذره PLGA
پتانسیل زتای نانوذرات PLGA فاقد پروتئین دارای یک پیک میانگین در محدوده 2/21- تا 5/22- میلی‌ولت بود (تصویر شماره 4).
تصاویر میکروسکوپ الکترونی، کروی بودن سطح ذرات حاصل از فرایند تولید نانوذرات در شرایط بهینه را مطلوب نشان داد (تصویر شماره 5).
پس از ساخت نانوذرات و انجام سانتریفیوژ، نانوذرات به‌صورت انجمادی خشک شدند و سپس بازده وزنی تولید نانوذرات طبق فرمول محاسبه شد (جدول شماره 1).
رهایش پروتئین از نانوذرات پی‌ال‌جی‌ای به‌مدت 40 روز بررسی و براساس درصد تجمعی رهایش پروتئین در نمودار نمایش داده شد (تصویر شماره 6).
پس از انجام رهایش کامل نانوذرات PLGA و مقایسه آن با پروتئین نوترکیب به‌عنوان کنترل، مشخص شد پروتئین در طول مراحل ساخت نانوذرات پایدار بوده و دناتوره نشده است (تصویر شماره 7).
تأیید پروتئین نوترکیب C-cftxB به روش وسترن‌بلات
پس از انجام این آزمون، رنگ‌پذیری کاغذ نیتروسلولز در مقابل باند 26 کیلودالتونی نشانگر مولکولی پروتئین انجام شد (تصویر شماره 8).
تزریق آنتی‌ژن C-CfTxB به موش سوری
با آماده شدن آنتی‌ژن نوترکیب C-CfTxB به‌شکل خالص‌شده و پس از تعیین غلظت آن، فرایند تزریق آنتی‌ژن همراه ادجوانت در 4 نوبت و اینکپسوله به‌شکل زیرجلدی 2 نوبت به فاصله هر 2 هفته یک‌بار به موش‌های گروه آزمون انجام شد.
ارزیابی تیتر آنتی‌بادی ضدپروتئین نوترکیب به روش الایزای غیرمستقیم
پس از گذشت یک هفته از تزریقات یادآور اول و دوم، خون‌گیری از موش‌های آزمون و کنترل انجام شد. به‌منظور ارزیابی آنتی‌بادی تولیدشده و محاسبه میزان آن در هر مرحله تزریق از روش الایزای غیرمستقیم استفاده شد (تصاویر شماره 9، 10 و 11).
بررسی آماری داده‌های حاصل از الایزای غیرمستقیم
آنالیز واریانس یک‌طرفه آزمون دانکن در بررسی تیتر IgG مدفوعی اختلاف بین گروه‌ها را نشان داد. البته این اختلاف بین گروه 1 و گروه 4 معنی‌دار نبود. گروه‌های موجود در ستون‌ها در سطح خطای 5 درصد دارای اختلاف معنی‌دار بودند (05/0>P) (جدول شماره 2).
چالش موش‌های ایمن با استفاده از زهرخام عروس دریایی گونه‌های جنوب
پس از استحصال زهرخام عروس دریایی گونه‌های جنوب و پس از محاسبه میزان نیمه دُز کشنده، عصاره سم تا غلظت50 برابر آن به موش‌های ایمن‌شده با ادجوانت و نانوذره PLGA تزریق شد که قادر به تحمل بودند.
بحث
از میان 200 گونه عروس دریایی، بیش از 100 گونه برای انسان خطرناک تشخیص داده شده که از این میان خطرناک‌ترین گونه، عروس دریایی جعبه‌ای است که بیشترین آسیب را به انسان می‌رساند. زهر عروس دریایی جعبه‌ای شامل سم دستگاه قلبی (کاردیوتوکسین) و سم دستگاه عصبی (نوروتوکسین) است که سریعاً جذب شده و وارد سیستم گردش خون بدن شده و در کمتر از 5 دقیقه سبب مرگ می‌شود. مطالعه اخیری که درمورد سموم CfTX انجام شد، نشان داد CfTX-1/2 در عرض یک دقیقه در موش‌های صحرایی بیهوش که در معرض این سموم قرار گرفتند باعث فروپاشی قلبی عروقی شد [19]. خطرناک‌ترین نوع عروس دریایی همان چیرونکس فلکری است که مرگ‌ومیر با این نوع عروس دریایی درنتیجه نارسایی تنفسی و ایست قلبی گزارش شده است [20، 21]. ژن cftx دارای 1493 جفت‌باز، 461 اسیدآمینه و mRNA خطی است که پروتئینی به وزن مولکولی 51 کیلودالتون را کد می‌کند [22، 23]. پروتئین‌های پایه دارای وزن مولکولی 43 الی 45 کیلودالتون بوده و شامل هر دو ناحیه آلفا و بتا هستند. فراوان‌ترین پروتئین‌های موجود در نماتوسیت عروس‌های دریایی چیرونکس فلکری دو پروتئین CfTX-1 و CfTX-2 هستند [4، 24].
در مطالعات قبلی که برینکمن و همکاران برای بررسی سمیت و ویژگی‌های بیوشیمیایی زهر عروس دریایی چیرونکس فلکری انجام دادند، نگرانی عمده در جمع‌آوری نمونه‌های پروتئینی وجود داشت [19، 21، 22]. تا کنون هیچ مطالعه‌ای جهت بیان پروتئین‌های زهر عروس‌های دریایی انجام نشده است. نتایج به‌دست‌آمده از این مطالعات نشان داد اغلب پروتئین‌های نماتوسیت مانند CfTX-1 را می‌توان در یک میزبان باکتریایی بیان کرد [7-9]. بخش بزرگی از پروتئین CfTX بیان‌شده، به‌صورت اجسام نامحلول اینکلوژن هستند که حالت فعال اغلب پروتئین‌های نوترکیب است.
ما در این تحقیق پروتئین مذکور را در E. coli تولید کردیم. بدین‌منظور با بررسی توالی اسیدهای آمینه CfTX1 و CfTX2 مشخص شد در نواحی از سکانس‌ها، بیش از 95 درصد همولوژی وجود دارد. بنابراین با انتخاب این ناحیه از C ترمینال CfTX1، بهینه‌سازی و همسانه‌سازی و بیان آنتی‌ژن در E. coli، میزان تولید آنتی‌بادی در موش موردبررسی قرار گرفت. ما در این تحقیق نشان دادیم در موش‌هایی که 4 مرتبه تزریق در فواصل مشخص انجام شده تا 50 برابر LD50 زهر می‌توانند ایمن شوند [7-9]. در این تحقیق استفاده از پروتئین نوترکیب به‌منظور ایمنی‌زایی موش‌ها در برابر زهر عروس دریایی بسیار مؤثر بود. چالش موش‌های نژاد سوری توسط آنتی‌ژن C-CfTxB همراه ادجوانت و به‌شکل بارگذاری‌شده در نانوذره PGLA حاکی از نتایجی جالب، قابل‌تأمل و موفقیت‌آمیزی بود. چنانکه موش‌ها تا 50 برابر متوسط دُز کشنده را تحمل کردند.
نتیجه‌گیری
با توجه عدم خاصیت کاردیوتوکسیستی و نوروتوکسیستی پروتئین نوترکیب C-CfTXB در موش‌های سوری، این پروتئین تولیدشده می‌تواند به‌عنوان کاندید واکسن علیه زهر عروس دریایی استفاده شود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
با توجه به موضوع مقاله، مجوز کد اخلاق این تحقیق طی نامه شماره 2779 به تاریخ 15/4/1401 صادر شده است.
حامی مالی
مقاله حاضر بخشی از نتایج حاصل از پایان‌نامه کارشناسی‌ارشد گرایش سلولی مولکولی حسین هنری در مرکز علم و فناوری زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام‌حسین(ع) تهران است.
مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در آماده‌سازی این مقاله مشارکت داشتند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان هیچ تعارض منافعی وجود ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از معاونت پژوهش دانشگاه جامع امام‌حسین(ع) تهران تشکر می‌کنند.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
ایمونولوژی
دریافت: 1402/8/6 | پذیرش: 1402/9/14 | انتشار: 1403/2/10
دریافت: 1402/8/6 | پذیرش: 1402/9/14 | انتشار: 1403/2/10
فهرست منابع
1. Parviz M, Nikpour Y, Taghavi Moghadam A, Ghanemi K. [Fractionation comparison of Persian Gulf jellyfish nematocyst venom by two methods of chromatography (Persian)]. J Mar Sci Technol. 2017; 15(4):26-32. [DOI:10.22113/jmst.2017.14761]
2. Currie BJ. Marine antivenoms. J Toxicol Clin Toxicol. 2003;41(3):301-8. [DOI:10.1081/CLT-120021115] [PMID] [DOI:10.1081/CLT-120021115]
3. Alam MJ, Ashraf KU. Prediction of an epitope-based computational vaccine strategy for gaining concurrent immunization against the venom proteins of Australian box jellyfish. Toxicol Int. 2013; 20(3):235-53. [PMID] [DOI:10.4103/0971-6580.121677]
4. Mariottini GL, Pane L. Cytotoxic and cytolytic cnidarian venoms. A review on health implications and possible therapeutic applications. Toxins (Basel). 2013; 6(1):108-51. [DOI:10.3390/toxins6010108] [PMID] [DOI:10.3390/toxins6010108]
5. Mariottini GL. Hemolytic venoms from marine cnidarian jellyfish - an overview. J Venom Res. 2014; 5:22-32. [PMID]
6. Ponce D, Brinkman DL, Luna-Ramírez K, Wright CE, Dorantes-Aranda JJ. Comparative study of the toxic effects of Chrysaora quinquecirrha (cnidaria: Scyphozoa) and chironex fleckeri (cnidaria: cubozoa) venoms using cell-based assays. Toxicon. 2015; 106:57-67. [DOI:10.1016/j.toxicon.2015.09.014] [PMID] [DOI:10.1016/j.toxicon.2015.09.014]
7. Honari H, Aghaie SM, Hosseinzade M. Subcloning and expression of the chimeric antigen C-CFTX1-STxB of the jellyfish venom and its antigenicity assessment in Syrian mice (Persian)]. J Ilam Univ Med Sci. 2019; 27(5):24-36. [DOI:10.29252/sjimu.27.5.24] [DOI:10.29252/sjimu.27.5.24]
8. Jafari H, Tamadoni Jahromi S, Zargan J, Zamani E, Ranjbar R, Honari H. Cloning and Expression of N-CFTX-1 antigen from chironex fleckeri in escherichia coli and determination of immunogenicity in mice. Iran J Public Health. 2021; 50(2):376-83. [DOI:10.18502/ijph.v50i2.5355] [PMID] [DOI:10.18502/ijph.v50i2.5355]
9. Honari H, Aghaie SM, Jalilpour H. [Immunogenicity of N-CfTX-2 antigen of chironex fleckeri jellyfish in mice (Persian)]. Qom Univ Med Sci J. 2018; 12(9):47-57. [DOI:10.29252/qums.12.9.47] [DOI:10.29252/qums.12.9.47]
10. King GK. Acute analgesia and cosmetic benefits of box-jellyfish antivenom. Med J Aust. 1991; 154(5):365-6. [DOI:10.5694/j.1326-5377.1991.tb112903.x] [PMID] [DOI:10.5694/j.1326-5377.1991.tb112903.x]
11. Honari H, Aghaie SM, Hoseinzadeh M. [C-CfTXA-STxB chimeric antigen loading in PLA-PEG-PLA tri-block copolymers and its immunization in mice (Persian)]. Koomesh. 2022; 24(4):538-43. [Link]
12. Yan Y, Liu X, Li Q, Chu X, Tian J, Wu N. Effect of rare codons in C-terminal of green fluorescent protein on protein production in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2018; 149:23-30. [PMID] [DOI:10.1016/j.pep.2018.04.011]
13. Alexaki A, Kames J, Holcomb DD, Athey J, Santana-Quintero LV, Lam PVN, et al. Codon and codon-pair usage tables (CoCoPUTs): Facilitating genetic variation analyses and recombinant gene design. J Mol Biol. 2019; 431(13):2434-41. [PMID] [DOI:10.1016/j.jmb.2019.04.021]
14. Gasteiger E, Gattiker A, Hoogland C, Ivanyi I, Appel RD, Bairoch A. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 2003; 31(13):3784-8. [PMID] [DOI:10.1093/nar/gkg563]
15. Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Duvaud SE, Wilkins MR, Appel RD, et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. In: Walker JM, editors. The proteomics protocols handbook. Springer Protocols Handbooks. New Jersey: Humana Press; 2005. [Link] [DOI:10.1385/1-59259-890-0:571]
16. Doytchinova IA, Flower DR. VaxiJen: A server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC Bioinformatics. 2007; 8:1-7. [Link] [DOI:10.1186/1471-2105-8-4]
17. Sambrook J, Russell DW. Directional cloning into plasmid vectors. CSH Protoc. 2006; 2006(1):pdb.prot3919. [DOI:10.1101/pdb.prot3919] [PMID] [DOI:10.1101/pdb.prot3919]
18. Tonello F, Pellizzari R, Pasqualato S, Grandi G, Peggion E, Montecucco C. Recombinant and truncated tetanus neurotoxin light chain: Cloning, expression, purification, and proteolytic activity. Protein Expr Purif. 1999; 15(2):221-7. [DOI:10.1006/prep.1998.1007] [PMID] [DOI:10.1006/prep.1998.1007]
19. Brinkman DL, Konstantakopoulos N, McInerney BV, Mulvenna J, Seymour JE, Isbister GK, et al. Chironex fleckeri (box jellyfish) venom proteins: Expansion of a cnidarian toxin family that elicits variable cytolytic and cardiovascular effects. J Biol Chem. 2014; 289(8):4798-812. [DOI:10.1074/jbc.M113.534149] [PMID] [DOI:10.1074/jbc.M113.534149]
20. Rual F. [Marine life envenomations: Example in New Caledonia (French)]. Med Trop (Mars). 1999; 59(3):287-97. [PMID]
21. Brinkman DL, Burnell JN. Biochemical and molecular characterisation of cubozoan protein toxins. Toxicon. 2009; 54(8):1162-73. [DOI:10.1016/j.toxicon.2009.02.006] [PMID] [DOI:10.1016/j.toxicon.2009.02.006]
22. Brinkman D, Burnell J. Identification, cloning and sequencing of two major venom proteins from the box jellyfish, Chironex fleckeri. Toxicon. 2007; 50(6):850-60. [DOI:10.1016/j.toxicon.2007.06.016] [PMID] [DOI:10.1016/j.toxicon.2007.06.016]
23. Jafari H, Honari H, Zargan J, Tamadoni Jahromi S. Extraction the venom of Rhopilema nomadica from the Persian Gulf coast and the investigation of its hemolytical activity. Yafte 2019; 21(3):86-95. [Link]
24. Jafari H, Honari H, Zargan J, Jahromi St. Identification and hemolytic activity of jellyfish (Rhopilema sp., Scyphozoa: Rhizostomeae) venom from the Persian Gulf and Oman Sea. Biodiversitas J Biol Divers. 2019 Apr 2;20(4):1228-32. [DOI:10.13057/biodiv/d200440] [DOI:10.13057/biodiv/d200440]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
