دوره 14، شماره 2 - ( اردیبهشت 1399 )
جلد 14 شماره 2 صفحات 12-1 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Dehbashi M, Hojati Z, Motovali-bashi M, Ganjalikhani-Hakemi M. RNA secondary structure and qRT-PCR analyses pertained to expressed anti-CD25 CAR in NK-92 cell line. Qom Univ Med Sci J 2020; 14 (2) :1-12
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-2728-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-2728-fa.html
دهباشی معین، حجتی زهره، متولی باشی مجید، گنجعلی خانی حاکمی مزدک. تجزیه‌وتحلیل‌های ساختار ثانویه RNA و qRT-PCR مرتبط با anti-CD25 CAR بیان‌شده در رده‌ی سلولی NK-92. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1399; 14 (2) :1-12
1- بخش ژنتیک، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی و میکروبیولوژی، دانشکده علوم و فناوری های زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران.
2- بخش ژنتیک، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی و میکروبیولوژی، دانشکده علوم و فناوری های زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران. ،z.hojati@sci.ui.ac.ir
3- گروه ایمنی‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
2- بخش ژنتیک، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی و میکروبیولوژی، دانشکده علوم و فناوری های زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران. ،
3- گروه ایمنی‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
واژه‌های کلیدی: بیولوژی کامپیوتری، بیوانفورماتیک، انفورماتیک، qRT-PCR، anti-CD25 CAR، ترابرد، فرار تومور- ایمنی شناسی
متن کامل [PDF 1260 kb]
(1037 دریافت)
| چکیده (HTML) (5108 مشاهده)
متن کامل: (767 مشاهده)
مقدمه
پیشرفت‌های اخیر درزمینه‌ی سلول‌های T وNK مهندسی‌ژنتیک‌شده، به امیدهای فراوانی برای بهره‌گیری از سیستم ایمنی علیه بیماری‌های بدخیم همچون سرطان منجر شده است. یکی از فناوری‌های برجسته که امروزه استفاده‌ی روزافزونی دارد، گیرنده‌های آنتی‌ژنی کایمر یا
(CARs) Chimeric Antigen Receptors است. به‌طورکلی، گیرنده‌های آنتی‌ژنی کایمر شامل توالی‌های cDNA کایمر مهندسی‌شده هستند که همراه با انواع مولکول‌های طراحی‌شده، شناسایی سطح سلول توموری را به‌منظور انتقال یک پیام سلولی فعال‌کننده T یا NK به عهده می‌گیرند. یکی از ویژگی‌های خاص این فناوری این است که برخلاف گیرنده‌های βα سلول T (TCR)، شناسایی آنتی‌ژن‌ها مستقیماً به‌وسیله مولکول‌های CAR صورت می‌گیرد؛ بنابراین، عموماً به اجزای ارائه‌کننده‌ی چند شکل از قبیل آنتی‌ژن‌های لوکوسیت انسانی (HLAs) محدود نیست.
در سال‌های گذشته، زمانی که قطعات ژنی زنجیره‌ی متغیر سبک (VL) یا سنگین (VH) آنتی‌بادی‌ها توانستند هدف‌گیری آنتی‌ژن‌ها را صورت دهند، پیدایش فناوری گیرنده‌ی آنتی‌ژنی کایمر نیز صورت گرفت. این زمانی بود که اجزای مربوطه درون یک هترودیمر βαTCR جایگزین شدند (1). گیرنده‌ی پروتئینی CD25 یا زیرواحد α از گیرنده‌ی IL-2 (IL-2Rα)، یک گلیکو پروتئین غشایی با وزن 55 کیلودالتون است که به‌طور ذاتی و به میزان زیاد بر سطح سلول‌های T تنظیمی یا
Regulatory T cells (Treg) بیان می‌شود و شاخص اصلی این سلول‌هاست. سلول‌های Treg در سیستم ایمنی و به‌ویژه در ناحیه‌ی ریز توموری Tumor microenvironment (TME) با عنوان سلول‌های T تنظیم‌کننده‌ی رخنه‌کننده در تومورها یا (TI-Tregs) Tumor-infiltrating Tregs از سلول‌های مؤثر در مهار پاسخ‌های سیستم ایمنی علیه سرطان هستند و موجب فرار سرطان از سیستم ایمنی می‌شوند.
این سلول‌ها نشانگرهای زیستیCD25، CD4، FoxP3 و نقـش مهمـی در هوموستاز دارند. هوموستاز و توسعه‌ی سلول‌های Treg به‌طور عمده به سایتوکاین IL-2 وابسته است که به CD25 بیان‌شده بر سطح سلول‌های Treg متصل می‌شود. به‌دنبال این فرایند، این سلول‌ها با تولید سایتوکاین‌هایی نظیر IL-10، IL-35، TGFβ سبب مهار پاسخ ایمنی می‌شوند (2). با توجه به این مهم که CD25 نقش مهمی در هوموستاز و توسعه‌ی سلول‌های Treg دارد و آن را به‌عنوان نشانه‌ی پاراکلینیکی برخی از تومورها شناسایی کرده‌اند، آنتی‌بادی مونوکلونال نوترکیب IgG1 انسانی‌شده داکلیزوماب (Daclizumab) ایجاد شده است. سازمان غذا و داروی ایالات‌متحده‌ی آمریکا (FDA) این آنتی‌بادی مونوکلونال را تأیید کرده است که با اتصال به CD25 بر سطح سلول‌های Treg باعث مهار اتصال IL-2 و توقف مسیر پیام‌رسانی JAK/STAT، MEK/Erk و PI3K/Akt برای جلوگیری از زنده‌مانی و تکثیر سلول‌های Treg می‌شوند.
در پژوهش حاضر برای اولین بار، طراحی سازه‌ی نسل سوم CAR علیه آنتی‌ژن CD25 انسانی و مطالعه‌ی بیوانفورماتیکی ساختار ثانویه‌ی RNA anti-CD25 CAR ارزیابی شده است. سپس به‌کمک سیستم لنتی ویروسی، ترابرد سلول‌های NK-92 با سازه‌ی anti-CD25 CAR صورت گرفت و سطح بیان رونوشت مربوطه با qRT-PCR سنجیده شد.
روش بررسی
ساخت سازه‌ی anti-CD25 CAR
سازه‌ی anti-CD25 CAR به طول bp 1551، بین دو جایگاه برشی XbaI در انتهای ’5 و BamHI در انتهای’3 وکتور لنتی ویروسی انتقالی نوع کاذب VSV-G بر مبنای HIV-1 با نام pCDH-513B-1 یا CMV-MCS-EF1α-copGFP-T2A-Puro طراحی شد. (شکل 1).
تغلیظ و تعیین تیتر ویروس‌ها
به‌منظور تغلیظ ذرات لنتی ویروسی ایجادشده، محیط رویی جمع‌آوری‌شده به‌کمک فیلتر سرنگی µm 45/0 فیلتر شد. سپس این مایع رویی به‌کمک PEG-8000 تغلیظ شد. به دنبال آن، تعیین تیتر با اضافه‌کردن حجم‌های متفاوت µl 1، µl 4 و µl 16 از ویروس‌های تغلیظ‌شده به رده‌ی سلولی Lenti-X 293T با جمعیت 60 هزار سلول صورت گرفت. بعد از گذشت 72 ساعت، تعیین تیتر ویروسی به‌کمک فلوسایتومتر بر اساس میزان بیان GFP به‌عنوان واحدهای ترابرد در هر میلی‌لیتر یا
Transducing units/ml (TU/ml) ارزیابی شد (5).
ترابرد رده‌ی سلولی NK-92
به‌طور خلاصه، رده‌ی سلولی NK-92 در پلیت کشت سلولی 24 خانه‌ای با جمعیت 600 هزار سلول در 5/1 میلی‌لیتر محیط کشت کامل Alpha MEM کشت داده شد. حدود 2 ساعت قبل از ترابرد، به میزان U/ml 100 IL-2 به محیط کشت اضافه شد. ذرات ویروسی تعیین تیترشده با فراوانی آلودگی یا
Multiplicity of infection (MOI) 50 و پلی برن با غلظت نهایی μg/ml 8 به محیط کشت حاوی NK-92 اضافه شد. به‌منظور بهبود راندمان ترابرد، سانتریفوژ پلیت کشت سلول حاوی رده‌ی سلولی NK-92 با دور g360 به مدت 90 دقیقه در دمای °C 32 انجام شد. بعد از گذشت 24 ساعت، محیط کشت تعویض و محیط تازه به سلول‌های NK-92 اضافه شد. بعد از گذشت 72 ساعت، سلول‌های NK-92 ترابردشده به‌کمک میکروسکوپ فلورسنت و تجزیه‌وتحلیل فلوسایتومتر ارزیابی شدند. در ادامه، سلول‌های ترابردشده با آنتی‌بیوتیک پورومایسین با غلظت μg/ml 2 ساخت شرکت Sigma-Aldrich آمریکا گزینش و تا رسیدن به جمعیت مطلوب کشت داده شدند (6).
انجام روش qRT-PCR
بر اساس پروتکل مربوط به NucleoSpin®RNA/Protein kit ساخت شرکت آلمانی Macherey-Nagel GmbH & Co.KG، استخراج RNA از رده‌ی سلولی anti-CD25 CAR NK-92 انجام شد. سنتز cDNA تک‌رشته‌ای با 2X RT Pre-Mix Kit ساخت شرکت Biofact کره جنوبی و پروتکل مربوط به آن انجام شد.
سپس آغازگرهای اختصاصی anti-CD25 CAR طراحی‌شده با نرم‌افزار AlleleID 7.7 با توالی‌های
F CAR: GACGACTTCGCCACCTACT و
R CAR: GTCCTCTTCACCTCCACCTT در نظر گرفته شد.
در این پژوهش از آغازگرهای اختصاصی مربوط به GAPDH به‌عنوان ژن مرجع شامل
F (GAPDH): CGGGAAGCTTGTGATCAATGG و R (GAPDH): GGCAGTGATGGCATGGACTG استفاده شد. میزان بیان رونوشت anti-CD25 CAR با دستگاه Step-One Real-Time thermal cycler ساخت شرکت آمریکایی ABI با سه تکرار و درنظرگرفتن شاهد بدون الگو یا
Non-template control (NTC) انجام شد. واکنش qRT-PCR شامل μl 10 2x SYBR Green Master Mix از شرکت Biofact کره جنوبی، pmol/μl 10 از هر پرایمر و μl 1 از
cDNA (ng/μl 50) در حجم نهایی μl20 تهیه شد. برنامه‌ی qRT-PCR شامل واسرشت‌سازی آغازین، °C95 به‌مدت 15 دقیقه، °C95 به‌مدت 20 ثانیه، °C58 به‌مدت 35 ثانیه و °C72 به‌مدت 30 ثانیه در 40 چرخه و °C72 به‌مدت 3 دقیقه برای گسترش نهایی در نظر گرفته شد. همچنین منحنی ذوب دستگاه با اعمال دمای °C95-55 ترسیم و ارزیابی شد. تجزیه‌وتحلیل میزان بیان رونوشت مدنظر با فرمول 2-ΔΔCt تعیین شد.
یافته‌ها
ساختار ثانویه‌ی RNA
تجزیه‌وتحلیل ساختار ثانویه‌ی anti-CD25 RNA نشان داد انرژی آزاد کمینه یا Minimum free energy (MFE) و انرژی آزاد گروه ترمودینامیکی یا Free energy of the thermodynamic ensemble به‌ترتیب kcal/mol 90/701- و kcal/mol 46/722- به‌دست آمد. همچنین ساختار ثانویه‌ی مرکزی با انرژی آزاد کمینه یاCentroid secondary structure with a minimum free energy برابر kcal/mol 10/554- ارزیابی شد. به دنبال آن، ساختار ثانویه‌ی MFE احتمال تشکیل جفت باز و mountain plot ترسیم شد (شکل 2).
سطح بیان رونوشت anti-CD25 CAR در رده‌ی سلولی NK-92
همان‌طور که در شکل 7 نشان داده شده است، سطوح بیان رونوشت مذکور در سلول‌های NK-92 ترابردشده با وکتور pCDH-513B-1-anti-CD25 CAR، در سـلــول‌هـای NK-92
ترابردشده با وکتور تقلیدی (Mock) و در سلول‌های NK-92 ترابردنشده (شاهد منفی) به‌کمک qRT-PCR ارزیابی شد.
نتایج نشان داد سطح بیان رونوشت anti-CD25 CAR نسبت به نمونه‌ی تقلیدی و شاهد منفی و معنی‌دار است (P˂0.0001).
بالاتر جمعیت سلول‌های Treg توانسته است به‌عنوان نشانگر تشخیصی زودهنگام برای سرطان لوسمی مزمن لنفوئیدی یاChronic lymphocytic leukemia (CLL) محسوب شود (19).
دوئل و همکاران در سال 2017 نشان دادند حذف سلول‌های Treg در بیماران لوسمی حاد لنفوئیدی یا
(ALL) Acute lymphoblastic leukemia پیش‌ساز B ممکن است آن‌ها را از وضعیت بدون پاسخ به درمان با آنتی‌بادی مونوکلونال بلیناتوموماب (Blinatumomab) به وضعیت پاسخگو به درمان با این آنتی‌بادی تبدیل کند (20). همچنین نشان داده شده است نیولوماب (Nivolumab) به‌عنوان آنتی‌بادی بلوکه‌کننده PD-1 ممکن است از تهاجم ایمنی تومور در بیماران مبتلابه لنفوم هوجکین بازگشت‌کننده و مقاوم جلوگیری کند.
نتیجه‌گیری شده است که در سرطان‌های پروستات (21)، ریه (22)، معده و مری (23)، دهان (24) و ALL (25) با وضعیت پیشرفته، سلول‌های CD4+CD25high T cell رخنه‌کننده در تومورها به‌شکل وسیعی اطراف تومورها تجمع می‌یابند. همچنین در برخی سرطان‌ها همچون پستان و ریه، جمعیت سلول‌های CD4+CD25+FOXP3+ Tregs به‌طور گسترده‌ای همراه با گسترش بیماری افزایش می‌یابد (26).
یکی از مهم‌ترین سرنخ‌ها مربوط به نقش پررنگ این سلول‌ها در درمان ناموفق سرطان به مطالعه‌ی اونیزوکا و همکاران و شیمیزو و همکاران در سال 1999 بازمی‌گردد. در این دو مطالعه نشان داده شد حذف سلول‌های CD4+CD25+ Tregs به‌کمک درمان با آنتی‌بادی ضد CD25 می‌تواند حذف انواع تومورها را در شرایط in vitro و in vivo افزایش دهد که نتیجه‌ی آن گسترش ایمنی‌زایی موفق علیه تومورهاست (27، 28).
بر اساس داده‌های گسترده‌ی موجود، طیف وسیعی از سرطان‌های جامد و مایع مکانیزم مشترکی برای فرار از سیستم ایمنی دارند. بدین‌ترتیب، مبارزه با فرار انواع تومورها از سیستم ایمنی و شکستن مقاومت و ویژگی بازگشت‌کننده‌ی این نوع سرطان‌ها می‌تواند نویدبخش درمان‌های موفق برای بیماران باشد. جدیدترین نوع درمان سرطان از بین روش‌های درمانی که در حال حاضر نتایج بسیار موفقی را در پی داشتـه اسـت، روش‌های ایمنی درمانی
سلولی بر پایه‌ی تغییرات ژنتیکی است که در سلول‌های T و NK انجام می‌پذیرد و با عنوان گیرنده‌های آنتی‌ژنی کایمر (CAR) قلمداد می‌شود.
در این پژوهش با بهره‌گیری از داده‌های موجود در انواع سرطان‌های جامد و مایع پیرامون مکانیزم مشترک فرار سرطان‌ها از سیستم ایمنی، برای اولین بار بر این نکته تلاش شد که گیرنده‌ی آنتی‌ژنی کایمر نسل سوم در پرمزیت‌ترین نوع سلول ایمنی یعنی NK علیه آنتی‌ژن CD25 انسانی طراحی شود. در این مطالعه به‌کمک تجزیه‌وتحلیل بیوانفورماتیکی، ساختار ثانویه‌ی رونوشت anti-CD25 CAR باهدف بررسی پایداری ارزیابی شد. در ادامه، بیان رونوشت مدنظر بعد از ترابرد سلول‌های NK-92 به‌کمک qRT-PCR سنجیده شد.
به‌طورکلی، بر اساس اصول ترمودینامیک، منفی‌ترین میزان انرژی آزاد در یک ساختار ثانویه RNA، به‌عنوان پایدارترین ساختار RNA شناخته می‌شود. همچنین پیش‌بینی یک ساختار RNA از یک توالی، دربرگیرنده‌ی موضوع اساسی تجزیه‌وتحلیل این مولکول است. ساختار RNA معمولاً در دو سطح از پیچیدگی شناخته می‌شود. سطح اول، ساختار ثانویه‌ای را تشکیل می‌دهد که نشان‌دهنده‌ی جفت‌شدگی بازی متداول است. این نکته از اینکه هر ریبونوکلئوتید، یک جفت‌شدگی بازی را شکل دهد یا ندهد، متفاوت است. برهمکنش‌های ایجادکننده‌ی ساختار ثانویه معمولاً قدرتمندتر از آن‌هایی است که تعیین‌کننده‌ی سطح بعدی پیچیدگی ساختاری یعنی ساختار سوم باشد؛ بنابراین، این امر تفسیر ساختار سوم برهمکنش‌ها را از اجزای ساختار ثانویه امکان‌پذیر می‌سازد. ساختار ثانویه‌ی RNA anti-CD25 CAR، نشان داد شاخص‌های مهمی شامل انرژی آزاد کمینه (MFE)، انرژی آزاد گروه ترمودینامیکی و ساختار ثانویه‌ی مرکزی با انرژی آزاد کمینه در سطح مناسبی قرار داشتند که نشان‌دهنده‌ی پایداری ساختار این RNA طویل بود که ازنظر طولی از نه توالی رمزگردان تشکیل شده بود.
تاکنون هیچ مطالعه‌ای بر اساس تجزیه‌وتحلیل بیوانفورماتیکی ساختار ثانویه‌ی RNA در انواع سازه‌های CAR صورت نگرفته است. در اینجا می‌توان پیشنهاد کرد که در صورت استفاده از این تجزیه‌وتحلیـل، راندمان میـزان بیـان رونوشـت سـازه‌های پیچیده‌ی
CAR افزایش یابد که هریک از قطعات cDNA متعددی تشکیل شده است و هزینه‌های تولید این دسته از مولکول‌های درمانگر گران‌قیمت کاهش خواهد یافت.
در گام بعدی این پژوهش، میزان بیان رونوشت
anti-CD25 CAR ارزیابی شد. نتایج مربوط به آن نشان داد در رده‌ی سلولی NK-92 ترابردشده با وکتور انتقالی
pCDH-513B-1-anti-CD25 CARنسبت به سلول‌های NK-92 ترابردشده با وکتور تقلیدی و سلول‌های ترابردنشده افزایش بیان چشمگیر و معنی‌داری وجود دارد.
نتیجه‌گیری
امروزه با وجود پیشرفت‌های خیره‌کننده در هدف‌گیری آنتی‌ژن‌های توموری با انواع CAR، هنوز مسائل مهمی همچون بازگشت سرطان، درمان ناموفق و فرار سرطان از سیستم ایمنی بی‌پاسخ مانده است. بر اساس منابع مذکور، به‌نظر می‌رسد حذف سلول‌های TI-Treg در خلال درمان ممکن است به‌طور بالقوه نتایج مثبتی را در انواع سرطان‌های جامد و مایع، بر اساس مکانیزم مشابه، به‌همـراه داشتـه باشـد؛ بنابراین، در مطـالعـه‌ی حاضـر با این
هدف برای اولین بار نوع جدیدی از این گیرنده در سلول‌های NK-92 به‌منظور هدف‌گیری آنتی‌ژن CD25 انسانی طراحی شد. مطالعه‌ی حاضر پیرامون رونوشت anti-CD25 CAR، با دیدگاه بیوانفورماتیکی و آزمایشگاهی نشان داد رونوشت این نوع CAR پایدار بود و در سطح بالایی بیان شد. درواقع، این نوع CAR در آینده می‌تواند به‌عنوان ابزاری برای برطرف‌کردن فرار سرطان از سیستم ایمنی در انواع سرطان‌های جامد و مایع بیشتر بررسی شود.
تشکر و قدردانی
این مقاله از پایان‌نامه‌ی دکترای تخصصی رشته‌ی زیست‌شناسی-ژنتیک مولکولی گرفته شده که آقای معین دهباشی آن را انجام داده است. پروپوزال مربوطه با شماره‌ی 8489 در معاونت پژوهشی دانشگاه اصفهان تصویب شده است. بدین‌وسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه اصفهان، ریاست محترم دانشکده‌ی علوم و فناوری‌های زیستی و ریاست محترم گروه سلولی و مولکولی و میکروبیولوژی به‌دلیل فراهم‌آوری امکانات و تجهیزات پژوهشی لازم کمال قدردانی و سپاس را داریم.
پیشرفت‌های اخیر درزمینه‌ی سلول‌های T وNK مهندسی‌ژنتیک‌شده، به امیدهای فراوانی برای بهره‌گیری از سیستم ایمنی علیه بیماری‌های بدخیم همچون سرطان منجر شده است. یکی از فناوری‌های برجسته که امروزه استفاده‌ی روزافزونی دارد، گیرنده‌های آنتی‌ژنی کایمر یا
(CARs) Chimeric Antigen Receptors است. به‌طورکلی، گیرنده‌های آنتی‌ژنی کایمر شامل توالی‌های cDNA کایمر مهندسی‌شده هستند که همراه با انواع مولکول‌های طراحی‌شده، شناسایی سطح سلول توموری را به‌منظور انتقال یک پیام سلولی فعال‌کننده T یا NK به عهده می‌گیرند. یکی از ویژگی‌های خاص این فناوری این است که برخلاف گیرنده‌های βα سلول T (TCR)، شناسایی آنتی‌ژن‌ها مستقیماً به‌وسیله مولکول‌های CAR صورت می‌گیرد؛ بنابراین، عموماً به اجزای ارائه‌کننده‌ی چند شکل از قبیل آنتی‌ژن‌های لوکوسیت انسانی (HLAs) محدود نیست.
در سال‌های گذشته، زمانی که قطعات ژنی زنجیره‌ی متغیر سبک (VL) یا سنگین (VH) آنتی‌بادی‌ها توانستند هدف‌گیری آنتی‌ژن‌ها را صورت دهند، پیدایش فناوری گیرنده‌ی آنتی‌ژنی کایمر نیز صورت گرفت. این زمانی بود که اجزای مربوطه درون یک هترودیمر βαTCR جایگزین شدند (1). گیرنده‌ی پروتئینی CD25 یا زیرواحد α از گیرنده‌ی IL-2 (IL-2Rα)، یک گلیکو پروتئین غشایی با وزن 55 کیلودالتون است که به‌طور ذاتی و به میزان زیاد بر سطح سلول‌های T تنظیمی یا
Regulatory T cells (Treg) بیان می‌شود و شاخص اصلی این سلول‌هاست. سلول‌های Treg در سیستم ایمنی و به‌ویژه در ناحیه‌ی ریز توموری Tumor microenvironment (TME) با عنوان سلول‌های T تنظیم‌کننده‌ی رخنه‌کننده در تومورها یا (TI-Tregs) Tumor-infiltrating Tregs از سلول‌های مؤثر در مهار پاسخ‌های سیستم ایمنی علیه سرطان هستند و موجب فرار سرطان از سیستم ایمنی می‌شوند.
این سلول‌ها نشانگرهای زیستیCD25، CD4، FoxP3 و نقـش مهمـی در هوموستاز دارند. هوموستاز و توسعه‌ی سلول‌های Treg به‌طور عمده به سایتوکاین IL-2 وابسته است که به CD25 بیان‌شده بر سطح سلول‌های Treg متصل می‌شود. به‌دنبال این فرایند، این سلول‌ها با تولید سایتوکاین‌هایی نظیر IL-10، IL-35، TGFβ سبب مهار پاسخ ایمنی می‌شوند (2). با توجه به این مهم که CD25 نقش مهمی در هوموستاز و توسعه‌ی سلول‌های Treg دارد و آن را به‌عنوان نشانه‌ی پاراکلینیکی برخی از تومورها شناسایی کرده‌اند، آنتی‌بادی مونوکلونال نوترکیب IgG1 انسانی‌شده داکلیزوماب (Daclizumab) ایجاد شده است. سازمان غذا و داروی ایالات‌متحده‌ی آمریکا (FDA) این آنتی‌بادی مونوکلونال را تأیید کرده است که با اتصال به CD25 بر سطح سلول‌های Treg باعث مهار اتصال IL-2 و توقف مسیر پیام‌رسانی JAK/STAT، MEK/Erk و PI3K/Akt برای جلوگیری از زنده‌مانی و تکثیر سلول‌های Treg می‌شوند.
در پژوهش حاضر برای اولین بار، طراحی سازه‌ی نسل سوم CAR علیه آنتی‌ژن CD25 انسانی و مطالعه‌ی بیوانفورماتیکی ساختار ثانویه‌ی RNA anti-CD25 CAR ارزیابی شده است. سپس به‌کمک سیستم لنتی ویروسی، ترابرد سلول‌های NK-92 با سازه‌ی anti-CD25 CAR صورت گرفت و سطح بیان رونوشت مربوطه با qRT-PCR سنجیده شد.
روش بررسی
ساخت سازه‌ی anti-CD25 CAR
سازه‌ی anti-CD25 CAR به طول bp 1551، بین دو جایگاه برشی XbaI در انتهای ’5 و BamHI در انتهای’3 وکتور لنتی ویروسی انتقالی نوع کاذب VSV-G بر مبنای HIV-1 با نام pCDH-513B-1 یا CMV-MCS-EF1α-copGFP-T2A-Puro طراحی شد. (شکل 1).
|
شکل شماره 1: نمودار سازه‌ی ژنی anti-CD25 CAR درون وکتور pCDH513B
|
|
از قطعه‌ی متغیر تک‌زنجیره‌ای یا (scFv) Single chain variable fragment مربوط به آنتی‌بادی مونوکلونال داکلیزوماب به همراه اتصال‌دهنده‌ی غنی از گلایسین و سرین یعنی (Gly4Ser)3 باهدف طراحی و تولید anti-CD25 CAR استفاده شد.
تجزیه‌وتحلیل محاسباتی درزمینه‌ی ساختار ثانویه‌ی رونوشت anti-CD25 CAR به دنبال طراحی سازه‌ی مدنظر، به‌کمک وب سرور RNAfold به نشانی http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi (3) ساختار ثانویه anti-CD25 CAR RNA ارزیابی شد. رده‌های سلولی و کشت سلول رده‌ی سلولی Lenti-X 293T در محیط کشت DMEM ساخت شرکت ایرانی Bio-Idea و رده‌ی سلولی Jurkat در محیط کشت RPMI 1640 ساخت شرکت ایرانی Bio-Idea غنی‌شده با 10 درصد FBS و 1 درصد پنی‌سیلین-استرپتومایسین کشت داده شد. رده‌ی سلولی NK-92 در محیط کشت Alpha MEM ساخت شرکت آمریکایی Sigma-Aldrich بدون ریبونوکلئوزیدها و دزوکسی ریبونوکلئوزیدها همراه با mM 2 L-گلوتامین و g/mol 5/1 سدیم بی‌کربنات کشت داده شد. به‌منظور غنی‌سازی آن mM 2/0 اینوزیتول، mM 1/0 2-مرکاپتواتانول، mM 02/0 فولیک اسید، U/ml 200-100 IL-2 نوترکیب انسانی، 1 درصد پنی‌سیلین-استرپتومایسین، 5/12 درصد سرم اسب و 5/12 درصد FBS به محیط کشت اضافه شد. |
|
فلاسک‌های حاوی رده‌های سلولی در انکوباتور کشت سلول با دمای °C 37 و CO2 5 درصد نگهداری شد.
تولید ذرات لنتی ویروسی حاوی سازه در ادامه، شرکت System Bioscience آمریکا سازه‌ی مدنظر را سنتز کرد و درون وکتور انتقالی مذکور قرار گرفت. به‌منظور تولید ذرات لنتی ویروسی، رده‌ی سلولی Lenti-X 293 T و وکتورهای ps-PAX2.2 و pMD2.G ساخت شرکت آمریکایی Addgene به‌ترتیب به‌عنوان رده‌ی سلولی بسته‌بندی‌کننده، وکتور بسته‌بندی‌کننده و وکتور پوششی مورداستفاده قرار گرفتند. به‌طور خلاصه، رده‌ی سلولی Lenti-X 293 T به تعداد 6 میلیون سلول در یک فلاسک T75 در ml 8 محیط DMEM کشت داده شد. به‌منظور ترادیسی از سویه‌ی E. coli TOP10 و روش شوک حرارتی استفاده شد. به‌منظور ایجاد ذرات لنتی ویروسی، ترآلودگی هم‌زمان با μg 21 وکتور ps-PAX2.2، μg 5/10 وکتور pMD2.G و μg 21 وکتور انتقالی حاوی سازه‌ی pCDH-anti-CD25 CAR در رده‌ی سلولی Lenti-X 293T با روش رسوب کلسیم-فسفات صورت گرفت. بعد از گذشت 16 ساعت محیط کشت تعویض شد و به‌کمک میکروسکوپ فلورسنت راندمان ترآلودگی هم‌زمان ارزیابی شد. محیط رویی حاوی ذرات لنتی ویروسی در زمان‌های 24، 48 و 72 بعد از ترآلودگی جمع‌آوری شدند (4). |
|
بحث
سالمونلوزیس یکی از مهم‌ترین بیماری‌های باکتریایی مشترک بین انسان و طیور در سراسر دنیا است. طیور صنعتی و فرآورده‌های آن‌ها به ویژه تخم مرغ‌های آلوده، مهم‌ترین منبع انتقال سروتیپ‌های متحرک گروه پاراتیفوئیدی و ایجاد مسمومیت‌های غذایی در انسان می‌باشند (3،19،20،21)؛ بنابراین شناسایی و کنترل سالمونلا از نظر بهداشت عمومی اهمیت فراوانی دارد و با وجود تمامی اقدامات انجام شده و پیشرفت‌های بهداشتی همچنان به عنوان یک معضل جهانی محسوب می‌شود؛ به طوری که در مطالعات صورت‌گرفته، وجود آلودگی سالمونلایی در تخم مرغ در کشورهای مختلف نشان داده شده و درصد آلودگی با باکتری سالمونلا متغیر می‌باشد. |
|
در سال 1998، 4/0 درصد از تخم مرغ‌های هچری مزارع طیور صنعتی در کانادا آلوده به سالمونلا گزارش شدند (22). در این ارتباط، در لهستان (2001) 1200 تخم مرغ از فروشگاه‌های خرده‌فروشی جهت بررسی سالمونلا جمع‌آوری گردید که در پوسته و محتویات آن‌ها هیچ‌گونه آلودگی مشاهده نشد (23). همچنین در مطالعه‌ای که در سال 2006 در ارتباط با تخم مرغ‌های کشورهای اروپایی صورت گرفت، میزان آلودگی سالمونلایی 0 تا 3/13 درصد گزارش گردید (2). در پژوهشی که در سال 2006 در شهر کویمباتور در جنوب هندوستان انجام شد، میزان آلودگی پوسته و محتویات تخم مرغ‌های صنعتی جمع‌آوری شده از فروشگاه‌های خرده‌فروشی به ترتیب معادل 9/5 و 8/1 درصد محاسبه گردید (24).
|
به‌منظور تغلیظ ذرات لنتی ویروسی ایجادشده، محیط رویی جمع‌آوری‌شده به‌کمک فیلتر سرنگی µm 45/0 فیلتر شد. سپس این مایع رویی به‌کمک PEG-8000 تغلیظ شد. به دنبال آن، تعیین تیتر با اضافه‌کردن حجم‌های متفاوت µl 1، µl 4 و µl 16 از ویروس‌های تغلیظ‌شده به رده‌ی سلولی Lenti-X 293T با جمعیت 60 هزار سلول صورت گرفت. بعد از گذشت 72 ساعت، تعیین تیتر ویروسی به‌کمک فلوسایتومتر بر اساس میزان بیان GFP به‌عنوان واحدهای ترابرد در هر میلی‌لیتر یا
Transducing units/ml (TU/ml) ارزیابی شد (5).
ترابرد رده‌ی سلولی NK-92
به‌طور خلاصه، رده‌ی سلولی NK-92 در پلیت کشت سلولی 24 خانه‌ای با جمعیت 600 هزار سلول در 5/1 میلی‌لیتر محیط کشت کامل Alpha MEM کشت داده شد. حدود 2 ساعت قبل از ترابرد، به میزان U/ml 100 IL-2 به محیط کشت اضافه شد. ذرات ویروسی تعیین تیترشده با فراوانی آلودگی یا
Multiplicity of infection (MOI) 50 و پلی برن با غلظت نهایی μg/ml 8 به محیط کشت حاوی NK-92 اضافه شد. به‌منظور بهبود راندمان ترابرد، سانتریفوژ پلیت کشت سلول حاوی رده‌ی سلولی NK-92 با دور g360 به مدت 90 دقیقه در دمای °C 32 انجام شد. بعد از گذشت 24 ساعت، محیط کشت تعویض و محیط تازه به سلول‌های NK-92 اضافه شد. بعد از گذشت 72 ساعت، سلول‌های NK-92 ترابردشده به‌کمک میکروسکوپ فلورسنت و تجزیه‌وتحلیل فلوسایتومتر ارزیابی شدند. در ادامه، سلول‌های ترابردشده با آنتی‌بیوتیک پورومایسین با غلظت μg/ml 2 ساخت شرکت Sigma-Aldrich آمریکا گزینش و تا رسیدن به جمعیت مطلوب کشت داده شدند (6).
انجام روش qRT-PCR
بر اساس پروتکل مربوط به NucleoSpin®RNA/Protein kit ساخت شرکت آلمانی Macherey-Nagel GmbH & Co.KG، استخراج RNA از رده‌ی سلولی anti-CD25 CAR NK-92 انجام شد. سنتز cDNA تک‌رشته‌ای با 2X RT Pre-Mix Kit ساخت شرکت Biofact کره جنوبی و پروتکل مربوط به آن انجام شد.
سپس آغازگرهای اختصاصی anti-CD25 CAR طراحی‌شده با نرم‌افزار AlleleID 7.7 با توالی‌های
F CAR: GACGACTTCGCCACCTACT و
R CAR: GTCCTCTTCACCTCCACCTT در نظر گرفته شد.
در این پژوهش از آغازگرهای اختصاصی مربوط به GAPDH به‌عنوان ژن مرجع شامل
F (GAPDH): CGGGAAGCTTGTGATCAATGG و R (GAPDH): GGCAGTGATGGCATGGACTG استفاده شد. میزان بیان رونوشت anti-CD25 CAR با دستگاه Step-One Real-Time thermal cycler ساخت شرکت آمریکایی ABI با سه تکرار و درنظرگرفتن شاهد بدون الگو یا
Non-template control (NTC) انجام شد. واکنش qRT-PCR شامل μl 10 2x SYBR Green Master Mix از شرکت Biofact کره جنوبی، pmol/μl 10 از هر پرایمر و μl 1 از
cDNA (ng/μl 50) در حجم نهایی μl20 تهیه شد. برنامه‌ی qRT-PCR شامل واسرشت‌سازی آغازین، °C95 به‌مدت 15 دقیقه، °C95 به‌مدت 20 ثانیه، °C58 به‌مدت 35 ثانیه و °C72 به‌مدت 30 ثانیه در 40 چرخه و °C72 به‌مدت 3 دقیقه برای گسترش نهایی در نظر گرفته شد. همچنین منحنی ذوب دستگاه با اعمال دمای °C95-55 ترسیم و ارزیابی شد. تجزیه‌وتحلیل میزان بیان رونوشت مدنظر با فرمول 2-ΔΔCt تعیین شد.
یافته‌ها
ساختار ثانویه‌ی RNA
تجزیه‌وتحلیل ساختار ثانویه‌ی anti-CD25 RNA نشان داد انرژی آزاد کمینه یا Minimum free energy (MFE) و انرژی آزاد گروه ترمودینامیکی یا Free energy of the thermodynamic ensemble به‌ترتیب kcal/mol 90/701- و kcal/mol 46/722- به‌دست آمد. همچنین ساختار ثانویه‌ی مرکزی با انرژی آزاد کمینه یاCentroid secondary structure with a minimum free energy برابر kcal/mol 10/554- ارزیابی شد. به دنبال آن، ساختار ثانویه‌ی MFE احتمال تشکیل جفت باز و mountain plot ترسیم شد (شکل 2).
|
به‌منظور تعیین تیتر ویروس‌های تولیدشده، سلول‌های Lenti-X 293T با فلوسایتومتر تجزیه‌وتحلیل شدند.
|
|
شکل شماره 2: نتایج بیوانفورماتیکی ساختار ثانویه‌ی RNA مربوط به anti-CD25 CAR (الف) plot mountain، (ب) ساختار ثانویه بر اساس انرژی آزاد کمینه، (ج) احتمال تشکیل جفت باز |
|
ایجاد رده‌ی سلولی NK-92 بیان‌کننده anti-CD25 CAR
به دنبال ترآلـودگـی هـم‌زمـان سـه وکـتـور مذکـور، سلـول‌هـای |
|
Lenti-X 293T بیان‌کننده‌ی GFP به‌عنوان سلول‌هایی با درخشش سبزرنگ بعد از گذشت 16 ساعت در زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده شدند (شکل 3).
|
|
6
|
|
مجله دانشگاه علوم پزشکی قم/ دوره چهاردهم، شماره دوم، اردیبهشت 1399
International License Creative Commons Attribution License 4.0 |
|
شکل شماره 3: تصاویر میکروسکوپ (الف) نوری و (ب) فلوروسنت معکوس با بزرگ‌نمایی40 مربوط به سلول‌های Lenti-X 293T پس از ترآلودگی |
|
این سلول‌ها میزان بیان 2/14 درصد با استفاده از حجم μl 16 از سوپ ویروسی داشتند (شکل 4).
|
بر اساس 50MOI= ویروس‌های تغلیظ‌شده به ترابرد رده‌ی سلولی NK-92 به میزان 6/91 درصد منجر شدند (شکل 5).
|
شکل شماره4: اندازه‌گیری درصد بیان GFP در سلول‌های Lenti-X 293T حاوی lμ 16 ویروس تغلیظ‌شده دارای سازه‌ی anti-CD25 CAR توسط فلوسایتومتری |
|
این یافته با میکروسکوپ فلورسنت (شکل 6) و زنده‌مانی در برابر غلظت پورومایسین مذکور تأیید شد.
|
|
شکل شماره 5: اندازه‌گیری درصد بیان GFP در سلول‌های NK-92 ترابردشده با لنتی ویروس‌های حاوی سازه‌ی anti-CD25 CAR توسط فلوسایتومتری شکل شماره 6: تصاویر میکروسکوپ (الف) نوری و (ب) فلورسنت معکوس با بزرگ‌نمایی 100 مربوط به رده‌ی سلولی NK-92 ترابردشده حاوی سازه‌ی CAR |
سطح بیان رونوشت anti-CD25 CAR در رده‌ی سلولی NK-92
همان‌طور که در شکل 7 نشان داده شده است، سطوح بیان رونوشت مذکور در سلول‌های NK-92 ترابردشده با وکتور pCDH-513B-1-anti-CD25 CAR، در سـلــول‌هـای NK-92
|
بحث
سلول‌های Treg اصلی‌ترین مانع درمان موفق سرطان محسوب می‌شوند. درواقع، کاهش نسبت سلول‌هایCD8+T به سلول‌های Treg که در ریز محیط توموری (TME) نیز تجمع می‌یابند، با پیش‌آگهی ضعیف، درمان ناموفق و کاهش زنده‌مانی بیماران مبتلابه انواع مختلف سرطان همچون لنفوم غیرهوجکین (7)، سرطان تخمدان (8)، سرطان ریه (9)، گلیوبلاستوما (10)، آدنوکارسینوم پانکراس داکتال (11)، سرطان پستان (12)، سرطان کبد (13)، سرطان دهانه‌ی رحم (14)، ملانوما و دیگر بدخیمی‌ها همبستگی دارد. همچنین برخی گزارش‌ها قاطعانه بر شاخص پیش‌آگهی ضعیف تأکید دارد که با افزایش تعداد سلول‌های Treg در سرطان سر و گردن همبستگی نشان می‌دهد (15). به‌طور بحث‌برانگیز، دیگر گزارش‌ها وضعیت کاملاً متفاوتی را با افزایش سطح سلول‌های Treg نشان داد که در آن بهبود موضعی و افزایش زنده‌مانی بیماران مبتلابه سرطان سر و گردن را مشخص کرد (16). |
ترابردشده با وکتور تقلیدی (Mock) و در سلول‌های NK-92 ترابردنشده (شاهد منفی) به‌کمک qRT-PCR ارزیابی شد.
نتایج نشان داد سطح بیان رونوشت anti-CD25 CAR نسبت به نمونه‌ی تقلیدی و شاهد منفی و معنی‌دار است (P˂0.0001).
|
درباره‌ی سرطان معده، افزایش میزان سلول‌های Treg با پیش‌آگهی ضعیف در این نوع سرطان همراه بوده است؛ اما همبستگی بین سلول‌های TI-Treg و سرطان معده هنوز مبهم است.
درباره‌ی سرطان روده‌ی بزرگ مشخص شده است که میزان سلول‌های Treg فعال‌شده‌ی تجمع‌یافته بین سلول‌های TI-Tregs با مرحله‌ی پیشرفت تومور مرتبط است که می‌توان از آن به‌عنوان عامل مهمی برای بهبود کارایی روش‌های درمانی استفاده کرد (17). در سرطان لوسمی حاد میلوئیدی یا (AML) Acute myeloid leukemia، سلول‌های بلاست لوسمی به افزایش سلول‌های Treg در ریز محیط توموری (TME) منجر می‌شوند (18). اوستن و همکاران در سال 2011 دریافتند هدف‌گیری و کاهش جمعیت سلول‌های Treg ممکن است به‌عنوان درمان نویدبخشی برای سرطان AML موردتوجه واقع شود. |
دوئل و همکاران در سال 2017 نشان دادند حذف سلول‌های Treg در بیماران لوسمی حاد لنفوئیدی یا
(ALL) Acute lymphoblastic leukemia پیش‌ساز B ممکن است آن‌ها را از وضعیت بدون پاسخ به درمان با آنتی‌بادی مونوکلونال بلیناتوموماب (Blinatumomab) به وضعیت پاسخگو به درمان با این آنتی‌بادی تبدیل کند (20). همچنین نشان داده شده است نیولوماب (Nivolumab) به‌عنوان آنتی‌بادی بلوکه‌کننده PD-1 ممکن است از تهاجم ایمنی تومور در بیماران مبتلابه لنفوم هوجکین بازگشت‌کننده و مقاوم جلوگیری کند.
نتیجه‌گیری شده است که در سرطان‌های پروستات (21)، ریه (22)، معده و مری (23)، دهان (24) و ALL (25) با وضعیت پیشرفته، سلول‌های CD4+CD25high T cell رخنه‌کننده در تومورها به‌شکل وسیعی اطراف تومورها تجمع می‌یابند. همچنین در برخی سرطان‌ها همچون پستان و ریه، جمعیت سلول‌های CD4+CD25+FOXP3+ Tregs به‌طور گسترده‌ای همراه با گسترش بیماری افزایش می‌یابد (26).
یکی از مهم‌ترین سرنخ‌ها مربوط به نقش پررنگ این سلول‌ها در درمان ناموفق سرطان به مطالعه‌ی اونیزوکا و همکاران و شیمیزو و همکاران در سال 1999 بازمی‌گردد. در این دو مطالعه نشان داده شد حذف سلول‌های CD4+CD25+ Tregs به‌کمک درمان با آنتی‌بادی ضد CD25 می‌تواند حذف انواع تومورها را در شرایط in vitro و in vivo افزایش دهد که نتیجه‌ی آن گسترش ایمنی‌زایی موفق علیه تومورهاست (27، 28).
بر اساس داده‌های گسترده‌ی موجود، طیف وسیعی از سرطان‌های جامد و مایع مکانیزم مشترکی برای فرار از سیستم ایمنی دارند. بدین‌ترتیب، مبارزه با فرار انواع تومورها از سیستم ایمنی و شکستن مقاومت و ویژگی بازگشت‌کننده‌ی این نوع سرطان‌ها می‌تواند نویدبخش درمان‌های موفق برای بیماران باشد. جدیدترین نوع درمان سرطان از بین روش‌های درمانی که در حال حاضر نتایج بسیار موفقی را در پی داشتـه اسـت، روش‌های ایمنی درمانی
سلولی بر پایه‌ی تغییرات ژنتیکی است که در سلول‌های T و NK انجام می‌پذیرد و با عنوان گیرنده‌های آنتی‌ژنی کایمر (CAR) قلمداد می‌شود.
در این پژوهش با بهره‌گیری از داده‌های موجود در انواع سرطان‌های جامد و مایع پیرامون مکانیزم مشترک فرار سرطان‌ها از سیستم ایمنی، برای اولین بار بر این نکته تلاش شد که گیرنده‌ی آنتی‌ژنی کایمر نسل سوم در پرمزیت‌ترین نوع سلول ایمنی یعنی NK علیه آنتی‌ژن CD25 انسانی طراحی شود. در این مطالعه به‌کمک تجزیه‌وتحلیل بیوانفورماتیکی، ساختار ثانویه‌ی رونوشت anti-CD25 CAR باهدف بررسی پایداری ارزیابی شد. در ادامه، بیان رونوشت مدنظر بعد از ترابرد سلول‌های NK-92 به‌کمک qRT-PCR سنجیده شد.
به‌طورکلی، بر اساس اصول ترمودینامیک، منفی‌ترین میزان انرژی آزاد در یک ساختار ثانویه RNA، به‌عنوان پایدارترین ساختار RNA شناخته می‌شود. همچنین پیش‌بینی یک ساختار RNA از یک توالی، دربرگیرنده‌ی موضوع اساسی تجزیه‌وتحلیل این مولکول است. ساختار RNA معمولاً در دو سطح از پیچیدگی شناخته می‌شود. سطح اول، ساختار ثانویه‌ای را تشکیل می‌دهد که نشان‌دهنده‌ی جفت‌شدگی بازی متداول است. این نکته از اینکه هر ریبونوکلئوتید، یک جفت‌شدگی بازی را شکل دهد یا ندهد، متفاوت است. برهمکنش‌های ایجادکننده‌ی ساختار ثانویه معمولاً قدرتمندتر از آن‌هایی است که تعیین‌کننده‌ی سطح بعدی پیچیدگی ساختاری یعنی ساختار سوم باشد؛ بنابراین، این امر تفسیر ساختار سوم برهمکنش‌ها را از اجزای ساختار ثانویه امکان‌پذیر می‌سازد. ساختار ثانویه‌ی RNA anti-CD25 CAR، نشان داد شاخص‌های مهمی شامل انرژی آزاد کمینه (MFE)، انرژی آزاد گروه ترمودینامیکی و ساختار ثانویه‌ی مرکزی با انرژی آزاد کمینه در سطح مناسبی قرار داشتند که نشان‌دهنده‌ی پایداری ساختار این RNA طویل بود که ازنظر طولی از نه توالی رمزگردان تشکیل شده بود.
تاکنون هیچ مطالعه‌ای بر اساس تجزیه‌وتحلیل بیوانفورماتیکی ساختار ثانویه‌ی RNA در انواع سازه‌های CAR صورت نگرفته است. در اینجا می‌توان پیشنهاد کرد که در صورت استفاده از این تجزیه‌وتحلیـل، راندمان میـزان بیـان رونوشـت سـازه‌های پیچیده‌ی
CAR افزایش یابد که هریک از قطعات cDNA متعددی تشکیل شده است و هزینه‌های تولید این دسته از مولکول‌های درمانگر گران‌قیمت کاهش خواهد یافت.
در گام بعدی این پژوهش، میزان بیان رونوشت
anti-CD25 CAR ارزیابی شد. نتایج مربوط به آن نشان داد در رده‌ی سلولی NK-92 ترابردشده با وکتور انتقالی
pCDH-513B-1-anti-CD25 CARنسبت به سلول‌های NK-92 ترابردشده با وکتور تقلیدی و سلول‌های ترابردنشده افزایش بیان چشمگیر و معنی‌داری وجود دارد.
نتیجه‌گیری
امروزه با وجود پیشرفت‌های خیره‌کننده در هدف‌گیری آنتی‌ژن‌های توموری با انواع CAR، هنوز مسائل مهمی همچون بازگشت سرطان، درمان ناموفق و فرار سرطان از سیستم ایمنی بی‌پاسخ مانده است. بر اساس منابع مذکور، به‌نظر می‌رسد حذف سلول‌های TI-Treg در خلال درمان ممکن است به‌طور بالقوه نتایج مثبتی را در انواع سرطان‌های جامد و مایع، بر اساس مکانیزم مشابه، به‌همـراه داشتـه باشـد؛ بنابراین، در مطـالعـه‌ی حاضـر با این
هدف برای اولین بار نوع جدیدی از این گیرنده در سلول‌های NK-92 به‌منظور هدف‌گیری آنتی‌ژن CD25 انسانی طراحی شد. مطالعه‌ی حاضر پیرامون رونوشت anti-CD25 CAR، با دیدگاه بیوانفورماتیکی و آزمایشگاهی نشان داد رونوشت این نوع CAR پایدار بود و در سطح بالایی بیان شد. درواقع، این نوع CAR در آینده می‌تواند به‌عنوان ابزاری برای برطرف‌کردن فرار سرطان از سیستم ایمنی در انواع سرطان‌های جامد و مایع بیشتر بررسی شود.
تشکر و قدردانی
این مقاله از پایان‌نامه‌ی دکترای تخصصی رشته‌ی زیست‌شناسی-ژنتیک مولکولی گرفته شده که آقای معین دهباشی آن را انجام داده است. پروپوزال مربوطه با شماره‌ی 8489 در معاونت پژوهشی دانشگاه اصفهان تصویب شده است. بدین‌وسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه اصفهان، ریاست محترم دانشکده‌ی علوم و فناوری‌های زیستی و ریاست محترم گروه سلولی و مولکولی و میکروبیولوژی به‌دلیل فراهم‌آوری امکانات و تجهیزات پژوهشی لازم کمال قدردانی و سپاس را داریم.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
ژنتیک
دریافت: 1398/11/5 | پذیرش: 1399/2/22 | انتشار: 1399/3/10
دریافت: 1398/11/5 | پذیرش: 1399/2/22 | انتشار: 1399/3/10
فهرست منابع
1. Kuwana Y, Asakura Y, Utsunomiya N, Nakanishi M, Arata Y, Itoh S, et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochem Biophys Res Commun 1987;149(3):960-8. PMID: 3122749 [DOI:10.1016/0006-291X(87)90502-X]
2. Cheng J, Li L, Liu Y, Wang Z, Zhu X, Bai X. Interleukin-1α induces immunosuppression by mesenchymal stem cells promoting the growth of prostate cancer cells. Mol Med Rep 2012;6(5):955-60. PMID: 22895682 [DOI:10.3892/mmr.2012.1019]
3. Lorenz R, Bernhart SH, Höner Zu Siederdissen C, Tafer H, Flamm C, Stadler PF, et al. ViennaRNA package 2.0. Algorithm Mol Biol 2011;6(1):26. PMID: 22115189 [DOI:10.1186/1748-7188-6-26]
4. Klages N, Zufferey R, Trono D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther 2000;2(2):170-6. PMID: 10947945 [DOI:10.1006/mthe.2000.0103]
5. Kutner RH, Zhang XY, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc 2009;4(4):495-505. PMID: 19300443 [DOI:10.1038/nprot.2009.22]
6. Savan R, Chan T, Young, HA. Lentiviral gene transduction in human and mouse NK cell lines. Methods Mol Biol 2010;612:209-21. PMID: 20033643 [DOI:10.1007/978-1-60761-362-6_14]
7. Yang ZZ, Novak AJ, Stenson MJ, Witzig TE, Ansell SM. Intratumoral CD4+ CD25+ regulatory T-cell-mediated suppression of infiltrating CD4+ T cells in B-cell non-Hodgkin lymphoma. Blood 2006;107(9):3639-46. PMID: 16403912 [DOI:10.1182/blood-2005-08-3376]
8. Leffers N, Gooden MJ, de Jong RA, Hoogeboom BN, ten Hoor KA, Hollema H, et al. Prognostic significance of tumor-infiltrating T-lymphocytes in primary and metastatic lesions of advanced stage ovarian cancer. Cancer Immunol Immunother 2009;58(3):449-59. PMID: 18791714 [DOI:10.1007/s00262-008-0583-5]
9. Tao H, Mimura Y, Aoe K, Kobayashi S, Yamamoto H, Matsuda E, et al. Prognostic potential of FOXP3 expression in non-small cell lung cancer cells combined with tumor-infiltrating regulatory T cells. Lung Cancer 2012;75(1):95-101. PMID: 21719142 [DOI:10.1016/j.lungcan.2011.06.002]
10. Sayour EJ, McLendon P, McLendon R, De Leon G, Reynolds R, Kresak J, et al. Increased proportion of FoxP3+ regulatory T cells in tumor infiltrating lymphocytes is associated with tumor recurrence and reduced survival in patients with glioblastoma. Cancer Immunol Immunother 2015;64(4):419-27. PMID: 25555571 [DOI:10.1007/s00262-014-1651-7]
11. Tang Y, Xu X, Guo S, Zhang C, Tang Y, Tian Y, et al. An increased abundance of tumor-infiltrating regulatory T cells is correlated with the progression and prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. PLoS One 2014;9(3):e91551. PMID: 24637664 [DOI:10.1371/journal.pone.0091551]
12. Bates GJ, Fox SB, Han C, Leek RD, Garcia JF, Harris AL, et al. Quantification of regulatory T cells enables the identification of high-risk breast cancer patients and those at risk of late relapse. J Clin Oncol 2006;24(34):5373-80. PMID: 17135638 [DOI:10.1200/JCO.2006.05.9584]
13. Gao Q, Qiu SJ, Fan J, Zhou J, Wang XY, Xiao YS, et al. Intratumoral balance of regulatory and cytotoxic T cells is associated with prognosis of hepatocellular carcinoma after resection. J Clin Oncol 2007;25(18):2586-93. PMID: 17577038 [DOI:10.1200/JCO.2006.09.4565]
14. Shah W, Yan X, Jing L, Zhou Y, Chen H, Wang Y. A reversed CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes and a high percentage of CD4(+)FOXP3(+) regulatory T cells are significantly associated with clinical outcome in squamous cell carcinoma of the cervix. Cell Mol Immunol 2011;8(1):59-66. PMID: 21200385 [DOI:10.1038/cmi.2010.56]
15. Liang YJ, Liu, HC, Su YX, Zhang TH, Chu M, Liang LZ, et al. Foxp3 expressed by tongue squamous cell carcinoma cells correlates with clinicopathologic features and overall survival in tongue squamous cell carcinoma patients. Oral Oncol 2011;47(7):566-70. PMID: 21641272 [DOI:10.1016/j.oraloncology.2011.04.017]
16. Mandal R, Şenbabaoğlu Y, Desrichard A, Havel JJ, Dalin MG, Riaz N, et al. The head and neck cancer immune landscape and its immunotherapeutic implications. JCI Insight 2016;1(17):e89829. PMID: 27777979 [DOI:10.1172/jci.insight.89829]
17. Lin YC, Mahalingam J, Chiang JM, Su PJ, Chu YY, Lai HY, et al. Activated but not resting regulatory T cells accumulated in tumor microenvironment and correlated with tumor progression in patients with colorectal cancer. Int J Cancer 2013;132(6):1341-50. PMID: 22907255 [DOI:10.1002/ijc.27784]
18. Zhou Q, Munger ME, Highfill SL, Tolar J, Weigel BJ, Riddle M, et al. Program death-1 signaling and regulatory T cells collaborate to resist the function of adoptively transferred cytotoxic T lymphocytes in advanced acute myeloid leukemia. Blood 2010;116(14):2484-93. PMID: 20570856 [DOI:10.1182/blood-2010-03-275446]
19. Weiss L, Melchardt T, Egle A, Grabmer C, Greil R, Tinhofer I. Regulatory T cells predict the time to initial treatment in early stage chronic lymphocytic leukemia. Cancer 2011;117(10):2163-9. PMID: 21523729 [DOI:10.1002/cncr.25752]
20. Duell J, Dittrich M, Bedke T, Mueller T, Eisele F, Rosenwald A, et al. Frequency of regulatory T cells determines the outcome of the T-cell-engaging antibody blinatumomab in patients with B-precursor ALL. Leukemia 2017;31(10):2181-90. PMID: 28119525 [DOI:10.1038/leu.2017.41]
21. Yokokawa J, Cereda V, Remondo C, Gulley JL, Arlen PM, Schlom J, et al. Enhanced functionality of CD4+ CD25highFoxP3+ regulatory T cells in the peripheral blood of patients with prostate cancer. Clin Cancer Res 2008;14(4):1032-40. Link [DOI:10.1158/1078-0432.CCR-07-2056]
22. Liu L, Yao J, Ding Q, Huang S. CD4+ CD25 high regulatory cells in peripheral blood of NSCLC patients. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 2006;26(5):548-51. PMID: 17219964 [DOI:10.1007/s11596-006-0516-5]
23. Kono K, Kawaida H, Takahashi A, Sugai H, Mimura K, Miyagawa N, et al. CD4(+)CD25 high regulatory T cells increase with tumor stage in patients with gastric and esophageal cancers. Cancer Immunol Immunother 2006;55(9):1064-71. PMID: 16328385 [DOI:10.1007/s00262-005-0092-8]
24. Lim KP, Chun NA, Ismail SM, Abraham MT, Yusoff MN, Zain RB, et al. CD4+CD25hiCD127low regulatory T cells are increased in oral squamous cell carcinoma patients. PLoS One 2014;9(8):e103975. PMID: 25153698 [DOI:10.1371/journal.pone.0103975]
25. Niedźwiecki M, Budziło O, Zieliński M, Adamkiewicz-Drożyńska E, Maciejka-Kembłowska L, Szczepański T, et al. CD4+CD25highCD127low/- FoxP3+ regulatory T cell subpopulations in the bone marrow and peripheral blood of children with ALL: brief report. J Immunol Res 2018;2018:1292404. PMID: 30003111 [DOI:10.1155/2018/1292404]
26. Okita R, Saeki T, Takashima S, Yamaguchi Y, Toge T. CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral blood of patients with breast cancer and non-small cell lung cancer. Oncol Rep 2005;14(5):1269-73. PMID: 16211295 [DOI:10.3892/or.14.5.1269]
27. Onizuka S, Tawara I, Shimizu J, Sakaguchi S, Fujita T, Nakayama E. Tumor rejection by in vivo administration of anti-CD25 (interleukin-2 receptor α) monoclonal antibody. Cancer Res 1999;59(13):3128-33. PMID: 10397255
28. Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S. Induction of tumor immunity by removing CD25+ CD4+ T cells: a common basis between tumor immunity and autoimmunity. J Immunol 1999;163(10):5211-8. PMID: 10553041
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
