جلد 18 -
جلد 18 - صفحات 0-0 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Ethics code: IR.IAU.VARAMIN.REC.1399.002
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Shahriary S, Tafvizi F, Khodarahmi P, Shaabanzadeh M. Cytotoxicity Effect of Artemisia deserti Aqueous Leaf Extract on Cisplatin-Resistant Ovarian Cancer Cell Line (A2780-CP). Qom Univ Med Sci J 2024; 18 : 913.3
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3768-fa.html
URL: http://journal.muq.ac.ir/article-1-3768-fa.html
شهریاری سپیده، تفویضی فرزانه، خدارحمی پروین، شعبان‌زاده مسعود. اثر سمیت سلولی عصاره آبی گیاه درمنه بیابانی بر سلول‌های سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP در شرایط آزمایشگاهی. مجله دانشگاه علوم پزشکی قم. 1403; 18 ()
سپیده شهریاری1 
، فرزانه تفویضی* 2، پروین خدارحمی1 ، مسعود شعبان‌زاده3
، فرزانه تفویضی* 2، پروین خدارحمی1 ، مسعود شعبان‌زاده3
1- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد پرند، دانشگاه آزاد اسلامی، پرند، ایران.
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد پرند، دانشگاه آزاد اسلامی، پرند، ایران. ،farzanehtafvizi54@gmail.com
3- گروه شیمی، دانشکده علوم پایه، واحد دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، دامغان، ایران.
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد پرند، دانشگاه آزاد اسلامی، پرند، ایران. ،
3- گروه شیمی، دانشکده علوم پایه، واحد دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، دامغان، ایران.
واژه‌های کلیدی: گیاه درمنه بیابانی، آپوپتوز، سرطان تخمدان، مقاومت به سیس‌پلاتین، سمیت سلولی، گونه‌های فعال اکسیژن
متن کامل [PDF 5421 kb]
(325 دریافت)
| چکیده (HTML) (622 مشاهده)
متن کامل: (237 مشاهده)
مقدمه
در سال‌های اخیر بسیاری از تحقیقات پزشکی و دارویی به‌دنبال راه حل مناسب و مقرون‌به‌صرفه برای تشخیص سریع، درمان به‌موقع و جلوگیری از پیشرفت انواع سرطان بوده‌اند [1]. مطابق آمار جهانی، بیماری سرطان دومین علت مرگ‌ومیر بعد از بیماری‌های قلبی و عروقی است. سرطان تخمدان دومین نوع سرطان شایع در بین زنان بالای 40 سال بعد از سرطان پستان خصوصاً در کشورهای توسعه‌یافته تلقی می‌شود [2]. در ایران، سرطان تخمدان هشتمین جایگاه مرگ‌ومیر را دارد [3]. درمان متداول سرطان تخمدان، برداشتن توده تومور به‌همراه شیمی‌درمانی است [2]. سیس‌پلاتین یک ترکیب غیرآلی و از مهم‌ترین داروهای انتخابی برای درمان سرطان در سه دهه اخیر به شمار می‌رود. این دارو بسیار شبیه به عوامل آلکیله‌کننده کلاسیک عمل می‌کند و درون رشته‌های DNA یک «ترکیب اضافی» تشکیل می‌دهد [4، 5]. تشخیص این ترکیبات اضافی توسط پروتئین‌های تشخیص‌دهنده آسیب، موجب ایجاد سیگنال‌های القای آپوپتوز خواهد شد [4، 6]. مقاومت به این دارو زمانی ایجاد می‌شود که عدم تنظیم ژن‌ها، میزان این ترکیبات اضافی تشکیل‌شده را کاهش دهند، یا میزان تشخیص این ترکیبات کاهش یابد و مانع بروز فرایند آپوپتوز شود. در عین حال، فراتنظیمی مسیرهای بقای سلول نیز ممکن است به افزایش میزان تکثیر سلولی منجر شود [7]. این امر موجب می‌شود تا بیماران در ابتدا واکنش مناسبی به شیمی‌درمانی مبتنی بر سیس‌پلاتین نشان دهند، ولی به مرور زمان بیماری آن‌ها به‌علت بروز مقاومت به سیس‌پلاتین به‌صورت اکتسابی یا ذاتی عود می‌کند [4]. ساختمان شیمیایی ترکیبات پلاتین در تصویر شماره 1 نشان داده شده است.
در دو دهه اخیر، تأثیر ضدسرطانی گیاهان متعددی موردمطالعه قرار گرفته است. گیاهان، دارای مواد فیتوشیمیایی متعددی با ویژگی آنتی‌اکسیدانی، ضدالتهابی و ضدتوموری هستند و بسیاری از عصاره‌های طبیعی گیاهان در مقایسه با ترکیبات شیمی‌درمانی یا هورمون‌درمانی، اثرات قابل‌توجهی علیه سلول‌های سرطانی دارند [8-10]. گیاهان دارویی بومی در طی سالیان همواره در درمان انواع بیماری‌ها، با تکیه بر تجربه طب سنتی مناطق مختلف، مورداستفاده قرار گرفته‌اند. این داروها در مقایسه با داروهای شیمیایی عوارض جانبی بسیار کمتری را به‌دنبال خواهند داشت [11-13]. اثرات ضدسرطانی ترکیبات گیاهی می‌تواند در قالب فعالیت ضدتکثیری، زمینه‌سازی فرایند آپوپتوز، خنثی‌کننده مقاومت دارویی و متعادل‌کننده سیستم ایمنی باشد [14]. مشخص شده که ترکیبات طبیعی گیاهان می‌توانند موجب القای آپوپتوز و آغازگر مسیرهای مرگ برنامه‌ریزی‌شده‌ای باشند که در سلول‌های سرطانی مسدود شده‌اند [15]. القای آپوپتوز یکی از مهم‌ترین نشانه‌های عوامل ضدتومور و کشنده سلول است [16].
گیاه آرتمیسیا از فراوان‌ترین جنس‌های رده آستراسه است و در طی قرن‌ها، در آسیا و آفریقا به‌خاطر خواص درمانی مورداستفاده قرار گرفته است که از آن جمله می‌توان به خصوصیات ضدمالاریایی، ضدباکتریایی، ضدقارچی، ضدالتهابی و ضدتوموری آن اشاره کرد. از ترکیبات موجود در این جنس می‌توان به انواع مونوترپن‌ها، سسکوئی‌ترپن‌ها، سسکوئی‌ترپن لاکتون‌ها و فلاوونوئیدها اشاره کرد. در ایران این جنس دارای 30 گونه است که دو تا از آن‌ها جزء گونه‌های آندمیک ایران به حساب می‌آیند. آرتمیسینین، یکی از ترکیبات مؤثر این گیاه و از انواع طبیعی سسکوئی‌ترپن‌ها به شمار می‌رود [17]. این ماده فعالیت چشم‌گیری علیه رده‌های سلولی سرطانی متفاوت از خود نشان می‌دهد [18-20]. این گیاه با تنوع بسیار بالا، یکی از داروهای گیاهی مورداستفاده در طب سنتی ایران است [21]. در این تحقیق، گیاه درمنه بیابانی (آرتمیسیا دیزرتی) با توجه به مقدار قابل‌توجه ماده مؤثر آرتمیسینین در آن، انتخاب شده است [17].
هدف از این مطالعه، بررسی القای سمیت سلولی و آپوپتوز در سلول‌های سرطانی تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین پس از تیمار با عصاره آبی گیاه درمنه بیابانی در شرایط «در شیشه» بود.
مواد و روش‌ها
تهیه عصاره گیاه
برگ خشک‌شده گیاه درمنه بیابانی از بانک گیاهی مرکز ذخایر زیستی ایران با کد هرباریوم IBRC P1006506 خریداری شد. مقدار 30 گرم از آن به‌کمک آسیاب برقی کاملاً پودر شده و در 300 میلی‌لیتر آب دیونیزه در دمای 80-90 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 دقیقه حرارت داده شد. محلول تهیه‌شده به‌مدت 5 ثانیه ورتکس و سپس به‌کمک کاغذ صافی واتمن شماره 1 فیلتر شد و برای مصارف بعدی در ظرف در پیچ‌دار شیشه‌ای در دمای 4 درجه سانتی‌گراد یخچال نگهداری شد.
کشت سلول
رده سلولی سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین (A2780-CP) از بانک ذخایر سلولی انستیتو پاستور ایران تهیه شد. جهت بررسی خصوصیات ضدسرطانی و اثر سلول‌کشی عصاره تهیه‌شده به روش فوق از گیاه درمنه بیابانی، ابتدا رده سلولی انتخابی به‌مدت 24 ساعت در فلاسک‌های مخصوص حاوی محیط کشت سرم جنین گاوی 10 درصد، RPMI و پن/استرپ یک درصد در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با اتمسفر دی‌اکسیدکربن 5 درصد کشت داده شد. با مشاهده وضعیت مناسب رشد سلول‌ها، حدود 100 میکرولیتر از محیط کشت حاوی مقدار تقریبی 104 سلول به هر چاهک انتقال داده شد. پس از افزودن 100 میکرولیتر محیط کشت تازه، سلول‌ها مجدداً به‌مدت 24 ساعت دیگر در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و دی‌اکسیدکربن 5 درصد انکوبه شدند. این سلول‌ها با مشاهده وضعیت مناسب رشد، به‌منظور تیمار با عصاره گیاه درمنه بیابانی و سیس‌پلاتین در مراحل بعدی مورداستفاده قرار گرفتند [22].
بررسی اثر سمیت سلولی عصاره و آزمون MTT
جهت بررسی خصوصیات ضدتکثیری و ضدسرطانی عصاره آبی تهیه‌شده از گیاه درمنه بیابانی، ابتدا به روش رقیق‌سازی متوالی، غلظت‌های 100، 50، 25، 5/12 و 25/6 میکروگرم در میلی‌لیتر از عصاره آبی آماده‌سازی شد. به‌منظور مقایسه تأثیر داروی سیس‌پلاتین نیز به همین ترتیب با روش رقیق‌سازی، غلظت‌های 100، 50، 25، 5/12 و 25/6 میکروگرم در میلی‌لیتر از پودر Cisplatin - CAS 15663-27-1 – Calbiochem (شرکت سیگما، آلدریچ) تهیه شد. سپس مقدار 100 میکرولیتر از غلظت‌های فوق به‌صورت سه‌تایی (سه تکرار) به چاهک‌های پلیت 96خانه‌ای حاوی حدود 104سلول افزوده شد. بعد از سپری شدن 24 ساعت، خصوصیت سلول‌کشی ترکیبات مذکور، یا به عبارتی دیگر، درصد زیستایی یا بقای سلول‌ها متعاقب تیمار با ترکیبات موردمطالعه، به‌کمک آزمون MTT بررسی شد.
به‌منظور انجام آزمون MTT، بعد از 24 ساعت تیمار سلول‌ها با مواد و غلظت‌های موردنظر، محلول 5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر MTT (سینا کلون) در بافر فسفات سالین تهیه و به هر چاهک مقدار 20 میکرولیتر از محلول MTT افزوده شد. میکروپلیت‌ها به‌مدت 5 دقیقه روی شیکر با سرعت 150 دور در دقیقه قرار داده شدند و سپس برای 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با اتمسفر دی‌اکسیدکربن 5 درصد انکوبه شدند. در مرحله بعد، محلول رویی تخلیه شد و مقدار 200 میکرولیتر محلول دی‌متیل سولفوکسید (شرکت سیگما، آلدریچ) به تمامی چاهک‌ها افزوده شد و درنهایت جذب نوری چاهک‌ها در دستگاه خوانشگر الایزا (Stat Fax 4700 ، ساخت آمریکا) در طول موج 570 نانومتر خوانده شد [23]. درآخر، «نیمه حداکثر غلظت بازدارندگی» به کمک نرم‌افزار GraphPad Prism، نسخه 1/0/8 محاسبه شد.
تغییر مقدار گونه‌های فعال اکسیژن درون‌سلولی
به‌منظور اندازه‌گیری نیمه کمی مقدار ROS درون‌سلولی تولیدشده تحت تأثیر تیمار با مواد موردمطالعه، از آزمایش دی‌کلروفلورسئین مطابق با دستورالعمل کیت 2َ-7َ-دی‌کلرو دی‌هیدروفلورسئین دی‌استات (شرکت روشه، آلمان) استفاده شد [24، 25]. به این ترتیب که ابتدا مقدار حدود 104 سلول A2780-CP در میکروپلیت 96خانه‌ای به‌مدت 24 ساعت در حجم 200 میکرولیتر، در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و دی‌اکسیدکربن 5 درصد کشت داده شد. سپس میکروپلیت‌ها از محیط کشت تخلیه شده و سلول‌ها با 100 میکرولیتر غلظت IC50 عصاره آبی برگ گیاه درمنه بیابانی و همچنین داروی سیس‌پلاتین به‌مدت 24 ساعت تیمار شدند. در مرحله بعد، محلول رویی میکروپلیت‌ها تخلیه و سلول‌ها تحت تأثیر محلول 10 میکرومولار دی‌کلروفلوئورسئین دی‌استات تهیه‌شده در محیط کشت قرار گرفتند. این سلول‌ها به‌مدت 30 دقیقه در شرایط تاریکی در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و دی‌اکسیدکربن 5 درصد انکوبه شدند و در آخر، شدت فلورسانس میکروپلیت‌ها با دستگاه خوانشگر فلورسانس (Fluorskan Ascent FL Thermo Fisher) اندازه‌گیری شد. فرمول شماره 1 جهت اندازه‌گیری مقدار درصد ROS تولیدشده در سلول‌های تیمارشده در مقایسه با سلول‌های تیمارنشده (کنترل) استفاده شد [25].
.1
% DCFDA Fluorescence=(Abs test cells/Abs Control cells)
بررسی القای آپوپتوز
وقوع آپوپتوز با استفاده از کیت Annexin V-FITC (شرکت روشه، آلمان) بررسی شد. برای این منظور، میزان القای آپوپتوز در سلول‌های مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP تیمارشده با غلظت IC50 عصاره آبی تهیه‌شده از گیاه درمنه بیابانی و سیس‌پلاتین، مطابق با دستورالعمل کیت با دستگاه فلوسایتومتری (BD FACscan) بررسی شد [26]. تیمار با غلظت IC50 عصاره گیاه درمنه بیابانی و سیس‌پلاتین بر روی تعداد حدود 105سلول مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP انجام گرفت. سلول‌های تیمارنشده A2780-CP به‌عنوان سلول کنترل مورداستفاده قرار گرفتند. همچنین تیمار سلول‌های سالم فیبروبلاست‌های پوست ختنه‌گاه انسان نیز جهت امکان مقایسه تأثیر ترکیبات موردمطالعه، در کنار رده سلولی A2780-CP انجام شد. بعد از گذشت 24 ساعت، نسبت وقوع آپوپتوز به نکروز در سلول‌ها توسط دستگاه فلوسایتومتری (BD FACscan) موردمطالعه قرار گرفت.
بررسی تغییرات چرخه رشد سلول
بررسی چرخه سلولی، به‌کمک روش فلوسایتومتری و رنگ‌آمیزی پروپیدیوم یوداید DNA انجام شد. به این منظور، وقتی تراکم سلول‌ها به میزان حدود 106 رسید با غلظت IC50 عصاره گیاه و سیس‌پلاتین تهیه‌شده مطابق توضیحات پیشین به‌مدت 24 ساعت تیمار شدند و جهت رنگ‌آمیزی با رنگ PI مورداستفاده قرار گرفتند. به این منظور، سلول‌ها ابتدا با محلول PBS دوبار به‌مدت 5 دقیقه (سرعت سانتریفوژ 1200 دور بر دقیقه) شست‌وشو داده شدند. رسوب سلولی با افزودن 4 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد سردشده با یخ فیکس شد. بعد از یک ساعت نگهداری، سلول‌ها دوبار دیگر با محلول PBS شست‌وشو داده شدند و رسوب سلولی با 500 میکرولیتر محلول رنگ PI و 25 میکرولیتر محلول RNase-A به‌مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد و سپس با دستگاه فلوسایتومتری (BD FACscan) موردبررسی قرار گرفت [27].
بررسی بیان ژن‌های مرتبط با آپوپتوز به روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس
حدود 105×2 سلول مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP با غلظت IC50 عصاره گیاه درمنه بیابانی و داروی سیس‌پلاتین به‌مدت 24 ساعت تیمار شدند. استخراج RNA سلول‌های مذکور و ساخت cDNA با استفاده از کیت (سیناژن) و مطابق با دستورالعمل آن انجام شد. پرایمر ژن‌های موردمطالعه شامل ژن‌های آپوپتوتیک CASP3 و CASP9 و BAX و BCL2 و ژن‌های مرتبط با چرخه رشد سلول CCND1 ،CCNB1 و P21 و همچنین ژن مرتبط با فرایند فروپتوز (TFRC) جهت بررسی تغییر میزان بیان گیرنده ترانسفرین موردبررسی قرار گرفت [28، 29].
ژن ACTB به‌عنوان ژن رفرنس مورداستفاده قرار گرفت. جهت آشکار‌سازی شدت فلورسانس از رنگ سایبرگرین (Amplicon) استفاده شد. واکنش PCR با یک میکرولیتر cDNA و 5/0 میکرولیتر پرایمر به غلظت 10 میلی‌مولار، با محلول مسترمیکس (شرکت Bioneer) در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام گرفت. تنظیم برنامه حرارتی به‌ترتیب با 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه، 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 15 ثانیه و 5/55-62 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه در دستگاه ترمو سایکلر (Exicycler) انجام شد [30]. درنهایت، نسبت مقدار بیان ژن‌های مذکور در رده سلولی موردمطالعه (سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP) در مقایسه با سلول‌های تیمارنشده A2780-CP به‌کمک نرم‌افزار GraphPad Prism نسخه 8.0.1 محاسبه شد.
آنالیز آماری
به‌منظور ارزیابی و تحلیل داده‌ها در این مطالعه از نرم‌افزارGraphPad Prism نسخه 8.0.1 استفاده شد. مقدار بیان نسبی ژن‌های انتخابی در رده سلولی موردمطالعه سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین (A2780-CP) در مقایسه با سلول‌های تیمارنشده A2780-CP براساس فرمول 2-∆∆Ct به کمک نرم‌افزار محاسبه شد. بررسی تفاوت آماری بین گروه‌ها با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه و آزمون تعقیبی توکی انجام شد. داده‌ها به‌صورت میانگین±انحراف‌معیار با سطح معنی‌داری 05/0P< ارائه شد. تمام مراحل در سه تکرار جداگانه انجام گرفت.
یافته‌ها
بررسی سمیت سلولی غلظت‌های مختلف عصاره برگ گیاه درمنه بیابانی بر روی رده سلولی A2780-CP
نتایج تیمار رده سلولی موردمطالعه A2780-CP با غلظت‌های مختلف عصاره برگ گیاه درمنه بیابانی، همان‌طور که در تصویر شماره 2 به نمایش درآمده، تأثیر سمیت سلولی وابسته به دُز عصاره را به‌وضوح نشان می‌دهد. در غلظت‌های 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر کاهش معنی‌داری در درصد زیستایی سلول‌های سرطانی مقاوم به سیس‌پلاتین دیده شد (001/0P<؛ 01/0P<؛ 05/0P<). تأثیر عصاره بر روی سلول‌های نرمال HFF بسیار ناچیز بود و تنها در بالاترین غلظت یعنی 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر در حدود 80 درصد زیستایی دیده شد (05/0P<). در بقیه غلظت‌ها، کاهش معنی‌داری در زیستایی سلول‌ها دیده نشد و اثر سمیت سلولی قابل‌توجهی در سلول‌های نرمال نداشت که از مزایای اثرات عصاره گیاهی به شمار می‌رود. درحالی‌که داروی سیس‌پلاتین اثر سمیت قابل‌توجهی در تمامی دُزهای به‌کاررفته نشان داد (001/0P<) (تصویر شماره 3). همچنین نتایج آزمون MTT پس از تیمار سلول‌های A2780-CP و سلول‌های سالم HFF با عصاره گیاه درمنه بیابانی و سیس‌پلاتین در مقابل گروه کنترل مطابق با توضیحات پیشین و محاسبه غلظت IC50، به‌ترتیب نشان داد عصاره آبی برگ گیاه درمنه بیابانی با غلظت 62/112 میکروگرم در میلی‌لیتر توانایی کشتن 50 درصد جمعیت سلول‌های مقاوم به سیس‌پلاتین را دارد، درحالی‌که غلظت 30/412 میکروگرم در میلی‌لیتر از این عصاره برای وقوع همین مقدار درصد بقا در سلول‌های سالم HFF موردنیاز است. همچنین درمورد داروی شیمیایی سیس‌پلاتین غلظت IC50 به مقدار 89/88 میکروگرم در میلی‌لیتر برای رده سلولی A2780-CP و به مقدار 28/26 میکروگرم در میلی‌لیتر برای سلول‌های سالم HFF محاسبه شد.
تغییر مقدار ROS درون‌سلولی
افزایش مقدار ROS درون‌سلولی بیش از حد فیزیولوژیک می‌تواند موجب ایجاد آسیب‌دیدگی پروتئین‌ها، لیپیدها، غشاها و اندامک‌های درون‌سلولی شود که تجمع این آسیب‌ها درنهایت به القای فرایند آپوپتوز منجر می‌شود [31]. چنانچه در تصویر شماره 4 مشخص است، افزایش ROS داخل‌سلولی در رده سلولی موردمطالعه پس از تیمار با عصاره به‌طور معنی‌داری در مقایسه با نمونه کنترل افزایش یافته است (05/0P<).
نتایج بررسی وقوع آپوپتوز در سلول‌های A2780-CP متعاقب تیمار با عصاره آبی برگ گیاه درمنه بیابانی
نتایج بررسی میزان وقوع آپوپتوز و نکروز در رده سلولی موردمطالعه با استفاده از روش رنگ‌آمیزی انکسین/یدید پروپیدیوم در تصویر شماره 5 نشان داده شده است. همان‌طور که مشخص است، درصد سلول‌های A2780-CP تیمارشده با عصاره گیاه درمنه بیابانی که در مراحل اولیه آپوپتوز هستند (Q3=48/8 درصد) در مقایسه با سلول‌های کنترل به‌طور معنی‌داری افزایش یافته است (05/0P<)، ولی درصد وقوع نکروز در سلول‌هایی که در مراحل انتهایی آپوپتوز هستند در این دو گروه تفاوت معنی‌داری نشان نداده است.
بررسی تأثیر عصاره گیاه درمنه بیابانی بر چرخه رشد رده سلولی A2780-CP
نتایج به‌دست‌آمده از بررسی چرخه سلول متعاقب رنگ‌آمیزی هسته سلول‌های تیمارشده با غلظت IC50 عصاره گیاه درمنه بیابانی مطابق تصویر شماره 6 نشان از وقوع آپوپتوز در این سلول‌ها دارد و چنانچه مشخص است، افزایش جمعیت سلولی معنی‌داری (حدود 10 درصد) در مقایسه با سلول‌های تیمارنشده کنترل، در موقعیت Sub G1 مشاهده می‌شود (تصویر شماره 6B) (05/0P<).
تأثیر عصاره گیاه درمنه بیابانی در بیان ژن‌های منتخب آپوپتوز و چرخه سلول
چنانچه اشاره شد، پس از تیمار رده سلولی A2780-CP با غلظت IC50 عصاره گیاه درمنه بیابانی که مقدار آن 62/112 میکروگرم در میلی‌لیتر محاسبه شد، بیان ژن‌های هدف با روشqRT- PCR بررسی شد. همان‌طور که در تصویر شماره 7 مشخص است افزایش بیان ژن‌های BAX ،CASP3 ،CASP9 ،P21 ،TFRC و کاهش بیان ژن‌های CCND1 و CCNB1 نسبت به گروه کنترل معنی‌دار بود (05/0P<)، ولی کاهش بیان ژن‌های BCL2 معنی‌دار نبود.
بحث
ترکیبات به‌دست‌آمده از طیف‌سنجی جرمی کروماتوگرافی گازی عصاره برگ گیاه درمنه بیابانی در مطالعات قبلی گزارش شده است. در بین آن‌ها کافور و 1 و 8 بتا-سینئول به چشم می‌خورند که در گروه مونوترپن‌ها و بتاهیومولین هستند که در گروه سسکوئی‌ترپن‌ها دسته‌بندی می‌شوند [31]. در عین حال چنانچه در نتایج حاصل از تست‌های بررسی القای آپوپتوز و ژن‌های مرتبط با چرخه رشد سلول متعاقب تیمار رده سلولی سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP با غلظت IC50 عصاره آبی برگ گیاه درمنه بیابانی مشخص شده است، جمعیت سلولی قابل‌توجهی در ناحیه Sub G1 در مقایسه با منحنی کنترل به چشم می‌خورد که دلالت بر وقوع آپوپتوز در سلول‌های تیمارشده و توقف چرخه سلولی دارد. افزایش بیان معنی‌دار ژن‌های پروآپوپتوتیک BAX ،P21 و CASP3 و همچنین کاهش معنی‌دار بیان ژنCCNB1 با وقوع آپوپتوز و نتایج چرخه رشد سلول مطابقت دارد. علت یافته‌های مذکور می‌تواند وجود ترکیبات گزارش‌شده ترپنی و آرتمیسینین در عصاره گیاه درمنه بیابانی باشد [19، 32]. ترپنوئیدها بزرگ‌ترین و متنوع‌ترین ترکیبات گیاهی طبیعی هستند. این دسته مسئول تولید رایحه، طعم و رنگدانه‌های گیاهی هستند [33]. طبقه‌بندی آن‌ها براساس تعداد کربن‌هایی است که به‌واسطه واحد‌های ایزوپرن موجود در آن‌ها تشکیل می‌شود. واحد‌های ایزوپرن از اجزای سازنده ترپنوئیدها هستند که هیدروکربن‌های گازی با فرمول‌های مولکولی C5H8 هستند. ترپنوئیدها با مکانیسم‌های متفاوت مولکولی موجب القای تأثیر ضدسرطانی می‌شوند. گروه ترپن‌ها با خصوصیات آنتی‌اکسیدانی خود کاملاًً شناخته‌شده هستند [34-36]. این خصوصیات به‌علت ظرفیت احیاکنندگی این ترکیبات و از علل اصلی کاربرد آن‌ها در حیطه داروهای گیاهی است [34، 36، 37].
به‌طور مثال، تیمول با توقف چرخه سلول در مرحله G0/G1 و دپلاریزه شدن میتوکندری‌ها موجب توقف رشد رده سلولی سرطان حاد پرومیلوسیتی (HL-60) می‌شود. تأثیر کشندگی تیمول با تولید ROS و تخریب غشای میتوکندریایی به‌دنبال آن است. تیمول همچنین می‌تواند باعت افزایش بیان پروتئین BAX و کاهش بیان پروتئین BCL2 شود که متعاقباً به فعال‌سازی کاسپازها و آپوپتوز منجر می‌شود [38].
بتاهیومولین از دیگر ترکیبات گزارش‌شده در این مطالعه بود که در گروه سسکوئی‌ترپن‌ها قرار می‌گیرد [39]. در تأیید تأثیر سلول‌کشی این گروه از ترکیبات آلی می‌توان به مطالعه جیانگ و همکاران اشاره کرد [40]. آن‌ها تأثیر ترکیب مشابهی از گروه سسکوئی‌ترپن‌ها به‌نام بتا-المین را بر روی رده سلولی «سرطان سلول غیرکوچک ریه» انسانی H460 و A549 بررسی کردند. یافته‌های ایشان حاکی از توقف چرخه سلول در مراحل G2/M و S بود. درواقع، مکانیسم مولکولی ضدسرطانی این ماده با کاهش بیان ژن cyclin B1 که موجب کاهش کمپلکس Cdk1 Cyclin B/ و در پی آن توقف چرخه سلول در مرحله G2/M می‌شود گزارش شده است [40].
وانگ و همکاران تأثیر ضدسرطانی آرتسونیت را که در گروه سسکوئی‌ترپن لاکتون‌ها قرار دارد بر روی رده سلولی سرطان کبد H22 گزارش کردند. طبق یافته ایشان، مکانیسم اثر این ماده از طریق تنظیم کاهشی بیان ژن PCNA و BCL2 و تنظیم افزایشی ژن BAX است [41].
ویلوگبای و همکاران در مطالعه خود نشان دادند آرتمیسینین می‌تواند موجب توقف پیشرفت چرخه رشد سلولی سرطان پروستات شود. این امر به‌واسطه ممانعت از بیان ژن CDK4 صورت می‌گیرد [42]. شافی و همکاران در مطالعه‌ای به تأثیر ضدتکثیر عصاره آرتمیسیا آبسینتوم بر سلول‌های سرطانی پستان MCF-7 اشاره کرده و علت آن را محتمل با ایجاد اختلال توسط این عصاره در عملکرد پروتئین Bcl2 دانسته‌اند [43].
سسکوئی‌ترپن لاکتون‌ها گروه دیگری از انواع ترپنوئیدها هستند. آرتسونیت، از دیگر انواع سسکوئی‌ترپن لاکتون‌ها و مشتقی دیگر از گیاه آرتمیسیا، یک داروی ضدمالاریای قوی به شمار می‌رود [44]. آرتسونیت همچنین از طریق پایین آوردن سطح گلوتاتیون و افزایش میزان ROS لیپیدی موجب القای فروپتوز می‌شود [45].
کیم و همکاران نیز جزئی به‌نام LAC117 را از عصاره اتانولی برگ گیاه آرتمیسیا کاپیلاریس جداسازی کرده و تأثیر آن را بر رده‌های سلولی HepG2 و Huh7 کارسینوم کبد مطالعه کردند. نتایج آن‌ها نشان داد این ترکیب با القای آپوپتوز از طریق بالا بردن سطح سیتوکروم C و هیدرولیز پروتئین‌های Caspase3 و پلی (ADP-ریبوز) پلیمراز موجب توقف رشد و تکثیر سلول‌های مذکور می‌شود. همچنین طبق گزارش آن‌ها ماده LAC117 موجب بازدارنگی مسیر PI3K/AKT نیز می‌شود [46].
سو و همکاران تأثیر عصاره برگ آرتمیسیا آرگیی را بر روی رده سلولی سرطان ریه CL1-0 و همچنین رده سلولی مقاوم‌شده آن در برابر داروی جمسیتابین CL1-0-GR بررسی کردند. پیشینه تاریخی کاربرد این گیاه طی دهه‌ها در چین، ژاپن و کره به‌عنوان دارویی جهت درمان بیماری‌های حاد کبدی و کلیوی، آسم، بی‌نظمی عادت ماهیانه، بیماری‌های التهابی، سینوزیت و همچنین سرطان، این محققین را بر آن داشت تا سازوکار مولکولی ضدتوموری این ماده را بررسی کنند. این عصاره باعث بازدارندگی رشد، تجمع، تغییر اپی‌تلیال به مزانشیم و متاستاز هر دو رده سلولی شد. القای آپوپتوز و توقف سیگنال AKT/MAPK در کنار دیگر موارد ذکرشده، این عصاره را انتخاب مناسبی برای توقف تکثیر سلول‌های سرطان ریه معرفی کرده است [47].
رشمه‌زاد و همکاران نیز در مطالعه خود با روشی مشابه، با استفاده از نمک نیترات نقره و گیاه اکالیپتوس اقدام به تهیه نانوذرات نقره کردند و تأثیر وابسته به دُز ترکیب حاصل را بر روی رده سلولی سرطان معده AGS گزارش نمودند [48].
نتیجه‌گیری
با توجه به یافته‌های این مطالعه چنین به نظر می‌آید که ترکیبات ترپنوئیدی موجود در عصاره آبی برگ گیاه درمنه بیابانی با خاصیت القای آپوپتوز می‌تواند بر رده سلولی سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین در شرایط آزمایشگاهی اثر کشندگی وابسته به دُز معنی‌داری داشته باشد.
امید است با بررسی تأثیر این عصاره در مطالعات آتی بر روی حیوانات آزمایشگاهی (در محیط زنده) و دیگر انواع مطالعات بالینی بتوان از قابلیت بالقوه سلول‌کشی عصاره برگ گیاه درمنه بیابانی در کنترل رشد سلول‌های سرطانی مقاوم به سیس‌پلاتین به‌عنوان یک پتانسیل نویدبخش در درمان مواردی از سرطان تخمدان که به داروی سیس‌پلاتین مقاومت نشان می‌دهند، بهره‌مند شد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه منطبق با اصول اخلاقی با کد IR.IAU.VARAMIN.REC.1399.002 است.
حامی مالی
این مطالعه هیچ‌گونه حمایت مالی از نهادهای دولتی و غیردولتی دریافت نکرده است.
مشارکت نویسندگان
اجرای مراحل عملی مطالعه، کشت سلول و نوشتار متن: سپیده شهریاری؛ طراحی مطالعه و تحلیل داده‌ها: پروین خدارحمی، مسعود شعبان‌زاده و فرزانه تفویضی؛ ویرایش متن: فرزانه تفویضی.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
از مجموعه آزمایشگاهی دانشگاه آزاد اسلامی واحد پرند قدردانی می‌شود.
در سال‌های اخیر بسیاری از تحقیقات پزشکی و دارویی به‌دنبال راه حل مناسب و مقرون‌به‌صرفه برای تشخیص سریع، درمان به‌موقع و جلوگیری از پیشرفت انواع سرطان بوده‌اند [1]. مطابق آمار جهانی، بیماری سرطان دومین علت مرگ‌ومیر بعد از بیماری‌های قلبی و عروقی است. سرطان تخمدان دومین نوع سرطان شایع در بین زنان بالای 40 سال بعد از سرطان پستان خصوصاً در کشورهای توسعه‌یافته تلقی می‌شود [2]. در ایران، سرطان تخمدان هشتمین جایگاه مرگ‌ومیر را دارد [3]. درمان متداول سرطان تخمدان، برداشتن توده تومور به‌همراه شیمی‌درمانی است [2]. سیس‌پلاتین یک ترکیب غیرآلی و از مهم‌ترین داروهای انتخابی برای درمان سرطان در سه دهه اخیر به شمار می‌رود. این دارو بسیار شبیه به عوامل آلکیله‌کننده کلاسیک عمل می‌کند و درون رشته‌های DNA یک «ترکیب اضافی» تشکیل می‌دهد [4، 5]. تشخیص این ترکیبات اضافی توسط پروتئین‌های تشخیص‌دهنده آسیب، موجب ایجاد سیگنال‌های القای آپوپتوز خواهد شد [4، 6]. مقاومت به این دارو زمانی ایجاد می‌شود که عدم تنظیم ژن‌ها، میزان این ترکیبات اضافی تشکیل‌شده را کاهش دهند، یا میزان تشخیص این ترکیبات کاهش یابد و مانع بروز فرایند آپوپتوز شود. در عین حال، فراتنظیمی مسیرهای بقای سلول نیز ممکن است به افزایش میزان تکثیر سلولی منجر شود [7]. این امر موجب می‌شود تا بیماران در ابتدا واکنش مناسبی به شیمی‌درمانی مبتنی بر سیس‌پلاتین نشان دهند، ولی به مرور زمان بیماری آن‌ها به‌علت بروز مقاومت به سیس‌پلاتین به‌صورت اکتسابی یا ذاتی عود می‌کند [4]. ساختمان شیمیایی ترکیبات پلاتین در تصویر شماره 1 نشان داده شده است.
در دو دهه اخیر، تأثیر ضدسرطانی گیاهان متعددی موردمطالعه قرار گرفته است. گیاهان، دارای مواد فیتوشیمیایی متعددی با ویژگی آنتی‌اکسیدانی، ضدالتهابی و ضدتوموری هستند و بسیاری از عصاره‌های طبیعی گیاهان در مقایسه با ترکیبات شیمی‌درمانی یا هورمون‌درمانی، اثرات قابل‌توجهی علیه سلول‌های سرطانی دارند [8-10]. گیاهان دارویی بومی در طی سالیان همواره در درمان انواع بیماری‌ها، با تکیه بر تجربه طب سنتی مناطق مختلف، مورداستفاده قرار گرفته‌اند. این داروها در مقایسه با داروهای شیمیایی عوارض جانبی بسیار کمتری را به‌دنبال خواهند داشت [11-13]. اثرات ضدسرطانی ترکیبات گیاهی می‌تواند در قالب فعالیت ضدتکثیری، زمینه‌سازی فرایند آپوپتوز، خنثی‌کننده مقاومت دارویی و متعادل‌کننده سیستم ایمنی باشد [14]. مشخص شده که ترکیبات طبیعی گیاهان می‌توانند موجب القای آپوپتوز و آغازگر مسیرهای مرگ برنامه‌ریزی‌شده‌ای باشند که در سلول‌های سرطانی مسدود شده‌اند [15]. القای آپوپتوز یکی از مهم‌ترین نشانه‌های عوامل ضدتومور و کشنده سلول است [16].
گیاه آرتمیسیا از فراوان‌ترین جنس‌های رده آستراسه است و در طی قرن‌ها، در آسیا و آفریقا به‌خاطر خواص درمانی مورداستفاده قرار گرفته است که از آن جمله می‌توان به خصوصیات ضدمالاریایی، ضدباکتریایی، ضدقارچی، ضدالتهابی و ضدتوموری آن اشاره کرد. از ترکیبات موجود در این جنس می‌توان به انواع مونوترپن‌ها، سسکوئی‌ترپن‌ها، سسکوئی‌ترپن لاکتون‌ها و فلاوونوئیدها اشاره کرد. در ایران این جنس دارای 30 گونه است که دو تا از آن‌ها جزء گونه‌های آندمیک ایران به حساب می‌آیند. آرتمیسینین، یکی از ترکیبات مؤثر این گیاه و از انواع طبیعی سسکوئی‌ترپن‌ها به شمار می‌رود [17]. این ماده فعالیت چشم‌گیری علیه رده‌های سلولی سرطانی متفاوت از خود نشان می‌دهد [18-20]. این گیاه با تنوع بسیار بالا، یکی از داروهای گیاهی مورداستفاده در طب سنتی ایران است [21]. در این تحقیق، گیاه درمنه بیابانی (آرتمیسیا دیزرتی) با توجه به مقدار قابل‌توجه ماده مؤثر آرتمیسینین در آن، انتخاب شده است [17].
هدف از این مطالعه، بررسی القای سمیت سلولی و آپوپتوز در سلول‌های سرطانی تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین پس از تیمار با عصاره آبی گیاه درمنه بیابانی در شرایط «در شیشه» بود.
مواد و روش‌ها
تهیه عصاره گیاه
برگ خشک‌شده گیاه درمنه بیابانی از بانک گیاهی مرکز ذخایر زیستی ایران با کد هرباریوم IBRC P1006506 خریداری شد. مقدار 30 گرم از آن به‌کمک آسیاب برقی کاملاً پودر شده و در 300 میلی‌لیتر آب دیونیزه در دمای 80-90 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 دقیقه حرارت داده شد. محلول تهیه‌شده به‌مدت 5 ثانیه ورتکس و سپس به‌کمک کاغذ صافی واتمن شماره 1 فیلتر شد و برای مصارف بعدی در ظرف در پیچ‌دار شیشه‌ای در دمای 4 درجه سانتی‌گراد یخچال نگهداری شد.
کشت سلول
رده سلولی سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین (A2780-CP) از بانک ذخایر سلولی انستیتو پاستور ایران تهیه شد. جهت بررسی خصوصیات ضدسرطانی و اثر سلول‌کشی عصاره تهیه‌شده به روش فوق از گیاه درمنه بیابانی، ابتدا رده سلولی انتخابی به‌مدت 24 ساعت در فلاسک‌های مخصوص حاوی محیط کشت سرم جنین گاوی 10 درصد، RPMI و پن/استرپ یک درصد در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با اتمسفر دی‌اکسیدکربن 5 درصد کشت داده شد. با مشاهده وضعیت مناسب رشد سلول‌ها، حدود 100 میکرولیتر از محیط کشت حاوی مقدار تقریبی 104 سلول به هر چاهک انتقال داده شد. پس از افزودن 100 میکرولیتر محیط کشت تازه، سلول‌ها مجدداً به‌مدت 24 ساعت دیگر در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و دی‌اکسیدکربن 5 درصد انکوبه شدند. این سلول‌ها با مشاهده وضعیت مناسب رشد، به‌منظور تیمار با عصاره گیاه درمنه بیابانی و سیس‌پلاتین در مراحل بعدی مورداستفاده قرار گرفتند [22].
بررسی اثر سمیت سلولی عصاره و آزمون MTT
جهت بررسی خصوصیات ضدتکثیری و ضدسرطانی عصاره آبی تهیه‌شده از گیاه درمنه بیابانی، ابتدا به روش رقیق‌سازی متوالی، غلظت‌های 100، 50، 25، 5/12 و 25/6 میکروگرم در میلی‌لیتر از عصاره آبی آماده‌سازی شد. به‌منظور مقایسه تأثیر داروی سیس‌پلاتین نیز به همین ترتیب با روش رقیق‌سازی، غلظت‌های 100، 50، 25، 5/12 و 25/6 میکروگرم در میلی‌لیتر از پودر Cisplatin - CAS 15663-27-1 – Calbiochem (شرکت سیگما، آلدریچ) تهیه شد. سپس مقدار 100 میکرولیتر از غلظت‌های فوق به‌صورت سه‌تایی (سه تکرار) به چاهک‌های پلیت 96خانه‌ای حاوی حدود 104سلول افزوده شد. بعد از سپری شدن 24 ساعت، خصوصیت سلول‌کشی ترکیبات مذکور، یا به عبارتی دیگر، درصد زیستایی یا بقای سلول‌ها متعاقب تیمار با ترکیبات موردمطالعه، به‌کمک آزمون MTT بررسی شد.
به‌منظور انجام آزمون MTT، بعد از 24 ساعت تیمار سلول‌ها با مواد و غلظت‌های موردنظر، محلول 5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر MTT (سینا کلون) در بافر فسفات سالین تهیه و به هر چاهک مقدار 20 میکرولیتر از محلول MTT افزوده شد. میکروپلیت‌ها به‌مدت 5 دقیقه روی شیکر با سرعت 150 دور در دقیقه قرار داده شدند و سپس برای 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با اتمسفر دی‌اکسیدکربن 5 درصد انکوبه شدند. در مرحله بعد، محلول رویی تخلیه شد و مقدار 200 میکرولیتر محلول دی‌متیل سولفوکسید (شرکت سیگما، آلدریچ) به تمامی چاهک‌ها افزوده شد و درنهایت جذب نوری چاهک‌ها در دستگاه خوانشگر الایزا (Stat Fax 4700 ، ساخت آمریکا) در طول موج 570 نانومتر خوانده شد [23]. درآخر، «نیمه حداکثر غلظت بازدارندگی» به کمک نرم‌افزار GraphPad Prism، نسخه 1/0/8 محاسبه شد.
تغییر مقدار گونه‌های فعال اکسیژن درون‌سلولی
به‌منظور اندازه‌گیری نیمه کمی مقدار ROS درون‌سلولی تولیدشده تحت تأثیر تیمار با مواد موردمطالعه، از آزمایش دی‌کلروفلورسئین مطابق با دستورالعمل کیت 2َ-7َ-دی‌کلرو دی‌هیدروفلورسئین دی‌استات (شرکت روشه، آلمان) استفاده شد [24، 25]. به این ترتیب که ابتدا مقدار حدود 104 سلول A2780-CP در میکروپلیت 96خانه‌ای به‌مدت 24 ساعت در حجم 200 میکرولیتر، در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و دی‌اکسیدکربن 5 درصد کشت داده شد. سپس میکروپلیت‌ها از محیط کشت تخلیه شده و سلول‌ها با 100 میکرولیتر غلظت IC50 عصاره آبی برگ گیاه درمنه بیابانی و همچنین داروی سیس‌پلاتین به‌مدت 24 ساعت تیمار شدند. در مرحله بعد، محلول رویی میکروپلیت‌ها تخلیه و سلول‌ها تحت تأثیر محلول 10 میکرومولار دی‌کلروفلوئورسئین دی‌استات تهیه‌شده در محیط کشت قرار گرفتند. این سلول‌ها به‌مدت 30 دقیقه در شرایط تاریکی در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و دی‌اکسیدکربن 5 درصد انکوبه شدند و در آخر، شدت فلورسانس میکروپلیت‌ها با دستگاه خوانشگر فلورسانس (Fluorskan Ascent FL Thermo Fisher) اندازه‌گیری شد. فرمول شماره 1 جهت اندازه‌گیری مقدار درصد ROS تولیدشده در سلول‌های تیمارشده در مقایسه با سلول‌های تیمارنشده (کنترل) استفاده شد [25].
.1
% DCFDA Fluorescence=(Abs test cells/Abs Control cells)
بررسی القای آپوپتوز
وقوع آپوپتوز با استفاده از کیت Annexin V-FITC (شرکت روشه، آلمان) بررسی شد. برای این منظور، میزان القای آپوپتوز در سلول‌های مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP تیمارشده با غلظت IC50 عصاره آبی تهیه‌شده از گیاه درمنه بیابانی و سیس‌پلاتین، مطابق با دستورالعمل کیت با دستگاه فلوسایتومتری (BD FACscan) بررسی شد [26]. تیمار با غلظت IC50 عصاره گیاه درمنه بیابانی و سیس‌پلاتین بر روی تعداد حدود 105سلول مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP انجام گرفت. سلول‌های تیمارنشده A2780-CP به‌عنوان سلول کنترل مورداستفاده قرار گرفتند. همچنین تیمار سلول‌های سالم فیبروبلاست‌های پوست ختنه‌گاه انسان نیز جهت امکان مقایسه تأثیر ترکیبات موردمطالعه، در کنار رده سلولی A2780-CP انجام شد. بعد از گذشت 24 ساعت، نسبت وقوع آپوپتوز به نکروز در سلول‌ها توسط دستگاه فلوسایتومتری (BD FACscan) موردمطالعه قرار گرفت.
بررسی تغییرات چرخه رشد سلول
بررسی چرخه سلولی، به‌کمک روش فلوسایتومتری و رنگ‌آمیزی پروپیدیوم یوداید DNA انجام شد. به این منظور، وقتی تراکم سلول‌ها به میزان حدود 106 رسید با غلظت IC50 عصاره گیاه و سیس‌پلاتین تهیه‌شده مطابق توضیحات پیشین به‌مدت 24 ساعت تیمار شدند و جهت رنگ‌آمیزی با رنگ PI مورداستفاده قرار گرفتند. به این منظور، سلول‌ها ابتدا با محلول PBS دوبار به‌مدت 5 دقیقه (سرعت سانتریفوژ 1200 دور بر دقیقه) شست‌وشو داده شدند. رسوب سلولی با افزودن 4 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد سردشده با یخ فیکس شد. بعد از یک ساعت نگهداری، سلول‌ها دوبار دیگر با محلول PBS شست‌وشو داده شدند و رسوب سلولی با 500 میکرولیتر محلول رنگ PI و 25 میکرولیتر محلول RNase-A به‌مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد و سپس با دستگاه فلوسایتومتری (BD FACscan) موردبررسی قرار گرفت [27].
بررسی بیان ژن‌های مرتبط با آپوپتوز به روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس
حدود 105×2 سلول مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP با غلظت IC50 عصاره گیاه درمنه بیابانی و داروی سیس‌پلاتین به‌مدت 24 ساعت تیمار شدند. استخراج RNA سلول‌های مذکور و ساخت cDNA با استفاده از کیت (سیناژن) و مطابق با دستورالعمل آن انجام شد. پرایمر ژن‌های موردمطالعه شامل ژن‌های آپوپتوتیک CASP3 و CASP9 و BAX و BCL2 و ژن‌های مرتبط با چرخه رشد سلول CCND1 ،CCNB1 و P21 و همچنین ژن مرتبط با فرایند فروپتوز (TFRC) جهت بررسی تغییر میزان بیان گیرنده ترانسفرین موردبررسی قرار گرفت [28، 29].
ژن ACTB به‌عنوان ژن رفرنس مورداستفاده قرار گرفت. جهت آشکار‌سازی شدت فلورسانس از رنگ سایبرگرین (Amplicon) استفاده شد. واکنش PCR با یک میکرولیتر cDNA و 5/0 میکرولیتر پرایمر به غلظت 10 میلی‌مولار، با محلول مسترمیکس (شرکت Bioneer) در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام گرفت. تنظیم برنامه حرارتی به‌ترتیب با 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه، 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 15 ثانیه و 5/55-62 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه در دستگاه ترمو سایکلر (Exicycler) انجام شد [30]. درنهایت، نسبت مقدار بیان ژن‌های مذکور در رده سلولی موردمطالعه (سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP) در مقایسه با سلول‌های تیمارنشده A2780-CP به‌کمک نرم‌افزار GraphPad Prism نسخه 8.0.1 محاسبه شد.
آنالیز آماری
به‌منظور ارزیابی و تحلیل داده‌ها در این مطالعه از نرم‌افزارGraphPad Prism نسخه 8.0.1 استفاده شد. مقدار بیان نسبی ژن‌های انتخابی در رده سلولی موردمطالعه سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین (A2780-CP) در مقایسه با سلول‌های تیمارنشده A2780-CP براساس فرمول 2-∆∆Ct به کمک نرم‌افزار محاسبه شد. بررسی تفاوت آماری بین گروه‌ها با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه و آزمون تعقیبی توکی انجام شد. داده‌ها به‌صورت میانگین±انحراف‌معیار با سطح معنی‌داری 05/0P< ارائه شد. تمام مراحل در سه تکرار جداگانه انجام گرفت.
یافته‌ها
بررسی سمیت سلولی غلظت‌های مختلف عصاره برگ گیاه درمنه بیابانی بر روی رده سلولی A2780-CP
نتایج تیمار رده سلولی موردمطالعه A2780-CP با غلظت‌های مختلف عصاره برگ گیاه درمنه بیابانی، همان‌طور که در تصویر شماره 2 به نمایش درآمده، تأثیر سمیت سلولی وابسته به دُز عصاره را به‌وضوح نشان می‌دهد. در غلظت‌های 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر کاهش معنی‌داری در درصد زیستایی سلول‌های سرطانی مقاوم به سیس‌پلاتین دیده شد (001/0P<؛ 01/0P<؛ 05/0P<). تأثیر عصاره بر روی سلول‌های نرمال HFF بسیار ناچیز بود و تنها در بالاترین غلظت یعنی 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر در حدود 80 درصد زیستایی دیده شد (05/0P<). در بقیه غلظت‌ها، کاهش معنی‌داری در زیستایی سلول‌ها دیده نشد و اثر سمیت سلولی قابل‌توجهی در سلول‌های نرمال نداشت که از مزایای اثرات عصاره گیاهی به شمار می‌رود. درحالی‌که داروی سیس‌پلاتین اثر سمیت قابل‌توجهی در تمامی دُزهای به‌کاررفته نشان داد (001/0P<) (تصویر شماره 3). همچنین نتایج آزمون MTT پس از تیمار سلول‌های A2780-CP و سلول‌های سالم HFF با عصاره گیاه درمنه بیابانی و سیس‌پلاتین در مقابل گروه کنترل مطابق با توضیحات پیشین و محاسبه غلظت IC50، به‌ترتیب نشان داد عصاره آبی برگ گیاه درمنه بیابانی با غلظت 62/112 میکروگرم در میلی‌لیتر توانایی کشتن 50 درصد جمعیت سلول‌های مقاوم به سیس‌پلاتین را دارد، درحالی‌که غلظت 30/412 میکروگرم در میلی‌لیتر از این عصاره برای وقوع همین مقدار درصد بقا در سلول‌های سالم HFF موردنیاز است. همچنین درمورد داروی شیمیایی سیس‌پلاتین غلظت IC50 به مقدار 89/88 میکروگرم در میلی‌لیتر برای رده سلولی A2780-CP و به مقدار 28/26 میکروگرم در میلی‌لیتر برای سلول‌های سالم HFF محاسبه شد.
تغییر مقدار ROS درون‌سلولی
افزایش مقدار ROS درون‌سلولی بیش از حد فیزیولوژیک می‌تواند موجب ایجاد آسیب‌دیدگی پروتئین‌ها، لیپیدها، غشاها و اندامک‌های درون‌سلولی شود که تجمع این آسیب‌ها درنهایت به القای فرایند آپوپتوز منجر می‌شود [31]. چنانچه در تصویر شماره 4 مشخص است، افزایش ROS داخل‌سلولی در رده سلولی موردمطالعه پس از تیمار با عصاره به‌طور معنی‌داری در مقایسه با نمونه کنترل افزایش یافته است (05/0P<).
نتایج بررسی وقوع آپوپتوز در سلول‌های A2780-CP متعاقب تیمار با عصاره آبی برگ گیاه درمنه بیابانی
نتایج بررسی میزان وقوع آپوپتوز و نکروز در رده سلولی موردمطالعه با استفاده از روش رنگ‌آمیزی انکسین/یدید پروپیدیوم در تصویر شماره 5 نشان داده شده است. همان‌طور که مشخص است، درصد سلول‌های A2780-CP تیمارشده با عصاره گیاه درمنه بیابانی که در مراحل اولیه آپوپتوز هستند (Q3=48/8 درصد) در مقایسه با سلول‌های کنترل به‌طور معنی‌داری افزایش یافته است (05/0P<)، ولی درصد وقوع نکروز در سلول‌هایی که در مراحل انتهایی آپوپتوز هستند در این دو گروه تفاوت معنی‌داری نشان نداده است.
بررسی تأثیر عصاره گیاه درمنه بیابانی بر چرخه رشد رده سلولی A2780-CP
نتایج به‌دست‌آمده از بررسی چرخه سلول متعاقب رنگ‌آمیزی هسته سلول‌های تیمارشده با غلظت IC50 عصاره گیاه درمنه بیابانی مطابق تصویر شماره 6 نشان از وقوع آپوپتوز در این سلول‌ها دارد و چنانچه مشخص است، افزایش جمعیت سلولی معنی‌داری (حدود 10 درصد) در مقایسه با سلول‌های تیمارنشده کنترل، در موقعیت Sub G1 مشاهده می‌شود (تصویر شماره 6B) (05/0P<).
تأثیر عصاره گیاه درمنه بیابانی در بیان ژن‌های منتخب آپوپتوز و چرخه سلول
چنانچه اشاره شد، پس از تیمار رده سلولی A2780-CP با غلظت IC50 عصاره گیاه درمنه بیابانی که مقدار آن 62/112 میکروگرم در میلی‌لیتر محاسبه شد، بیان ژن‌های هدف با روشqRT- PCR بررسی شد. همان‌طور که در تصویر شماره 7 مشخص است افزایش بیان ژن‌های BAX ،CASP3 ،CASP9 ،P21 ،TFRC و کاهش بیان ژن‌های CCND1 و CCNB1 نسبت به گروه کنترل معنی‌دار بود (05/0P<)، ولی کاهش بیان ژن‌های BCL2 معنی‌دار نبود.
بحث
ترکیبات به‌دست‌آمده از طیف‌سنجی جرمی کروماتوگرافی گازی عصاره برگ گیاه درمنه بیابانی در مطالعات قبلی گزارش شده است. در بین آن‌ها کافور و 1 و 8 بتا-سینئول به چشم می‌خورند که در گروه مونوترپن‌ها و بتاهیومولین هستند که در گروه سسکوئی‌ترپن‌ها دسته‌بندی می‌شوند [31]. در عین حال چنانچه در نتایج حاصل از تست‌های بررسی القای آپوپتوز و ژن‌های مرتبط با چرخه رشد سلول متعاقب تیمار رده سلولی سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین A2780-CP با غلظت IC50 عصاره آبی برگ گیاه درمنه بیابانی مشخص شده است، جمعیت سلولی قابل‌توجهی در ناحیه Sub G1 در مقایسه با منحنی کنترل به چشم می‌خورد که دلالت بر وقوع آپوپتوز در سلول‌های تیمارشده و توقف چرخه سلولی دارد. افزایش بیان معنی‌دار ژن‌های پروآپوپتوتیک BAX ،P21 و CASP3 و همچنین کاهش معنی‌دار بیان ژنCCNB1 با وقوع آپوپتوز و نتایج چرخه رشد سلول مطابقت دارد. علت یافته‌های مذکور می‌تواند وجود ترکیبات گزارش‌شده ترپنی و آرتمیسینین در عصاره گیاه درمنه بیابانی باشد [19، 32]. ترپنوئیدها بزرگ‌ترین و متنوع‌ترین ترکیبات گیاهی طبیعی هستند. این دسته مسئول تولید رایحه، طعم و رنگدانه‌های گیاهی هستند [33]. طبقه‌بندی آن‌ها براساس تعداد کربن‌هایی است که به‌واسطه واحد‌های ایزوپرن موجود در آن‌ها تشکیل می‌شود. واحد‌های ایزوپرن از اجزای سازنده ترپنوئیدها هستند که هیدروکربن‌های گازی با فرمول‌های مولکولی C5H8 هستند. ترپنوئیدها با مکانیسم‌های متفاوت مولکولی موجب القای تأثیر ضدسرطانی می‌شوند. گروه ترپن‌ها با خصوصیات آنتی‌اکسیدانی خود کاملاًً شناخته‌شده هستند [34-36]. این خصوصیات به‌علت ظرفیت احیاکنندگی این ترکیبات و از علل اصلی کاربرد آن‌ها در حیطه داروهای گیاهی است [34، 36، 37].
به‌طور مثال، تیمول با توقف چرخه سلول در مرحله G0/G1 و دپلاریزه شدن میتوکندری‌ها موجب توقف رشد رده سلولی سرطان حاد پرومیلوسیتی (HL-60) می‌شود. تأثیر کشندگی تیمول با تولید ROS و تخریب غشای میتوکندریایی به‌دنبال آن است. تیمول همچنین می‌تواند باعت افزایش بیان پروتئین BAX و کاهش بیان پروتئین BCL2 شود که متعاقباً به فعال‌سازی کاسپازها و آپوپتوز منجر می‌شود [38].
بتاهیومولین از دیگر ترکیبات گزارش‌شده در این مطالعه بود که در گروه سسکوئی‌ترپن‌ها قرار می‌گیرد [39]. در تأیید تأثیر سلول‌کشی این گروه از ترکیبات آلی می‌توان به مطالعه جیانگ و همکاران اشاره کرد [40]. آن‌ها تأثیر ترکیب مشابهی از گروه سسکوئی‌ترپن‌ها به‌نام بتا-المین را بر روی رده سلولی «سرطان سلول غیرکوچک ریه» انسانی H460 و A549 بررسی کردند. یافته‌های ایشان حاکی از توقف چرخه سلول در مراحل G2/M و S بود. درواقع، مکانیسم مولکولی ضدسرطانی این ماده با کاهش بیان ژن cyclin B1 که موجب کاهش کمپلکس Cdk1 Cyclin B/ و در پی آن توقف چرخه سلول در مرحله G2/M می‌شود گزارش شده است [40].
وانگ و همکاران تأثیر ضدسرطانی آرتسونیت را که در گروه سسکوئی‌ترپن لاکتون‌ها قرار دارد بر روی رده سلولی سرطان کبد H22 گزارش کردند. طبق یافته ایشان، مکانیسم اثر این ماده از طریق تنظیم کاهشی بیان ژن PCNA و BCL2 و تنظیم افزایشی ژن BAX است [41].
ویلوگبای و همکاران در مطالعه خود نشان دادند آرتمیسینین می‌تواند موجب توقف پیشرفت چرخه رشد سلولی سرطان پروستات شود. این امر به‌واسطه ممانعت از بیان ژن CDK4 صورت می‌گیرد [42]. شافی و همکاران در مطالعه‌ای به تأثیر ضدتکثیر عصاره آرتمیسیا آبسینتوم بر سلول‌های سرطانی پستان MCF-7 اشاره کرده و علت آن را محتمل با ایجاد اختلال توسط این عصاره در عملکرد پروتئین Bcl2 دانسته‌اند [43].
سسکوئی‌ترپن لاکتون‌ها گروه دیگری از انواع ترپنوئیدها هستند. آرتسونیت، از دیگر انواع سسکوئی‌ترپن لاکتون‌ها و مشتقی دیگر از گیاه آرتمیسیا، یک داروی ضدمالاریای قوی به شمار می‌رود [44]. آرتسونیت همچنین از طریق پایین آوردن سطح گلوتاتیون و افزایش میزان ROS لیپیدی موجب القای فروپتوز می‌شود [45].
کیم و همکاران نیز جزئی به‌نام LAC117 را از عصاره اتانولی برگ گیاه آرتمیسیا کاپیلاریس جداسازی کرده و تأثیر آن را بر رده‌های سلولی HepG2 و Huh7 کارسینوم کبد مطالعه کردند. نتایج آن‌ها نشان داد این ترکیب با القای آپوپتوز از طریق بالا بردن سطح سیتوکروم C و هیدرولیز پروتئین‌های Caspase3 و پلی (ADP-ریبوز) پلیمراز موجب توقف رشد و تکثیر سلول‌های مذکور می‌شود. همچنین طبق گزارش آن‌ها ماده LAC117 موجب بازدارنگی مسیر PI3K/AKT نیز می‌شود [46].
سو و همکاران تأثیر عصاره برگ آرتمیسیا آرگیی را بر روی رده سلولی سرطان ریه CL1-0 و همچنین رده سلولی مقاوم‌شده آن در برابر داروی جمسیتابین CL1-0-GR بررسی کردند. پیشینه تاریخی کاربرد این گیاه طی دهه‌ها در چین، ژاپن و کره به‌عنوان دارویی جهت درمان بیماری‌های حاد کبدی و کلیوی، آسم، بی‌نظمی عادت ماهیانه، بیماری‌های التهابی، سینوزیت و همچنین سرطان، این محققین را بر آن داشت تا سازوکار مولکولی ضدتوموری این ماده را بررسی کنند. این عصاره باعث بازدارندگی رشد، تجمع، تغییر اپی‌تلیال به مزانشیم و متاستاز هر دو رده سلولی شد. القای آپوپتوز و توقف سیگنال AKT/MAPK در کنار دیگر موارد ذکرشده، این عصاره را انتخاب مناسبی برای توقف تکثیر سلول‌های سرطان ریه معرفی کرده است [47].
رشمه‌زاد و همکاران نیز در مطالعه خود با روشی مشابه، با استفاده از نمک نیترات نقره و گیاه اکالیپتوس اقدام به تهیه نانوذرات نقره کردند و تأثیر وابسته به دُز ترکیب حاصل را بر روی رده سلولی سرطان معده AGS گزارش نمودند [48].
نتیجه‌گیری
با توجه به یافته‌های این مطالعه چنین به نظر می‌آید که ترکیبات ترپنوئیدی موجود در عصاره آبی برگ گیاه درمنه بیابانی با خاصیت القای آپوپتوز می‌تواند بر رده سلولی سرطان تخمدان مقاوم به سیس‌پلاتین در شرایط آزمایشگاهی اثر کشندگی وابسته به دُز معنی‌داری داشته باشد.
امید است با بررسی تأثیر این عصاره در مطالعات آتی بر روی حیوانات آزمایشگاهی (در محیط زنده) و دیگر انواع مطالعات بالینی بتوان از قابلیت بالقوه سلول‌کشی عصاره برگ گیاه درمنه بیابانی در کنترل رشد سلول‌های سرطانی مقاوم به سیس‌پلاتین به‌عنوان یک پتانسیل نویدبخش در درمان مواردی از سرطان تخمدان که به داروی سیس‌پلاتین مقاومت نشان می‌دهند، بهره‌مند شد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه منطبق با اصول اخلاقی با کد IR.IAU.VARAMIN.REC.1399.002 است.
حامی مالی
این مطالعه هیچ‌گونه حمایت مالی از نهادهای دولتی و غیردولتی دریافت نکرده است.
مشارکت نویسندگان
اجرای مراحل عملی مطالعه، کشت سلول و نوشتار متن: سپیده شهریاری؛ طراحی مطالعه و تحلیل داده‌ها: پروین خدارحمی، مسعود شعبان‌زاده و فرزانه تفویضی؛ ویرایش متن: فرزانه تفویضی.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
از مجموعه آزمایشگاهی دانشگاه آزاد اسلامی واحد پرند قدردانی می‌شود.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشي |
موضوع مقاله:
سلولی و مولکولی
دریافت: 1402/4/12 | پذیرش: 1402/5/29 | انتشار: 1403/2/10
دریافت: 1402/4/12 | پذیرش: 1402/5/29 | انتشار: 1403/2/10
فهرست منابع
1. Tran S, DeGiovanni PJ, Piel B, Rai P. Cancer nanomedicine: A review of recent success in drug delivery. Clin Transl Med. 2017; 6(1):44. [DOI:10.1186/s40169-017-0175-0] [PMID] [DOI:10.1186/s40169-017-0175-0]
2. Stewart C, Ralyea C, Lockwood S. Ovarian cancer: An integrated review. Semin Oncol Nurs. 2019; 35(2):151-6. [DOI:10.1016/j.soncn.2019.02.001] [PMID] [DOI:10.1016/j.soncn.2019.02.001]
3. Rezapour A, Nargesi S, Mezginejad F, Rashki Kemmak A, Bagherzadeh R. The economic burden of cancer in Iran during 1995-2019: A systematic review. Iran J Public Health. 2020; 50(1):35-45. [DOI:10.18502/ijph.v50i1.5070] [DOI:10.18502/ijph.v50i1.5070]
4. Siddik ZH. Cisplatin resistance: Molecular basis of multifaceted impediment. In: Teicher BA, editor. Cancer drug discovery and development. New Jersey: Humana Press; 2006. [Link]
5. De Luca A, Parker LJ, Ang WH, Rodolfo C, Gabbarini V, Hancock NC, et al. A structure-based mechanism of cisplatin resistance mediated by glutathione transferase P1-1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019; 116(28):13943-51. [DOI:10.1073/pnas.1903297116] [PMID] [DOI:10.1073/pnas.1903297116]
6. Shen DW, Pouliot LM, Hall MD, Gottesman MM. Cisplatin resistance: A cellular self-defense mechanism resulting from multiple epigenetic and genetic changes. Pharmacol Rev. 2012; 64(3):706-21. [DOI:10.1124/pr.111.005637] [PMID] [DOI:10.1124/pr.111.005637]
7. Zhang Y, Wang X, Han L, Zhou Y, Sun S. Green tea polyphenol EGCG reverse cisplatin resistance of A549/DDP cell line through candidate genes demethylation. Biomed Pharmacother. 2015; 69:285-90. [DOI:10.1016/j.biopha.2014.12.016] [PMID] [DOI:10.1016/j.biopha.2014.12.016]
8. Kartalou M, Essigmann JM. Mechanisms of resistance to cisplatin. Mutat Res. 2001; 478(1-2):23-43. [DOI:10.1016/S0027-5107(01)00141-5] [PMID] [DOI:10.1016/S0027-5107(01)00141-5]
9. Ebrahiminezhad A, Zare-Hoseinabadi A, Sarmah AK, Taghizadeh S, Ghasemi Y, Berenjian A. Plant-mediated synthesis and applications of Iron nanoparticles. Mol Biotechnol. 2018; 60(2):154-68. [DOI:10.1007/s12033-017-0053-4] [PMID] [DOI:10.1007/s12033-017-0053-4]
10. Udalamaththa VL, Jayasinghe CD, Udagama PV. Potential role of herbal remedies in stem cell therapy: Proliferation and differentiation of human mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 2016; 7(1):110. [DOI:10.1186/s13287-016-0366-4] [PMID] [DOI:10.1186/s13287-016-0366-4]
11. Rivera JO, Loya AM, Ceballos R. Use of herbal medicines and implications for conventional drug therapy medical sciences. Altern Integr Med. 2013; 2:130. [Link] [DOI:10.4172/2327-5162.1000130]
12. Konkimalla VB, Efferth T. Evidence-based Chinese medicine for cancer therapy. J Ethnopharmacol. 2008; 116(2):207-10. [DOI:10.1016/j.jep.2007.12.009] [PMID] [DOI:10.1016/j.jep.2007.12.009]
13. Kooti W, Servatyari K, Behzadifar M, Asadi-Samani M, Sadeghi F, Nouri B, et al. Effective medicinal plant in cancer treatment, Part 2: Review study. J Evid Based Complementary Altern Med. 2017; 22(4):982-95. [DOI:10.1177/2156587217696927] [PMID] [DOI:10.1177/2156587217696927]
14. Luo H, Vong CT, Chen H, Gao Y, Lyu P, Qiu L, et al. Naturally occurring anti-cancer compounds: Shining from Chinese herbal medicine. Chin Med. 2019; 14:48. [DOI:10.1186/s13020-019-0270-9] [PMID] [DOI:10.1186/s13020-019-0270-9]
15. Safarzadeh E, Sandoghchian Shotorbani S, Baradaran B. Herbal medicine as inducers of apoptosis in cancer treatment. Adv Pharm Bull. 2014; 4(Suppl 1):421-7. [DOI:10.5681%2Fapb.2014.062] [PMID]
16. Bezabeh T, Mowat MR, Jarolim L, Greenberg AH, Smith IC. Detection of drug-induced apoptosis and necrosis in human cervical carcinoma cells using 1H NMR spectroscopy. Cell Death Differ. 2001; 8(3):219-24. [DOI:10.1038/sj.cdd.4400802] [PMID] [DOI:10.1038/sj.cdd.4400802]
17. Numonov S, Sharopov F, Salimov A, Sukhrobov P, Atolikshoeva S, Safarzoda R, et al. Assessment of artemisinin contents in selected artemisia species from Tajikistan (Central Asia). Medicines (Basel). 2019; 6(1):23. [DOI:10.3390%2Fmedicines6010023] [PMID] [DOI:10.3390/medicines6010023]
18. Efferth T. From ancient herb to modern drug: Artemisia annua and artemisinin for cancer therapy. Semin Cancer Biol. 2017; 46:65-83. [DOI:10.1016/j.semcancer.2017.02.009] [PMID] [DOI:10.1016/j.semcancer.2017.02.009]
19. Konstat-Korzenny E, Ascencio-Aragón JA, Niezen-Lugo S, Vázquez-López R. Artemisinin and its synthetic derivatives as a possible therapy for cancer. Med Sci (Basel). 2018; 6(1):19. [DOI:10.3390%2Fmedsci6010019] [PMID] [DOI:10.3390/medsci6010019]
20. Hajdú Z, Hohmann J, Forgo P, Máthé I, Molnár J, Zupkó I. Antiproliferative activity of artemisia asiatica extract and its constituents on human tumor cell lines. Planta Med. 2014; 80(18):1692-7. [DOI:10.1055/s-0034-1383146] [PMID] [DOI:10.1055/s-0034-1383146]
21. Taghizadeh Rabe SZ, Mahmoudi M, Ahi A, Emami SA. Antiproliferative effects of extracts from Iranian artemisia species on cancer cell lines. Pharm Biol. 2011; 49(9):962-9. [DOI:10.3109/13880209.2011.559251] [PMID] [DOI:10.3109/13880209.2011.559251]
22. Haghighi SM, Tafvizi F, Mirzaie A. Encapsulation of Artemisia scoparia extract in chitosan-myristate nanogel with enhanced cytotoxicity and apoptosis against hepatocellular carcinoma cell line (Huh-7). Ind Crops Prod. 2020; 155(1):112790. [DOI:10.1016/j.indcrop.2020.112790] [DOI:10.1016/j.indcrop.2020.112790]
23. Aslantürk ÖS. In Vitro cytotoxicity and cell viability assays: Principles, advantages, and disadvantages [Internet]. Genotoxicity - A predictable risk to our actual world. London: InTech; 2018. [DOI:10.5772/intechopen.71923] [DOI:10.5772/intechopen.71923]
24. Roesslein M, Hirsch C, Kaiser JP, Krug HF, Wick P. Comparability of in vitro tests for bioactive nanoparticles: A common assay to detect reactive oxygen species as an example. Int J Mol Sci. 2013; 14(12):24320-37. [DOI:10.3390%2Fijms141224320] [PMID] [DOI:10.3390/ijms141224320]
25. Shulaev V, Oliver DJ. Metabolic and proteomic markers for oxidative stress. New tools for reactive oxygen species research. Plant Physiol. 2006; 141(2):367-72. [DOI:10.1104/pp.106.077925] [PMID] [DOI:10.1104/pp.106.077925]
26. Crowley LC, Marfell BJ, Scott AP, Waterhouse NJ. Quantitation of apoptosis and necrosis by annexin V binding, propidium iodide uptake, and flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2016; 2016(11). [DOI:10.1101/pdb.prot087288] [PMID] [DOI:10.1101/pdb.prot087288]
27. Mohammadi Shivyari A, Tafvizi F, Noorbazargan H. Anti-cancer effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles using Artemisia scoparia in Huh-7 liver cancer cells. Inorg Nano-Metal Chem. 2022; 52(3):375-86. [DOI:10.1080/24701556.2021.1980018]
28. Aslany S, Tafvizi F, Naseh V. Characterization and evaluation of cytotoxic and apoptotic effects of green synthesis of silver nanoparticles using artemisia ciniformis on human gastric adenocarcinoma. Mater Today Commun. 2020; 24:101011. [DOI:10.1016/j.mtcomm.2020.101011] [DOI:10.1016/j.mtcomm.2020.101011]
29. Shahriary S, Tafvizi F, Khodarahmi P, Shaabanzadeh M. Phyto-mediated synthesis of CuO nanoparticles using aqueous leaf extract of artemisia deserti and their anticancer effects on A2780-CP cisplatin-resistant ovarian cancer cells. Biomass Convers Biorefinery. 2024; 14(2):2263-79.[DOI:10.1007/s13399-022-02436-x] [DOI:10.1007/s13399-022-02436-x]
30. Fard SE, Tafvizi F, Torbati MB. Silver nanoparticles biosynthesised using centella asiatica leaf extract: Apoptosis induction in MCF-7 breast cancer cell line. IET Nanobiotechnol. 2018; 12(7):994-1002. [DOI:10.1049/iet-nbt.2018.5069] [PMID] [DOI:10.1049/iet-nbt.2018.5069]
31. Redza-Dutordoir M, Averill-Bates DA. Activation of apoptosis signalling pathways by reactive oxygen species. Biochim Biophys Acta. 2016; 1863(12):2977-92. [DOI:10.1016/j.bbamcr.2016.09.012] [PMID] [DOI:10.1016/j.bbamcr.2016.09.012]
32. Basavegowda N, Idhayadhulla A, Lee YR. Preparation of Au and Ag nanoparticles using artemisia annua and their in vitro antibacterial and tyrosinase inhibitory activities. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2014; 43:58-64. [DOI:10.1016/j.msec.2014.06.043] [PMID] [DOI:10.1016/j.msec.2014.06.043]
33. Kamran S, Sinniah A, Abdulghani MAM, Alshawsh MA. Therapeutic potential of certain terpenoids as anticancer agents: A scoping review. Cancers (Basel). 2022; 14(5):1100. [DOI:10.3390/cancers14051100] [PMID] [DOI:10.3390/cancers14051100]
34. Sampath S, Veeramani V, Krishnakumar GS, Sivalingam U, Madurai SL, Chellan R. Evaluation of in vitro anticancer activity of 1,8-Cineole-containing n-hexane extract of callistemon citrinus (curtis) skeels plant and its apoptotic potential. Biomed Pharmacother. 2017; 93:296-307. [DOI:10.1016/j.biopha.2017.06.056] [PMID] [DOI:10.1016/j.biopha.2017.06.056]
35. Grassmann J. Terpenoids as plant antioxidants. Vitam Horm. 2005. [DOI:10.1016/S0083-6729(05)72015-X] [PMID] [DOI:10.1016/S0083-6729(05)72015-X]
36. Abu-Izneid T, Rauf A, Shariati MA, Khalil AA, Imran M, Rebezov M, et al. Sesquiterpenes and their derivatives-natural anticancer compounds: An update. Pharmacol Res. 2020; 161:105165. [DOI:10.1016/j.phrs.2020.105165] [PMID] [DOI:10.1016/j.phrs.2020.105165]
37. Rao VR. Antioxidant agents. In: Penta S, editor. Advances in structure and activity relationship of coumarin derivatives. Amsterdam: Elsevier; 2016. [DOI:10.1016/B978-0-12-803797-3.00007-2] [DOI:10.1016/B978-0-12-803797-3.00007-2]
38. Deb DD, Parimala G, Saravana Devi S, Chakraborty T. Effect of thymol on peripheral blood mononuclear cell PBMC and acute promyelotic cancer cell line HL-60. Chem Biol Interact. 2011; 193(1):97-106. [DOI:10.1016/j.cbi.2011.05.009] [PMID] [DOI:10.1016/j.cbi.2011.05.009]
39. Shahid-Ul-Islam, Rather LJ, Mohammad F. Phytochemistry, biological activities and potential of annatto in natural colorant production for industrial applications - A review. J Adv Res. 2016; 7(3):499-514. [PMID] [DOI:10.1016/j.jare.2015.11.002]
40. Jiang Z, Jacob JA, Loganathachetti DS, Nainangu P, Chen B. β-Elemene: Mechanistic studies on cancer cell interaction and its chemosensitization effect. Front Pharmacol. 2017; 8:105. [DOI:10.3389/fphar.2017.00105] [DOI:10.3389/fphar.2017.00105]
41. Wang Q, Wu LM, Zhao Y, Zhang XL, Wang NP. [The anticancer effect of artesunate and its mechanism (Chinese)]. Yao Xue Xue Bao. 2002; 37(6):477-8. [PMID]
42. Willoughby JA Sr, Sundar SN, Cheung M, Tin AS, Modiano J, Firestone GL. Artemisinin blocks prostate cancer growth and cell cycle progression by disrupting Sp1 interactions with the cyclin-dependent kinase-4 (CDK4) promoter and inhibiting CDK4 gene expression. J Biol Chem. 2009; 284(4):2203-13. [DOI:10.1074/jbc.m804491200] [PMID] [DOI:10.1074/jbc.M804491200]
43. Shafi G, Hasan TN, Syed NA, Al-Hazzani AA, Alshatwi AA, Jyothi A, et al. Artemisia Absinthium (AA): A novel potential complementary and alternative medicine for breast cancer. Mol Biol Rep. 2012; 39(7):7373-9. [DOI:10.1007/s11033-012-1569-0] [PMID] [DOI:10.1007/s11033-012-1569-0]
44. Ivanescu B, Miron A, Corciova A. Sesquiterpene lactones from artemisia genus: Biological activities and methods of analysis. J Anal Methods Chem. 2015; 2015:247685. [DOI:10.1155/2015/247685] [PMID] [DOI:10.1155/2015/247685]
45. Roh JL, Kim EH, Jang H, Shin D. Nrf2 inhibition reverses the resistance of cisplatin-resistant head and neck cancer cells to artesunate-induced ferroptosis. Redox Biol. 2017; 11:254-62. [DOI:10.1016/j.redox.2016.12.010] [PMID] [DOI:10.1016/j.redox.2016.12.010]
46. Kim J, Jung KH, Yan HH, Cheon MJ, Kang S, Jin X, et al. Artemisia Capillaris leaves inhibit cell proliferation and induce apoptosis in hepatocellular carcinoma. BMC Complement Altern Med. 2018; 18(1):147. [DOI:10.1186/s12906-018-2217-6] [PMID] [DOI:10.1186/s12906-018-2217-6]
47. Su SH, Sundhar N, Kuo WW, Lai SC, Kuo CH, Ho TJ, et al. Artemisia argyi extract induces apoptosis in human gemcitabine-resistant lung cancer cells via the PI3K/MAPK signaling pathway. J Ethnopharmacol. 2022; 299:115658. [DOI:10.1016/j.jep.2022.115658] [PMID] [DOI:10.1016/j.jep.2022.115658]
48. Rashmezad MA, Ali Asgary E, Tafvizi F, Sadat Shandiz SA, Mirzaie A. [Comparative study on cytotoxicity effect of biological and commercial synthesized nanosilver on human gastric carcinoma and normal lung fibroblast cell lines (Persian)]. Tehran Univ Med J. 2015; 72(12):799-807. [Link]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
حق تالیف (کپی رایت) برای مولفان محفوظ است.
صاحب امتیاز: دانشگاه علوم پزشکی قم
ناشر: انتشارات دانشگاه علوم پزشکی قم
شاپا چاپی: 7799-1375
شاپا الکترونیک: 1375-2008
ایمیل مجله: journal@muq.ac.ir
j.muq.ac@gmail.com
